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carried out by first applying Sudan Black and subsequently cupric sulphate as described above. Photobleaching was performed prior to the removal of paraffin, finally followed by Sudan Black treatment and mounting in glycerol with cover slips. Specific Immunofluorescence Labeling Specific labeling of tissue sections was performed generally as described (Rosenow, et al., 2008; Schnekenburger, et al., 2009) detail, following the pretreatment as indicated, the sections were incubated in PBS containing 5% bovine serum albumin (BSA) for 30 minutes. Primary antibodies were diluted in PBS containing 1% BSA as recommended by the manufacturer (rabbit polyclonal anti-trypsinogen, 1:1000, Abcam, UK; rabbit anti-synaptobrevin2 (VAMP2), 1:100, Wako Chemicals GmbH, Germany; mouse monoclonal anti-Calgranulin B (MRP 1H9), 1:10, Santa Cruz Biotechnology, Germany; chicken anti-Reg3A, raised against a peptide comprising a 16 amino acid N-terminal sequence of human Reg3a, 1:500), incubated for one hour in a wet chamber. The specimen were rinsed repeatedly in PBS to remove excessive antibodies, incubated with Fluorochrome-labeled secondary antibodies (Alexa Fluor® 488 conjugated goat anti-rabbit IgG, 1:500; Alexa Fluor® 488 conjugated goat antichicken IgG, 1:500; Alexa Fluor® 555 conjugated goat anti-rabbit IgG, 1:500; Alexa Fluor® 594 conjugated goat anti-mouse IgG, 1:500; all from Invitrogene, Germany) diluted in PBS containing 1% BSA for one hour, and subsequently rinsed in PBS thoroughly, before mounting as described above. After Sudan Black treatment no detergent should be used during the following procedures since it may destain Sudan Black rapidly (Romijn, et al., 1999). Samples incubated without primary antibodies served as controls for specificity, and indeed did not display detectable immunofluorescence signals. Microscope, Filter Sets and Image Acquisition The sections were examined with an Olympus BX-41 microscope (Olympus Deutschland GmbH, Germany) equipped with filter sets and U-LH100HG for reflected fluorescence microscopy. Objectives used: Olympus PlanN 40x/0.65; Olympus U- Plan FI 100x/1.30 Oil. Epifluorescence filter sets used in this study are shown in Table 1. - 9 -
Tab. 1: Specifications of the filter setups used for fluorescence microscopy Indication Manufacturer Exciter Dichroic mirror Emitter DAPI Semrock*1 set bandpass longpass bandpass filter BFPA-basic 390/18 nm 416 nm 460/ 60 nm exciter, dichroic: FITC filter Olympus*2 U-MNB2 emitter: bandpass 480/20 nm longpass 500 nm ET bandpass 535/ 30 nm Chroma*3 Cy3 filter Olympus set U-MNG 2 bandpass 540/10 nm longpass 570 nm longpass 590 nm Texas Chroma set ET bandpass ET longpass ET bandpass Red filter 49008 560/40 nm 585 nm 630/75 nm *1 Semrock, Rochester, New York, USA; *2 Olympus Deutschland GmbH, Hamburg, Germany; *3 Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont, USA All images were acquired with an Olympus digital camera (Olympus U-TV1X-2 CC) using Cell^F imaging-software (Olympus Deutschland GmbH, Germany). The settings for exposure time, contrast, brightness, and pinhole were identical for each set of pictures of a figure, except when indicated otherwise in the text. To allow an improved visibility, images of some figures were adapted by linear brightness enhancement and each of the compared images of the shown figures was treated identically using Cell^F software. Quantification and comparison of fluorescence intensities To quantify fluorescence emission intensities the original acquired image data were used. Mean intensity levels (mean intensity profile, Cell^F imaging software) were calculated from indicated areas of interest, expressed as pixel grey scale values. To compare general autofluorescence of pancreatic tissue samples, mean fluorescence intensities were calculated from selected comparable image areas that display pancreatic acini as the typical histological structure, as shown for example in Fig. 2. - 10 -
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meinen Eltern
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3.1.2 Material 22 3.1.3 Geräte und
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4.8.4 Bestimmung von CEA, CA19-9 un
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6.3 Schlussfolgerung 110 7. Zusamme
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1.1 Das Pankreas 1.1.1 Physiologie
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zwischen Cathepsin L und B sowie St
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1.2.3 Pankreaserkrankungen bei Tier
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1.3.1 Das C-reaktive Protein (CRP)
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1.3.3 Der S100A8/9-Proteinkomplex C
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Entzündungsgeschehen, Infektionen,
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Matrixproteine Laminin-1 und Fibron
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die Verwendung von Antikörpern, di
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2. Aufgabenstellung Um eine zuverl
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Natriumdihydrogenphosphat (NaH 2 PO
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3.1.2 Material Blutentnahmesystem (
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Zentrifuge (Sorvall RC-5 B, Rotoren
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Elutionspuffer: Harnstoff 4M 4 M Ha
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PBS, phosphate buffered saline 13,7
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3.1.6 Antikörper Zur Detektion bes
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3.1.7 Zelllinien Folgende Zelllinie
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4. Methoden 4.1 Separation von Prot
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4.2.3 Darstellen der antikörpermar
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Die Zellen wurden für weitere Vers
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Meerrettichperoxidase-gekoppelter S
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2010). Einer Subklasse dieser IgY A
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Kupplungspuffer bestehend aus 0,6 M
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Sekundärantikörpern inkubiert. Di
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erhöhte Salzkonzentration sollte d
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die Gruppen „chronische Pankreati
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Alexa Fluor 488, Ziegenantikörper
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Veränderungen der Plasmakonzentrat
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derselben Firma durchgeführt. Dabe
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4.9 Statistische Auswertung Die Erg
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5. Ergebnisse Im Folgenden werden d
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dieser Banden nach Immunpräzipitat
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Bedingungen die Antikörperketten n
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Abb. 4: Immunfluoreszenzmarkierung
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Bildbereich als Leerwert ausgewähl
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Pankreasgewebeschnitte angepasst un
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Wie bereits in Abb. 6 gezeigt, wird
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Abb. 8: Fluoreszenzmarkierung von R
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Abb. 9: Zwei histopathologische Bil
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Abb. 11 A zeigt die Fluoreszenzmark
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Abb. 12: A-C‘ Chronische Pankreat
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In Abb. 14 A wurde S100A9 in Gewebe
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5.4 Ergebnisse der quantitativen Pr
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