Tierärztliche Hochschule Hannover - TiHo Bibliothek elib

wurden vor und nach Benutzung mit UV-Licht desinfiziert. In regelmäßigen Abständen
wurden von jeder kultivierten Zelllinie Proben entnommen und mittels PCR-Verfahren auf
Kontamination durch Mykoplama untersucht.
4.4.2 Auftauen und kultivieren von Zelllinien
Die den Zelllinien entsprechenden Nährmedien und Zusätze sowie das Wachstumsverhalten
und das Teilungsverhältnis der Zellen sind im Kapitel Material, Zelllinien für jede Zelllinie
aufgeführt. Zellmedien und andere Lösungen und Chemikalien wurden vor Zugabe zu den
Zellen auf 37 °C erwärmt. Die bei -80°C tiefgefrorenen Zelllinien wurden für 30 Sekunden
bei 37°C im Wasserbad angetaut und anschließend in 10 ml des entsprechenden Mediums
überführt. Die jetzt im Medium vollkommen aufgetauten Zellen wurden bei 300 x g für 5
Minuten zentrifugiert, der Überstand abgenommen und das Pellet in 6 ml Medium durch
vorsichtiges Auf- und Abpipettieren resuspendiert. Die Zellsuspension wurde auf 2 60 mm Ø
Zellkulturschalen verteilt, eine mit 5,5 ml, die zweite mit 0,5 ml + 5 ml Medium. Die Zellen
wurden im Brutschrank bei 37°C und 5% Kohlenstoffdioxid inkubiert.
4.4.3 Mediumwechsel und Teilen (Splitten) der Zellen
Waren die Zellen in den Zellkulturschalen zu einem dichten Zellrasen gewachsen, mussten sie
auf mehrere neue Schalen auf geteilt werden (Splitten). Im Zuge dessen erhielten die Zellen
neues Medium. War das Medium schon vor Erreichen des dichten Zellrasens verbraucht,
wurde es gewechselt ohne die Zellen in neue Schalen umzusiedeln. In jedem Fall wurde 2-
mal wöchentlich das Medium ausgewechselt. Das Wachstumsverhalten der Zellen wurde
täglich mikroskopisch begutachtet. Dabei wurde auf ein homogenes Erscheinungsbild der
Zellen, Zellkerngröße, Kern-Zytoplasmarelation, auf den Kontakt der Zellen zum Untergrund,
sowie auf Zell-Zell-Verbindungen, auf das Auftreten von Vakuolen als Zeichen von
Degeneration und Apoptose, sowie auf apoptotische, frei schwimmende Zellen geachtet.
Abweichend von den im Materialkapitel angegeben Teilintervallen wurden die Zellen
individuell gesplittet, falls das Zellwachstum dies erforderte. Beim Splitten wurde so
vorgegangen:
Das Medium wurde abgesaugt und der Zellrasen 1-mal mit PBS gewaschen. Auf eine 60 mm
Ø Zellkulturschale wurden 500µl Trypsin-EDTA gegeben, der Zellrasen damit bedeckt und
die Schale für 5 Minuten in den Brutschrank gegeben. Fall noch erforderlich wurden die
Zellen durch behutsames Klopfen der Schale gelöst. Die Zellsuspension wurde zu 10 ml
Medium gegeben um das restliche, aktive Trypsin zu inhibieren. Die Suspension wurde bei
300 x g für 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 10 ml
Medium aufgenommen und den angegebenen Splitt-Verhältnissen entsprechend auf neue
Platten mit frischem Medium aufgeteilt.
37