Tierärztliche Hochschule Hannover - TiHo Bibliothek elib
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Die Zellen wurden für weitere Versuche erst verwendet, wenn sie gleichmäßig gewachsen waren und mindestens 5 Kulturpassagen durchlaufen haben. 4.4.4 Herstellen von Zelllysaten Das Medium der zu einem möglichst dichten Zellrasen gewachsenen Zelllinien wurde abgesaugt, die Zellen 3-mal mit eiskaltem PBS gewaschen und anschließend mit Lysepuffer bedeckt und 10 Minuten auf Eis inkubiert. Zur Zelllyse wurde in Anlehnung an einen RIPA-Puffer folgender Lysepuffer verwendet: 145 mM NaCl 5 mM KCl 50 mM Tris HCl pH 7,5 1% Triton X 100 50 mM EDTA 100 mM NaF 1mM Pefablock 2 x Complete Proteasehemmer 0,02% Trypsininhibitor RIPA Puffer wurden ursprünglich zur schonenden Zelllyse für Radio-Immuno-Präzipitations- Assays verwendet. Die Proteasehemmer, Pefablock, Complete-Proteasehemmer und Trypsin- Inhibitor wurden stets zum fertigen Puffer frisch zugegeben. Sie wurden durchgehend eisgekühlt. Nach 10-minütiger Inkubation des Lysepuffers auf Eis wurden die Zellen mit einem sterilen Gummischaber von der Petrischale gestrichen, in ein Kryogefäß überführt, bei -80°C schockgefroren und anschließend auf Eis langsam wieder aufgetaut. Das Schockgefrieren sollte den Lyseprozess unterstützen. Die aufgetauten Proben wurden dann für weitere Versuche in kleinen Aliquotes bei -40°C im Lysepuffer eingefroren oder für den Western-Blot im Verhältnis 1:4 mit 4-fach Laemmlipuffer mit ß-Mercaptoethanol für 3 Minuten gekocht und dann bei -20°C eingefroren. 38
4.4.5 Qualitative Proteinanalyse von Zelllysaten Vor Auftrag der Zelllysate auf Gele wurde die Proteinkonzentration der Proben mittels Bradford-Test bestimmt und die aufgetragene Proteinmenge durch Probenverdünnung in etwa angeglichen. Bei einigen Lysaten mit sehr geringen Proteinkonzentrationen wurde die maximale Proteinmenge aufgetragen. Ein quantitativer Vergleich ist daher nicht in jedem Fall möglich gewesen. 10µl Zelllysat wurden mit 5µl Lysepuffer und 5µl 4-fach Probenauftragspuffer vermischt, kurz aufgekocht und dann auf die Gele aufgetragen. Bei proteinarmen Zelllysaten wurden 15µl Lysat mit 5µl 4-fach Probeauftragspuffer auf das Gel gegeben, hoch konzentrierte Lysate wurden 1:2 mit Lysepuffer verdünnt (CAPAN1 und PaTu-8988 S). Für die Detektion von S100A8/A9 Protein wurden 16% Schägger-Gele verwendet, für Reg3A sowie die GAPDH-Kontrollen kamen 14% Laemmli-Gele zum Einsatz. Die detaillierte Zusammensetzung der Gele und Puffer ist im Kapitel Material, Puffer und SDS-Gele aufgeführt. Der Ablauf von Elektrophorese und Western-Blot ist im Kapitel Methoden genau beschrieben. Nach der Elektrophorese wurde ein Gel jedes Versuchs nach Coomassie gefärbt, um den Proteinauftrag und die Proteinauftrennung zu kontrollieren. Als Kontrollenzym für die Herstellung der Zelllysate und für eine gleichmäßige Übertragung der Proteine auf die Nitrozellulose-Membran wurde das GAPDH-Enzym im Immunoblot detektiert. Die Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase ist ein Enzym, das bei der Glykolyse die Umwandlung von Glycerinaldehyd-3-Phophat zu 1,3-Bisphosphoglycerat (Oxidation des Aldehyds ohne Energieverlust) katalysiert und daher in Säugerzellen unentbehrlich ist. Eine Nitrozellulosemembran jedes Versuchs wurde ohne Primärantikörper nur mit dem Sekundärantikörper inkubiert, um ein falschpositives Signal auszuschließen. Die Antikörper wurden im Immunoblot in folgenden Verdünnungen eingesetzt: Antikörperbezeichnung Verdünnung Calgranulin A (S100A8) 1:500 Calgranulin B (S100A9) 1:500 Calgranulin A/B (S100A8/A9) 1:500 P0301501 (S100A9) 1:15000 P0841202 (Reg3A) 1:15000 GAPDH 1:2500 RegIIIα/γ 1:500 Meerrettichperoxidase-gekoppelter Eselantikörper gegen Kaninchen IgG 1:10000 39
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4.4.5 Qualitative Proteinanalyse von Zelllysaten<br />
Vor Auftrag der Zelllysate auf Gele wurde die Proteinkonzentration der Proben mittels<br />
Bradford-Test bestimmt und die aufgetragene Proteinmenge durch Probenverdünnung in etwa<br />
angeglichen. Bei einigen Lysaten mit sehr geringen Proteinkonzentrationen wurde die<br />
maximale Proteinmenge aufgetragen. Ein quantitativer Vergleich ist daher nicht in jedem Fall<br />
möglich gewesen. 10µl Zelllysat wurden mit 5µl Lysepuffer und 5µl 4-fach<br />
Probenauftragspuffer vermischt, kurz aufgekocht und dann auf die Gele aufgetragen. Bei<br />
proteinarmen Zelllysaten wurden 15µl Lysat mit 5µl 4-fach Probeauftragspuffer auf das Gel<br />
gegeben, hoch konzentrierte Lysate wurden 1:2 mit Lysepuffer verdünnt (CAPAN1 und<br />
PaTu-8988 S). Für die Detektion von S100A8/A9 Protein wurden 16% Schägger-Gele<br />
verwendet, für Reg3A sowie die GAPDH-Kontrollen kamen 14% Laemmli-Gele zum<br />
Einsatz. Die detaillierte Zusammensetzung der Gele und Puffer ist im Kapitel Material, Puffer<br />
und SDS-Gele aufgeführt. Der Ablauf von Elektrophorese und Western-Blot ist im Kapitel<br />
Methoden genau beschrieben. Nach der Elektrophorese wurde ein Gel jedes Versuchs nach<br />
Coomassie gefärbt, um den Proteinauftrag und die Proteinauftrennung zu kontrollieren. Als<br />
Kontrollenzym für die Herstellung der Zelllysate und für eine gleichmäßige Übertragung der<br />
Proteine auf die Nitrozellulose-Membran wurde das GAPDH-Enzym im Immunoblot<br />
detektiert. Die Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase ist ein Enzym, das bei der<br />
Glykolyse die Umwandlung von Glycerinaldehyd-3-Phophat zu 1,3-Bisphosphoglycerat<br />
(Oxidation des Aldehyds ohne Energieverlust) katalysiert und daher in Säugerzellen<br />
unentbehrlich ist. Eine Nitrozellulosemembran jedes Versuchs wurde ohne Primärantikörper<br />
nur mit dem Sekundärantikörper inkubiert, um ein falschpositives Signal auszuschließen.<br />
Die Antikörper wurden im Immunoblot in folgenden Verdünnungen eingesetzt:<br />
Antikörperbezeichnung<br />
Verdünnung<br />
Calgranulin A (S100A8) 1:500<br />
Calgranulin B (S100A9) 1:500<br />
Calgranulin A/B (S100A8/A9) 1:500<br />
P0301501 (S100A9) 1:15000<br />
P0841202 (Reg3A) 1:15000<br />
GAPDH 1:2500<br />
RegIIIα/γ 1:500<br />
Meerrettichperoxidase-gekoppelter<br />
Eselantikörper gegen Kaninchen IgG<br />
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