TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

Material und Methoden
3.5.3.1 Farbstoffe
Der selektiv an Calciumionen bindende Fluoreszenzfarbstoff Fluo-3/AM (Fa. Alexis,
Lausen, Schweiz) wurde genutzt. Nach Komplexbildung des Farbstoffes mit
zytosolischen Calciumionen wird bei Anregung mit Laser grünes Fluoreszenzlicht mit
dem Emissionmaximum der Wellenlänge 526 nm emittiert. Fluo-3-positive Spermien
stellen daher Spermien mit hohem zytosolischen Calcium-Gehalt dar. An derselben
Probe erfolgte parallel eine Differenzierung in Spermien mit intakter und defekter
Plasmamembran mittels Propidiumjodid (PI). Auf diese Weise ließen sich vier
Spermienpopulationen differenzieren:
1. = Plasmamembran defekt und niedriger intrazellulärer Calciumgehalt
(PI-positiv/Fluo-3-negativ)
2. = Plasmamembran defekt und hoher intrazellulärer Calciumgehalt
(PI-positiv/Fluo-3-positiv)
3. = Plasmamembran intakt und niedriger intrazellulärer Calciumgehalt
(PI-negativ/Fluo-3-negativ)
4. = Plasmamembran intakt und hoher intrazellulärer Calciumgehalt
(PI-negativ/ Fluo-3-positiv)
3.5.3.2 Medien und Messzeitpunkte
Das gelagerte Sperma wurde in Anlehnung an die Versuche von Henning (2009) vor
Beladung mit den genannten Fluoreszenzfarbstoffen in drei verschiedenen Medien
inkubiert:
1. Tyr BikCa = Tyrode Medium mit 15 mM NaHCO 3 und 2 mM CaCl 2:
= vollständiges Kapazitationsmedium
2. Tyr Ca = Tyrode Medium ohne NaHCO 3 , mit 2 mM CaCl 2
3. Tyr Kontrolle = Tyrode Kontrolle ohne NaHCO 3 und ohne CaCl 2 (plus 1mM EGTA)
Mit diesem Versuchansatz ließ sich die Reaktion der Spermien auf spezifische
Stimuli differenzieren. Als der entscheidende Kapazitationsstimulus gilt bei
Eberspermien das Bicarbonat (NaHCO 3 ). Die Medien wurden wie bei Henning (2009)
beschrieben, hergestellt. Zum Messzeitpunkt wiesen sie eine Osmolarität von 300
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