TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

Material und Methoden
mOsmol und einen pH von 7,4 bei 38°C und 5% CO 2 auf. Die vollständige
Zusammensetzung der Medien ist dem Anhang zu entnehmen.
Den Medien wurde 3,7 µM Propidiumjodid (PI) als Marker für plasmamembrandefekte
Spermien zugesetzt. Die durchflussyztometrische Analyse erfolgte an jedem
Untersuchungstag nach 3, 20, 40 und 60 min Inkubation in den unterschiedlichen
Medien. Als Sheathflüssigkeit wurde HBS 300 auf einen pH-Wert von 7,55 bei
Raumtemperatur (= 7,4 bei 38°C) und eine Osmolalität von 300 ± 5 mOsmol/kg
eingestellt.
3.5.3.3 Messung und Auswertung
An jedem Untersuchungstag wurden die Grundeinstellungen überprüft sowie die
erfolgreiche Beladung der Spermien mit Fluo-3 überprüft. Letzteres erfolgte durch
Einsatz des Calcium-Ionophors A23187. Dabei wurde geprüft, ob der durch Zugabe
des Calcium-Ionophors induzierte intrazelluläre Calciumeinstrom über ein positives
Fluo-3-Signal sichtbar gemacht werden konnte. Details des Vorgehens sind bei
Henning (2009) beschrieben.
30 min nach Fluo-3-Beladung des konservierten Spermas wurden die
Inkubationsreihen zeitversetzt im Abstand von 2 min gestartet. Dazu wurden jeweils
5 µl Spermiensuspension mit ca. 1,0 – 1,5 x 10 5 Spermien/ml zu 995 µl Medium der
Tyrodevarianten pipettiert und bei 38°C inkubiert. Bikarbonatfreie Medien (Tyr Kontrolle )
wurden abgedeckt im Wärmeschrank inkubiert, während bikarbonathaltige Medien
(Tyr BikCa ; Tyr Ca ) offen im CO 2 -Brutschrank inkubiert wurden. Von der Entnahme der
Messgefäße aus dem CO 2 -Inkubator/Wärmeschrank bis zur Beendigung der Analyse
wurde eine Zeitspanne von maximal 30 Sekunden eingehalten. Zwischen den
einzelnen Messungen wurde das Durchflusszytometer mit HBS gespült.
Anhand der Histogramme nach 3 min Inkubationsdauer wurde die
Spermienpopulation mittels Grenzlinien („ranges“) von Debris und Agglutinationen
abgegrenzt sowie die Grenze zwischen Fluo-3-negativen und -positiven, sowie PInegativen
und -positiven Signalen festgelegt. Die Einstellung der Kompensation für
die Überlagerung des grünen und roten Spektrums erfolgte im FL-3/FL-1 Dotplot an
Proben, die in Tyr BikCa inkubiert worden waren und eine deutliche Zunahme der
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