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2010). Einer Subklasse dieser IgY Antikörper fehlt außerdem eine Fc-Region. Ein Fehlen
dieser Fc- und der Hinge-Region des IgY weist nicht nur auf große Unterschiede innerhalb
der Signalvermittlung des Vogelimmunsystems hin, sondern bringt auch Probleme bei der
Aufreinigung und Verarbeitung der IgY Antikörper zu Forschungszwecken mit sich. Das IgY
Molekül ist im Ganzen ca. 180 kDa schwer, auf die leichten Ketten entfallen dabei 22-35
kDa, auf die schweren Ketten ca. 67-70 kDa (Tizard 2010). Damit sind Hühner-IgY schwerer
als IgG der Säugetiere. Die Antikörperherstellung im Huhn erfolgte durch die Firma
EuroGentec. In E. coli exprimierte und aufgereinigte Proteinsequenzen des S100A9 und des
Reg3A Proteins wurden dort unter spezifischpathogenfreien Bedingungen den bereits
eierlegenden Hühnern an Tag 0, 14, 28 und 56 des Herstellungsprogramms injiziert. Die Tiere
erzeugen daraufhin IgY Antikörper gegen diese Proteine, welche in Menge und Spezifität mit
jeder erneuten Injektion (Boosterung) zunehmen. Hohe Konzentrationen dieser Antikörper
werden von der Henne ins Eiweiß des Hühnereis sezerniert. Die hohe Konzentration von
Antikörpern und anderen Abwehrstoffen im Eiweiß erklärt die ausgesprochen lange
Haltbarkeit von Hühnereiern. Die Gewinnung der Antikörper kann also ohne invasive
Blutentnahmen durch Sammeln der Eier und anschließende Isolation der Antikörper erfolgen.
Die Eier eines immunisierten Huhnes wurden an Tag 0, 38 bis 52 und 66 bis 94 gesammelt
und von den Schalen befreit als Eigelb/ Eiweiß -Gemisch ins Labor gesendet.
4.6.2 Separation von Hühnerantikörpern aus dem Ei
Die Gemische aus Eiweiß und Eigelb waren mit Nummern gekennzeichnet, so dass jede
Probe einem Huhn und einem Legedatum zugeordnet werden konnte.
Zunächst wurde das Volumen des Eigelb/ Eiweiß-Gemisch bestimmt und mit doppelter
Menge an PBS (1:2) verdünnt, in ein Becherglas überführt und anschließend für 3 Minuten
bei Raumtemperatur grob vermengt. Das Gemisch wurde dann mittels Magnetrührer
vorsichtig für weitere 10 Minuten zu einer homogenen Lösung vermengt, wobei
Schaumbildung und Erhitzung zu vermeiden ist.
Unter dem Gasabzug wurde zu diesem Ei-PBS-Gemisch in einem Messzylinder Chloroform
im Verhältnis 1:1 zugegeben und für 30 Minuten abgedeckt mit einem Magnetrührer
vermischt. Dann wurde bei 4°C und 16500 x g mit einem Ausschwingrotor zentrifugiert.
Durch die Zentrifugation entsteht eine Phasentrennung. In der oberen wässrigen Phase sind
Proteine, unter anderem die Antikörper, gelöst. In der mittleren Phase befinden sich
chloroformunlösliche Fette des Eigelbs, in der unteren Phase sind chloroformlösliche
Bestandteile enthalten, zum Beispiel Lecithine.
Die wässrige Phase wurde abpipettiert, wiederum 1:1 mit Chloroform versetzt und nochmals
wie oben angegeben zentrifugiert. Die im klaren Überstand gelösten Proteine wurden nun
mittels PEG aus der Lösung gefällt. Die wässrige Lösung wurde mit einem PEG-PBS-
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