Tierärztliche Hochschule Hannover - TiHo Bibliothek elib

Immunpräzipitations-Versuch gewählt um die Funktionsfähigkeit und Spezifität der
Antikörper zu testen. Es wurde die gleiche Menge an Antigen und Antikörper eingesetzt. Nur
dann ist ein maximales Präzipitationsergebnis zu erwarten, wenn die bivalenten Antikörper
mit ihren zwei Fab-Fragmenten zwei verschiedene Reg3A Proteine binden und darüber
wiederum mit anderen Antikörpern quervernetzt werden (Cross-Linking). Liegt hingegen
Antigenüberschuss vor, binden beide Fab-Teile eines Antikörpers nur je ein Reg3A Protein,
es kommt nicht zur Quervernetzung der Antikörper und demnach auch nicht zu Präzipitation.
Ein Antikörperüberschuss führt zur Bindung mehrerer Antikörper an ein Reg3A, verhindert
ebenfalls die Quervernetzung und somit die Präzipitation (Tizard 2010). Mittels Bradford-
Test wurde die Proteinkonzentration der Antikörper- und Antigenlösung gemessen und
anschließend die Menge an spezifischem IgY geschätzt.
Reg3A-Protein ist in 0,5 M Citratpuffer pH 4 stabil in Lösung zu halten. Für die Präzipitation
wurde eine Endkonzentration von 0,5 M Citrat, 1 M Tris pH 7-7,5 eingestellt, ohne dass
sichtbar Protein ausgefallen ist. Protein und Antiköperlösung wurden 3 h bei Raumtemperatur
inkubiert. Nach 3 Stunden hatte sich ein kleines Pellet gebildet. Der Ansatz wurde 40 Minuten
bei 4 °C und 1500 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde kurzfristig bei 4 °C aufbewahrt. Um
eine Wechselwirkung des Citrats mit den Antikörpern auszuschließen wurde eine Kontroll-
Antikörperlösung mit 0,5 M Citrat, 1 M Tris pH 7-7.5 hergestellt und eingesetzt wie die
Präzipitationslösung.
Reg3A Protein wurde mittels Western-Blot auf Zellulosemembranen übertragen und diese
dann mit der Präzipitationslösung sowie der Kontrolllösung inkubiert und die Filmfolien
anschließend entwickelt.
4.7 Immunfluoreszenzmarkierung
Ziel der Immunfluoreszenzmarkierung von Pankreasgewebeproben, Pankreastumorzellen und
Leukozyten war es, die Expression von S100A8/A9 und Reg3A Proteine in Geweben und
Zellen nachzuweisen und zu lokalisieren.
Für die Markierung der Proteine wurden sowohl die isolierten Hühnerantikörper als auch
Antikörper, die gegen andere Proteinsequenzen gerichtet sind, eingesetzt. Vor der Inkubation
mit primären, gegen das Zielprotein gerichteten Antikörpern, wurden die Gewebeschnitte und
Zellen mit 5% bovinem Serumalbumin oder 0,5% Fischgelatine in PBS für 30 bis 60 Minuten
geblockt, um unspezifische Proteinbindungen von Antikörpern an das Zielgewebe/ die Zellen
zu verhindern. Der primäre Antikörper wurde nach Angaben des Herstellers von 1:10 bis
1:100 verdünnt in PBS mit 1% BSA angewendet. Die Hühnerantikörper wurden 1:500 in PBS
verdünnt eingesetzt. Alle Gewebe und Zellen wurden 1 Stunde mit den Primärantikörpern
inkubiert und anschließend 6-mal für 5 Minuten mit PBS gewaschen. Wiederum wurde wie
oben beschrieben mit BSA oder Fischgelatine für 30 Minuten geblockt und anschließend
wurden die Präparate mit gegen die Spezies des Primärantiköpers gerichteten
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