Tierärztliche Hochschule Hannover - TiHo Bibliothek elib

4.2 Qualitative Proteinbestimmung durch Westen-Blot
4.2.1 Proteintransfer aus dem SDS-Gel auf Nitrozellulosemembran (Western-Blot)
Zur Konservierung der im Gel aufgetrennten Proteine sowie zur weiteren Detektion
bestimmter Proteine durch Antikörper, wurden die Proteine aus den SDS- und Schägger-
Gelen gelöst und auf Nitrozellulose-Membranen übertragen. Dabei kam das Blotting-
Verfahren zur Anwendung. Die Zellulosemembran wurden wie ein Löschpapier (von engl.
blotting paper = Löschpapier) auf die Gele gelegt und die in Detergenzpuffer gelösten
Proteine durch Anlegen einer elektrischen Spannung auf die Zellulose-Membran übertragen.
Die Zellulose-Membran stellt somit einen Abdruck des Gels dar. Der Transfer erfolge in einer
BioRad-Semidry ® -Blotkammer in Transblot SDS Puffer für 60 Minuten bei 120 mA/Gel. Um
den Proteintransfer zur überprüfen wurden die geblotteten Membranen nach kurzem Wässern
anschließend für 10 Minuten mit Ponceau S (2g/l in 2% (w/v) TCA) gefärbt. Die
Nitrozellulosemembranen wurden bis zur weiteren Verwendung kurzfristig in WB-A Puffer
gelagert oder getrocknet.
4.2.2 Qualitative Detektion von Proteine durch Antikörper (Immunoblot)
Durch Bindung von spezifischen Antikörpern an ein ausgewähltes Protein auf der Zellulose-
Membran und anschließendem Sichtbarmachen der Antikörper können Proteine qualitativ
nachgewiesen werden.
Zunächst wurde die Nitrozellulosemembran in WB-A mit 0,3% Magermilchpulver (w/v) oder
0,5% Fischgelatine 30 Minuten inkubiert, um unspezifische Bindungen des Antikörpers an
Nitrozellulose und andere Proteine zu blockieren. Die Membranen wurden mit einer
Antikörperlösung inkubiert (Primärantikörper). Die primären Antikörper entstammen nicht
der Spezies des Zielproteins. Die Antikörperverdünnung entsprach im Allgemeinen den
Empfehlungen des Herstellers, sie wurden von 1: 500 bis 1: 2500 verdünnt eingesetzt. Die aus
dem Hühnerei aufgereinigten Antikörper wurden 1: 10000 bis 1:20000 verdünnt eingesetzt.
Die Antikörperinkubation, bei welcher der primäre Antikörper an das auf der Nitrozellulose-
Membran fixierte Zielprotein spezifisch bindet, fand bei 8°C für 1-3 Stunden statt. Dann
wurde ein mit Peroxidaseenzym gekoppelter zweiter, speziesspezifischer Antikörper
eingesetzt (Sekundärantikörper), der am Fc-Teil des primären Antikörpers bindet. Die
Zellulosemembran wurde mit dem sekundären Antikörper, der in WB-A Puffer 1: 10000 bis
1: 15000 verdünnt wurde, 1 Stunde bei 8°C inkubiert. Vor- bzw. nach jedem
Inkubationsschritt wurden die Membranen 6-mal für 5 Minuten in WB-A Puffer gewaschen.
Auf diese Weise markierte Proteine konnten dann durch Inkubation in entsprechender
Substratlösung für die Peroxidase im ECL-Verfahren sichtbar gemacht werden.
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