Tierärztliche Hochschule Hannover - TiHo Bibliothek elib

4.2.3 Darstellen der antikörpermarkierten Proteine mittels Chemilumineszenz
Um die mit Antikörpern markierten Proteine auf der Nitrozellulose-Membran sichtbar zu
machen, wurden die Nitrozellulosemembranen in einer Wasserstoffperoxid-Lösung (ECL-
Reagenz I) als Substrat für das Peroxidaseenzym inkubiert. Eine zweite Lösung (ECL-
Reagenz II) enthält ein Fluorophor, das durch die Peroxidasereaktion angeregt Licht emittiert.
Das Lichtsignal kann auf fotosensiblen Röntgenfilmen dargestellt werden. Die
Belichtungszeit des Films liegt je nach Film und Signalstärke bei wenigen Sekunden bis
Stunden. Die auf dem Film dargestellten Banden entsprechenden Proteinbanden auf der
Nitrozellulose-Membran und im Gel. Die Größe der Proteine kann anhand des bei der
Elektrophorese verwendeten Größenstandards ermittelt werden.
4.3 Quantitative Proteinbestimmung mittels Bradford Assay
Die Bestimmung des Proteingehaltes einer Lösung war unter anderem vor Verwendung der
Proteinlösungen in der Gelelektrophorese, zur Bestimmung der Proteinkonzentration von
Zelllysaten und zur Bestimmung der Proteinkonzentration nach Antikörperextraktion aus
Hühnereiern notwendig. Es wurde das Verfahren nach Bradford (Bradford 1976) eingesetzt.
Nach Bindung von Coomassie brilliant blue G-250 in saurem Milieu an die Proteine in einer
Lösung wird das Absorptionsmaximum des Farbstoffs von 465nm zu 595nm verschoben, die
ursprünglich braune Farblösung wird blau. 100µl der Probenlösungen wurden in 2 bis 3
Konzentrationen in eine 96-Loch-Platte überführt. Als Standardproteinlösung mit bekannter
Konzentration wurde BSA in 8 Verdünnungen auf die Platte aufgetragen. Die Absorption
wurde photometrisch bei 595nm gemessen und war im Messbereich des Tests proportional
zur Proteinkonzentration in den Probenlösungen.
4.4 Kultivieren von Pankreastumorzelllinien
4.4.1 Arbeiten mit Zellkulturen
Jeglicher Umgang mit Zellen, das Auftauen, Verdünnen, Splitten (Teilen) und Einfrieren fand
unter keimreduzierten Bedingungen in einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank statt.
Vor jedem Verbringen der Zellkulturschalen und Arbeitsgegenstände in die
Sicherheitswerkbank wurden alle Gegenstände mit 70%igem Ethanol desinfiziert. Bei
Gegenständen mit direktem Kontakt zu den Zellen handelte es sich um autoklavierte
Einwegartikel. Mehrweggegenstände wurden vor Gebrauch autoklaviert. Medien,
Waschlösungen und Chemikalien wurden, soweit erforderlich, vor Gebrauch autoklaviert.
Zell- und Waschlösungen sowie Gegenstände, die in Kontakt mit Zellen oder
Zellsuspensionen gekommen sein könnten, wurden in speziellen Behältnissen gesammelt und
vor Entsorgung autoklaviert. Die Oberflächen der mikrobiologischen Sicherheitswerkbank
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