Tierärztliche Hochschule Hannover - TiHo Bibliothek elib

Die Zellen wurden für weitere Versuche erst verwendet, wenn sie gleichmäßig gewachsen
waren und mindestens 5 Kulturpassagen durchlaufen haben.
4.4.4 Herstellen von Zelllysaten
Das Medium der zu einem möglichst dichten Zellrasen gewachsenen Zelllinien wurde
abgesaugt, die Zellen 3-mal mit eiskaltem PBS gewaschen und anschließend mit Lysepuffer
bedeckt und 10 Minuten auf Eis inkubiert.
Zur Zelllyse wurde in Anlehnung an einen RIPA-Puffer folgender Lysepuffer verwendet:
145 mM NaCl
5 mM KCl
50 mM Tris HCl pH 7,5
1% Triton X 100
50 mM EDTA
100 mM NaF
1mM Pefablock
2 x Complete Proteasehemmer
0,02% Trypsininhibitor
RIPA Puffer wurden ursprünglich zur schonenden Zelllyse für Radio-Immuno-Präzipitations-
Assays verwendet. Die Proteasehemmer, Pefablock, Complete-Proteasehemmer und Trypsin-
Inhibitor wurden stets zum fertigen Puffer frisch zugegeben. Sie wurden durchgehend
eisgekühlt. Nach 10-minütiger Inkubation des Lysepuffers auf Eis wurden die Zellen mit
einem sterilen Gummischaber von der Petrischale gestrichen, in ein Kryogefäß überführt, bei
-80°C schockgefroren und anschließend auf Eis langsam wieder aufgetaut. Das
Schockgefrieren sollte den Lyseprozess unterstützen.
Die aufgetauten Proben wurden dann für weitere Versuche in kleinen Aliquotes bei -40°C im
Lysepuffer eingefroren oder für den Western-Blot im Verhältnis 1:4 mit 4-fach
Laemmlipuffer mit ß-Mercaptoethanol für 3 Minuten gekocht und dann bei -20°C
eingefroren.
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