Tierärztliche Hochschule Hannover - TiHo Bibliothek elib

Sekundärantikörpern inkubiert. Diese Sekundärantikörper wurden 1:500 in PBS verdünnt
angewendet und waren mit einem Fluorophor gekoppelt, das Licht einer definierten
Wellenlänge emittiert, wenn es angeregt wird. Jede Anwendung dieser lichtsensitiven
Materialen fand mit möglichst wenig Lichteinfluss statt. Der sekundäre Antikörper wurde 1
Stunde mit Gewebe oder Zellen inkubiert. Optional fand eine Färbung der Zellkerne mit
DAPI statt. DAPI ist ein fluoreszierender Stoff, der an DNA bindet. Er wurde in einer
Konzentration von 0,0025% in PBS für 15 Sekunden eingesetzt. Jetzt wurden die Präparate 6-
mal für 5 Minuten mit PBS gewaschen und im Dunkeln bei 4°C aufbewahrt. Alle
hergestellten Antikörperverdünnungen wurden vor Gebrauch bei 10000 x g und 4°C
zentrifugiert und der Überstand wurde weiterverwendet.
Bei Verwendung von 2 Primärantikörpern zur Ko-Lokalisation zweier Proteine musste darauf
geachtet werden, dass die primären Antikörper von verschiedenen Spezies stammen. Der
Sekundärantikörper musste der jeweiligen Spezies des Primärantikörpers entsprechen. Bei
Verwendung von 2 Sekundärantikörpern mussten diese mit unterschiedlen Fluorophoren
konjugiert sein. Die beiden Primär- und Sekundärantikörper wurden zusammen in einer
Lösung mit den Präparaten wie oben angegeben inkubiert.
4.7.1 Mikroskopie und Bilderstellung
Die Präparate wurden mit einem Olympus BX-41 Mikroskop (Olympus Deutschland,
Hamburg), ausgestattet für Fluoreszenzmikroskopie und digitale Bilderstellung
mikroskopiert. Die Bilder wurden mit einer Olympus Digitalkamera (Olympus U TV1X-2
CC) aufgenommen und mit der Cell^F Imaging-Software (Olympus Deutschland, Hamburg)
bearbeitet. Die verwendeten Filter und Wellenlängen sind der Tabelle (Tab. 1) zu entnehmen.
Die Einstellungen für Belichtungszeit, Kontrast, Helligkeit und Blende waren bei Bildern
eines Versuchsansatzes identisch. Ausnahmen hiervon sind in den Abbildungen angegeben.
Aus Gründen einer verbesserten Darstellbarkeit in der Abbildung sind einige Bilder bezüglich
Helligkeit mit Cell^F bearbeitet worden. Die Helligkeit wurde linear und in allen Bildern
eines Versuchsansatzes identisch bearbeitet.
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