TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

Material und Methoden
3.5.2.4 Messung und Auswertung
Der Anteil plasma- und akrosommembranintakter Spermien wurde wie bei Henning
(2009) beschrieben, bestimmt. Dazu wurden 492,5 µl verdünntes Sperma mit 2,5 µl
PI-Stammlösung (Endkonzentration: 2,7 µg/ml) und 5 µl FITC-PNA-Stammlösung
(Endkonzentration: 3 µg/ml) vermischt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend wurden 10 µl der gefärbten Spermiensuspension in 890 µl HBS
überführt und analysiert.
Die Auswertung erfolgte nach mathematischer Kompensation sich überlagernder
Emissionspektren an Hand des FL-1/FL-3-dotplots. Hierzu wurde der prozentuale
Anteil der Ereignisse in folgenden vier Spermienpopulationen durch Setzen einer
vertikalen und einer horizontalen Grenzlinie („gate“) differenziert:
1. = Plasmamembran defekt und Akrosommembran intakt
(PI-positiv/FITC-PNA-negativ)
2. = Plasmamembran defekt und Akrosommembran defekt
(PI-positiv/FITC-PNA-positiv)
3. = Plasmamembran intakt und Akrosommembran intakt
(=membranintakte Spermien; PI- negativ/FITC-PNA-negativ)
4. = Plasmamembran intakt und Akrosommembran defekt
(PI-negativ/FITC-PNA-positiv)
Für den gesamten Versuchszeitraum wurden, soweit möglich, eine einheitliche
Kompensation und identische Grenzlinien verwendet.
3.5.3 Calciuminflux
Der intrazelluläre Calciumgehalt wurde zu definierten Zeitpunkten der Inkubation in
drei Varianten von Tyrodemedien in Anlehnung an Henning (2009) nach einem
vereinfachtem Protokoll gemessen. Es wurde dasselbe Durchflusszytometer wie
unter Kap. 3.5.2.1 beschrieben verwendet.
19