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die Verwendung von Antikörpern, die das gesuchte Protein in den Gewebeproben binden. Um
diese spezifische Protein-Antikörperbindung sichtbar zu machen, werden sekundäre
Antikörper eingesetzt, welche an den primären Antikörper binden und diesen über
histochemische Färbung im Durchlicht oder über Fluorophorkopplung in der
Fluoreszenzmikroskopie sichtbar machen. Die Lokalisation der Proteine ist bei diesen
Methoden an die Auflösungsgrenzen photo-optischer Systeme gebunden. Eine sensitivere
Methode zur Proteindetektion auf subzellulärer Ebene stellt die Immuno-Gold-Markierung
dar. Zwar werden auch hier die gesuchten Proteine primär mit Antikörpern markiert, diese
werden dann aber über Kopplung an Goldmoleküle elektronenmikroskopisch sichtbar
gemacht (Bendayan 2000). In dieser Arbeit kamen einfache und verglgeichsweise materialund
kostenextensive Immunfluoreszenzmarkierungen zum Einsatz. Neben der Fluoreszenz
von antikörpergekoppelten Fluorophoren verfügen Zellen und Gewebe über natürliche
Fluorophore, deren Lichtemission die Detektion der fluorophormarkierten Proteine
überdecken kann. Die in dieser Arbeit verwendeten Pankreasgewebeproben wiesen einen
unregelmäßigen, hohen Eigenfluoreszenzhintergund auf, so dass die Proben für eine sensitive,
reproduzierbare Fluoreszenzmarkierung einer speziellen Gewebevorbereitung bedurften.
Hierauf soll im nächsten Abschnitt näher eingegangen werden.
1.4.1 Eigenfluoreszenz von Zellen und Geweben
Obwohl die Untersuchung, Beschreibung und Quantifizierung der Eigenfluoreszenz von
formalinfixierten, paraffineingebetteten Pankreasgewebeproben nicht direkt zur Klärung der
übergeordneten Fragestellung dieser Arbeit beitragen, war die aus ihrer Limitation
begründete Qualität der wertvollen humanen Pankreasbiopsien Anlass genug, sich intensiv
mit der Ursache der Eigenfluoreszenz dieser Präparate auseinanderzusetzten und adäquate
Protokolle zu entwickeln, welche die Eigenfluoreszenz herabsetzen.
Eigenfluoreszenz ist die Eigenschaft von Stoffen, Zellen oder Geweben, Licht einer
bestimmten Wellenlänge zu absorbieren und dann Licht einer längeren Wellenlänge wieder zu
emittieren. Viele aromatische Verbindungen, Reaktionsprodukte einiger Aldehyde
(Andersson 1998; Willingham 1983) sowie viele Azofarbstoffe (Romijn 1999) fluoreszieren,
wenn sie mit Licht einer definierten Wellenlänge angeregt werden.
Bei der Immunfluoreszenz-Markierung bestimmter Proteine in Zellen oder Geweben kann
Eigenfluoreszenz der Präparate die mikroskopische Auswertung erschweren, wenn sich die
Wellenlänge der zur Markierung gewählten Fluorophore mit der Wellenlänge der emittierten
Eigenfluoreszenz überschneidet. Eigenfluoreszenz kann dann die spezifische Fluoreszenz-
Markierung gänzlich überlagern, sie kann falsch-positive spezifische Fluoreszenzmarkierung
vortäuschen und sie kann die Auswertung durch ein schlechtes Signal-zu-Hintergrund-
Verhältnis erschweren.
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