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What to do with high autofluorescence background tissues – an efficient method for specific immunofluorescence labeling Till Erben #a , Rainer Ossig #a , Hassan Y Naim ‡ , Jürgen Schnekenburger # * # Biomedical Technology Center, Westfälische Wilhelms-Universität, Albert- Schweitzer-Campus 1 A14, 48149 Münster, Germany ‡ Department of Physiological Chemistry, University of Veterinary Medicine <strong>Hannover</strong>, Bünteweg 17, 30559 <strong>Hannover</strong>, Germany a Equally contributing authors *Corresponding author: Jürgen Schnekenburger Biomedical Technology Center University of Münster (WWU) Albert-Schweitzer-Campus 1 A14 48149 Münster, Germany Tel.: +49 251 8352534 Fax: +49 251 8357938 E-mail: schnekenburger@uni-muenster.de - 1 -
Abstract: High autofluorescence levels in tissue samples can entirely mask specific labeling with fluorophores and thus compromise the validity of immunofluorescence histochemistry. In formalin-fixed archival pancreatic tissue samples we observed autofluorescence as a common problem mostly induced by a fixation and processing procedure. Using epifluorescence microscopy we analyzed the intensity as well as the spatial distribution of autofluorescence in human pancreatic tissue and demonstrated an efficient method to reduce the unwanted light emission. The optimized protocol which uses the dye Sudan Black B is demonstrated to stain particularly those pancreatic tissue areas which exhibit notably bright autofluorescence. As a result, tissue autofluorescence is reduced to a low and intensity-equalized background level. Implementing quantitative image analysis and using a range of different microscopic fluorescence filter setups autofluorescence is shown to be suppressed by 65 % to more than 90 %. The application of our procedure did not affect specific immunofluorescence labeling nor tissue integrity. As a clear result of Sudan Black treatment, a tremendous improvement of the signal-tonoise ratio was achieved, which is a basic prerequisite for detection, visualization and quantitation of specific fluorescent labels. Other methods applied such as tissue treatment with cupric sulphate, Toluidine Blue and UV-irradiation, or combinations of these with Sudan Black B, were not able to match or surpass the superiority of the Sudan Black B staining approach. This easy to perform method allows a well defined and reliable fluorescence labeling in pancreatic tissue sections. Due to its capability to drastically reduce autofluorescence of pancreatic specimen this technique can clearly improve qualitative as well as quantitative analysis of immunohistochemical stainings and rescue overfixated tissues for immunofluorescence application. Abbreviations: BSA bovine serum albumin, CAPS N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid, CCD cooled coupled device, Cy3 cyanine3, DABCO 1,4-diazobicyclo 2,2,2 octane, DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole, EDTA ethylenediaminetetraacetic acid, FITC fluoresceinisothiocyanine, IgG immunoglobuline G, min minute, mM millimolar, MOPS 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid, NADH nicotinamide adenine dinucleotide, PBS phosphate buffered saline, SB Sudan Black B, Tris tris(hydroxymethyl)aminomethane - 2 -
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meinen Eltern
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3.1.2 Material 22 3.1.3 Geräte und
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4.8.4 Bestimmung von CEA, CA19-9 un
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zwischen Cathepsin L und B sowie St
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1.2.3 Pankreaserkrankungen bei Tier
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1.3.1 Das C-reaktive Protein (CRP)
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1.3.3 Der S100A8/9-Proteinkomplex C
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Entzündungsgeschehen, Infektionen,
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Matrixproteine Laminin-1 und Fibron
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die Verwendung von Antikörpern, di
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Natriumdihydrogenphosphat (NaH 2 PO
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Zentrifuge (Sorvall RC-5 B, Rotoren
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Elutionspuffer: Harnstoff 4M 4 M Ha
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PBS, phosphate buffered saline 13,7
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3.1.6 Antikörper Zur Detektion bes
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4. Methoden 4.1 Separation von Prot
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4.2.3 Darstellen der antikörpermar
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Die Zellen wurden für weitere Vers
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Meerrettichperoxidase-gekoppelter S
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2010). Einer Subklasse dieser IgY A
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Kupplungspuffer bestehend aus 0,6 M
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Sekundärantikörpern inkubiert. Di
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erhöhte Salzkonzentration sollte d
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die Gruppen „chronische Pankreati
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Alexa Fluor 488, Ziegenantikörper
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Veränderungen der Plasmakonzentrat
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derselben Firma durchgeführt. Dabe
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4.9 Statistische Auswertung Die Erg
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5. Ergebnisse Im Folgenden werden d
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dieser Banden nach Immunpräzipitat
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Bildbereich als Leerwert ausgewähl
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