Tierärztliche Hochschule Hannover - TiHo Bibliothek elib

Meerrettichperoxidase-gekoppelter
Schafantikörper gegen Mäuse IgG
Meerrettichperoxidase-gekoppelter
Ziegenantikörper gegen Hühner IgY
1:10000
1:10000
4.4.6 Einfrieren und Lagern von Zellen
Wurden die Zellen einer Linie für weiter Versuche nicht mehr benötigt, wurden sie mit
Trypsin-EDTA von der Zellkulturschale gelöst, in Medium aufgenommen und bei 300 x g für
5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen und anschließend 10 ml fetales
Kälberserum mit 10% DMSO auf das Zellpellet gegeben und vorsichtig resuspendiert. Es
wurden Aliquotes zu je 1 ml in Kryogefäßen angefertigt und diese in einem Isopropanolbad
bei -80°C über Nacht eingefroren. Zur langfristigen Konservierung wurden die Zellen bei -
150°C tiefgefroren.
4.5 Isolierung von Leukozyten aus dem Blut durch Dichtegradientenzentrifugation
Für die Detektion von S100A8/A9 Protein in Leukozyten mittels Immunfluoreszenz sollen
Lymphozyten, Monozyten und neutrophile Granulozyten aus dem peripheren Blut isoliert und
angereichert werden. Für die Herstellung von Dichtegradienten wurden spezielle isotone
Percoll ® und Biocoll ® -Lösungen verwendet. 18 ml EDTA Blut wurde aus einer peripheren
Vene in der Ellbogengelenksbeuge steril entnommen. 10 ml zimmerwarme Biocoll ® Lösung
mit einer Dichte von 1,077 g/ml wurde in ein 50 ml Polypropylengefäß gegeben. Vorsichtig
wurden 18 ml EDTA-Vollblut auf die Lösung geschichtet und in einer Zentrifuge mit
Ausschwingrotor ohne Bremse bei 1200 x g, RT, 50 Minuten zentrifugiert.
Es ergaben sich 4 Schichten. Eine obere Plasmaschicht beinhaltete Thrombozyten, eine Bande
zwischen der Plasmaschicht und der daruntergelegenen Biocoll-Schicht beinhaltete
Lymphozyten, Monozyten und Reste der Thrombozyten. Unter dieser Bande blieb eine breite
Biocoll-Schicht bestehen. Am Boden des Gefäßes sammelten sich Erythrozyten und
Granulozyten. Die Schichten wurden vorsichtig abgenommen und getrennt. Die
Lymphozyten-Monozytenschicht wurde in 50 ml PBS aufgenommen, bei 1200 x g 15
Minuten zentrifugiert, der Überstand abgenommen, das Pellet in 2 ml PBS resuspendiert und
bei 4°C bis zur Weiterverarbeitung und Fixierung aufbewahrt. Zu der Erythrozyten-
Granulozytenschicht wurde jetzt 50 ml des Ammoniumchlorid enthaltenden Erythrozyten-
Lysepuffers (siehe Puffer und Gele) gegeben und die Suspension 5 Minuten bei RT inkubiert.
Anschließend wurde der Ansatz für 10 Minuten bei 1200 x g bei RT zentrifugiert, der rote
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