Tierärztliche Hochschule Hannover - TiHo Bibliothek elib

Gemisch verdünnt, so dass eine Endkonzentration von 8% PEG in der Gesamtlösung erreicht
wurde. Der Ansatz wurde für 30 Minuten auf Eis inkubiert, dann 15 Minuten bei
Raumtemperatur ruhen gelassen, und schließend bei Raumtemperatur für 30 Minuten bei
11000 x g (Sorvall Zentrifuge siehe oben) zentrifugiert. Es bildeten sich Protein-Präzipitate.
Der PEG-Überstand wurde abgegossen und die Präzipitate bei Raumtemperatur in PBS
gelöst. Die Lösung wurde mit Thiomerosal (0,02% Endkonzentration) haltbar gemacht und
steril gefiltert (0,022 µm Filterporendurchmesser). Vor- bzw. nach jedem Arbeitsschritt
wurden Proben der Lösungen entnommen und zur Kontrolle der Arbeitsschritte auf ein 8%
SDS-Gel aufgetragen (Abb. 1).
Die Proteinkonzentration der Antikörperlösung wurde mittels Bradford-Test bestimmt. Die
Menge an spezifischen, gegen die gewünschte Peptidsequenz gerichteten IgY Antikörper
kann geschätzt werden. Die IgY Konzentration im Ei beträgt ca. 25-30 mg/ml. Die Menge an
spezifischem IgY beträgt abhängig vom Legezeitraum während der Immunisierung und
Boosterung 1- 10% der Gesamt IgY (EuroGentec).
4.6.3 Spezifizieren der S100A8/A9 Antikörper durch Kopplung an Matrixkügelchen
In diesem Versuch sollte geklärt werden, ob im Hühnerei Antikörper vorhanden sind, die
humanes S100A8/A9 erkennen.
Die Hühner wurden mit einer Peptidsequenz des humanen S100A9 Proteins immunisiert. Der
entstandene Antiköper soll sowohl das S100A9 Protein allein als auch den S100A8/A9
Proteinkomplex erkennen. Aufgrund der oben genannten tierklassenspezifischen
Eigenschaften des IgY Antikörpers kann dieser nicht unter Verwendung von Protein A oder G
aufgereinigt werden. Protein A bindet vor allem IgG über den Fc-Teil des Antikörpers. Auf
Grund des Fehlens dieser Domäne bei einigen IgY und auf Grund struktureller Unterschiede
der schweren Proteinketten von IgG und IgY binden Protein A und G nicht an IgY des Huhns.
Für die Bindung von IgY stehen andere Harze (Matrices) zur Verfügung, die zur Kopplung
von Proteinen im Allgemeinen geeignet und somit nicht auf eine Fc-Region angewiesen sind.
Die in diesem Versuch verwendete Matrix enthält einen Lakton-Ring, der sich in basischem
Milieu bei Annährung von nukleophilen Reaktionsgruppen wie zum Beispiel der
Aminogruppe von Aminosäuren öffnet und diese kovalent bindet. Alle Untereinheiten und
Ketten des IgY Antikörper können also stabil an die Matrix gebunden werden. Da diese
Reaktion nicht nur mit Antikörpern abläuft können auch andere Proteine an die Matrix
gebunden werden. Ebenso muss damit gerechnet werden, dass der Antikörper mit dem Fab-
Fragment an die Matrix gebunden wird und die Bindungsstelle für den S100A8/A9 Komplex
somit belegt ist. Das Ergebnis der Kupplungsreaktion ist also weniger spezifisch und weniger
vorhersehbar als es bei IgG und Protein A/G Reaktionen der Fall ist.
Zuerst wurden die Proteinkonzentration der Antikörperlösung und die
Proteinbindungskapazität der Lakton-Matrix angeglichen. Die Antikörper wurden in einen
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