Tierärztliche Hochschule Hannover - TiHo Bibliothek elib

4. Methoden
4.1 Separation von Proteinen durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Um Proteine nach Molekulargewicht und Ladung aufzutrennen, wurde das von Laemmli
(Laemmli 1970) entwickelte Verfahren der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese verwendet.
Die Proteine werden durch das Detergenz SDS in ein Acrylamidpolymer-Gel aufgenommen
und sind durch Komplexierung im Gel negativ geladen. Durch Anlegen einer Spannung
durchwandern die Proteine das Gel je nach Molekulargewicht und Anzahl negativer
Ladungen unterschiedlich schnell und werden so aufgetrennt. Proteine bestehend aus vielen
Aminosäuren haben viele negative Ladungen, werden fester an das Polymer gebunden und
wandern langsamer durch das Gel. Durch unterschiedliche Konzentrationen des
Acrylamidpolymers im Gel lassen sich gezielt kleine bzw. große Proteine separieren. Die
Verwendung von Gelen mit zwei unterschiedlichen Konzentrationsstufen ermöglicht die
gezielte Separation von großen und kleinen Proteinen in einem Gel. Es wurden Trenngele mit
8%, 14%, 16% Acrylamid und 8%/13% Acrylamid-Stufengele verwendet. Zur Separation
kleiner Proteine, vor allem S100A8/A9, wurden Gele nach Schägger (Schägger, von Jagow
1987) mit den zugehörigen Puffern angefertigt.
Die Gele setzten sich aus einem 3% acrylamidhaltigen Sammelgel und einem Trenngel
zusammen. Sie bestanden aus Gelpuffer, Acrylamid und Wasser. Die Polymerisation der
Gele wurde durch Zugabe von 1% APS und 0,005% TEMED gestartet. Die
Zusammensetzung der jeweiligen Gel-, Anoden- und Kathodenpuffer ist im Materialkapitel
dargestellt. Als Größenstandard wurden Proteingemische mit bekanntem Molekulargewicht
verwendet (PageRuler Protein Staining Solution, Fermentas; Spectra Multicolor Broad
Range Protein Ladder, Fermentas). Das Elektrophoreseverfahren wurde in Anlehnung an
(Sambrook 1989) durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurden die Gele entweder mit
Coomassie brilliant blue G-250 gefärbt oder es wurde ein Western-Blot zum Übertragen der
Proteine auf Nitrozellulose-Membran durchgeführt.
4.1.1 Fixieren und Färben der SDS- und Schägger-Gele
Um die exakte Proteinauftrennung im Gel zu überprüfen wurden die Proteine im Gel nach
Elektrophorese mit Coomassie brilliant blue G-250 gefärbt (Schägger 1988). Nach
zweimaligem 10 minütigem Wässern wurden die Gele für 10 bis 15 Minuten in 40% Ethanol
fixiert, dann nochmals zweimal gewässert und anschließend in einer Coomassie-Sensitiv-
Farblösung (0,04% Coomassie brilliant blue G-250, 5% Aluminiumsulfat, 2% ortho-
Phosphorsäure,10% Ethanol, dest. Wasser) über Nacht gefärbt. Eine Entfärbung der Gele
kann in einer Lösung aus 10% Ethanol, 2% orhto-Phosphorsäure und dest. Wasser erfolgen.
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