Tierärztliche Hochschule Hannover - TiHo Bibliothek elib

Überstand wurde verworfen. Dieser Schritt wurde so oft wiederholt bis keine Lyse der
Erythrozyten mehr zu beobachten war und sich nach Zentrifugieren ein kleines Erythrozyten-
Granulozytenpellet gebildet hat. Dieses Pellet wurde in 5 ml isotonischer Kochsalzlösung
aufgenommen. Die Erythrozytenlyse war nicht vollständig, es verblieben immer noch Reste
roter Blutkörperchen im Granulozytenpellet, welche sich bei der späteren Immunfluoreszenz
als äußert störend erwiesen, jedoch führte der Einsatz von stärker lysierenden Puffern auch
zur Zerstörung der Granulozyten.
Um die verbliebenen Erythrozyten von den Granulozyten zu trennen, wurden 5 ml Percoll ®
Lösung mit einer Dichte von 1,095 g/ml in einem Gefäß vorgelegt und die Erythrozyten-
Granulozytenlösung vorsichtig bei RT aufgeschichtet. Der Ansatz wurde bei RT für 60
Minuten bei 800 x g zentrifugiert. Es ergab sich folgende Schichtung: ein Überstand, eine
Schicht aus Granulozyten, eine Percoll ® Schicht und ein Erythrozytenpellet. Die Schichten
wurden getrennt, die Granulozytenschicht in PBS aufgenommen und zentrifugiert. Das Pellet
wurde in 1 ml PBS aufgenommen und bis zu Weiterverarbeitung bei 4 °C aufbewahrt.
Zur Ergebniskontrolle wurde von jeder Bande 10 µl Zellsuspension abgenommen, auf einem
Objektträger nach der Blutausstrich-Methode ausgestrichen und mit May-Grünewald-Giemsa
Lösung gefärbt (Jacobsson 1996).
Zur Fixierung wurden die Zellsuspensionen auf Deckgläschen in 12-Loch-Platten gegeben
und über Nacht bei 4°C ruhen gelassen. Dann wurde die PBS abgesaugt und je Loch 1 ml 4%
Formaldehyd, 120 mM Dinatriumhydrogenphosphat pH 8 zugegeben und für 20 Minuten bei
RT und 10 Minuten bei 4°C fixiert. Alternativ wurden die Zellen für 15 Minuten bei RT mit
reinem Methanol anstelle der Formaldehydlösung fixiert. Die Fixierlösung wurde abgesaugt
und die fixierten Zellen auf den Deckgläschen 3-mal mit BPS gewaschen. Letztlich wurden
die Zellen in PBS 0,1% Acid konserviert.
4.6 Antikörperpräparation
4.6.1 Prinzip der Gewinnung von Antikörpern in Hühnern
Die Immunisierung von Vögeln zur Gewinnung spezifischer Antikörper hat auf Grund
evolutionsbiologisch geringer Verwandtschaft dieser Tierklasse besonders für die weitere
Verwendung dieser Antiköper an Säugerpräparaten große Vorteile. Man erhofft sich
möglichst wenige Kreuzreaktionen der im Vogel gewonnenen Antikörper gegen Proteine der
zu untersuchenden Säugerspezies. Vögel produzieren keine Immunglobuline der Klasse IgG,
IgD und IgE. Analog zum Säuger IgG, das durch wiederholte Boosterung im Serum immer
zahlreicher und spezifischer wird, produziert der Vogel das Immunglobulin Y. Allen IgY
Antikörpern ist das Fehlen der Hinge-Region (dt. = Brückenregion) gemeinsam, was sie
unflexibler und anfällig für die Bildung von Präzipitaten und Agglutinationen macht (Tizard
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