Tierärztliche Hochschule Hannover - TiHo Bibliothek elib

erhöhte Salzkonzentration sollte den Wascheffekt verstärken. Alle folgenden Schritte wurden
mit möglichst wenig Lichteinfluss ausgeführt um die photosenitiven Sekundärantikörper nicht
auszubleichen. Die Sekundärantikörper wurden 1:450 verdünnt eingesetzt und für 1 Stunde
mit den Zellen inkubiert. Die DNA der Zellkerne wurde für 15 Sekunden mit DAPI (0,5
µg/ml in PBS) gefärbt. Abschließend wurden die Präparate mehrfach mit PBS gewaschen, die
Deckgläschen mit den Zellen nach unten in einen Tropfen Glycerin auf einen Objektträger
gelegt und zur mittelfristigen Konservierung mit Nagellack umrandet.
4.7.3 Methoden zur Verringerung der Eigenfluoreszenz von Pankreasgewebeproben
Da Eigenfluoreszenz die Auswertung von fluoreszenzmarkierten Pankreasgewebeproben
erschwert oder sogar unmöglich macht, wurden einige in Literatur beschriebene Verfahren
zur Unterdrückung der Eigenfluoreszenz durchgeführt.
Kupfersulfat-Behandlung
Kupfer-II-sulfat in Konzentrationen von 10 bis 100 mM wurde in Anlehnung an Schnell
(Schnell 1999) in Ammoniumazetat gelöst. Die Präparate wurden nach dem Demaskieren für
60-90 Minuten im Dunkeln mit der hergestellten Lösung inkubiert und anschließend
mehrfach in BPS gewaschen. Jetzt wurde die Immunfluoreszenz-Markierung wie beschrieben
durchgeführt.
Toluidin Blau-Behandlung
Die Präparate wurden nach dem Entparaffinieren für 8 Stunden in 0,1% Toluidin Blau 0 (m/v)
in 70% Isopropylalkohol gefärbt, dann kurz in 70%igem Isopropylalkohol gewaschen und in
PBS überführt. Anschließend wurden die Gewebeproben demaskiert und es fand wie
beschrieben die Fluoreszenzmarkierung statt.
Sudan Schwarz B-Behandlung
In Anlehnung an Schnell (Schnell 1999) wurde Sudan Schwarz in Konzentrationen von 0,1%
bis 10% (m/v) in 70% Ethanol für 5 Minuten im Anschluss an die
Immunfluoreszenzmarkierung durchgeführt. Überschüssiges Sudan Schwarz wurde in
70%igem Ethanol abgewaschen. Weiterhin wurde ein Protokoll von Viegas (Viegas 2007)
verwendet. Hier wurden die Präparate nach dem Demaskieren für 20 Minuten in 0,1% (m/v)
Sudan Schwarz in 70% Ethanol inkubiert. Die spezifische Fluoreszenzmarkierung wurde in
verschiedenen Versuchen vor und nach Sudan Schwarz Behandlung durchgeführt.
UV-Bestrahlung
Vor dem Entparaffinieren wurden die Gewebeproben für 2 Stunden mit einem 302 nm UV-
Transilluminator im Abstand von 4 mm zur Lichtquelle bestrahlt, anschließend wie
beschrieben entparaffiniert, demaskiert und fluoreszenzmarkiert.
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