TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

Material und Methoden
SSC (Ordinate) gegeneinander aufgetragen; die Spermiensignale sollten eine „L“-
Form oder Dreiecksform abbilden. Anschließend wurde die Verstärkung so reguliert,
dass Signale von Schmutzpartikeln und Zelldetritus ausgeschlossen werden
konnten. Für die Einstellung des Rotsignals (FL-3-Kanal) und Grünsignals (FL-1-
Kanal) wurden je 497,5 µl verdünntes Sperma mit 2,5 µl PI-Stammlösung (500 µg/ml)
bzw. 495 µl verdünntes Sperma mit 5 µl FITC-PNA-Stammlösung (300 µg/ml)
versetzt und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Jeweils 10 µl der gefärbten
Probe wurden in 890 µl HBS überführt und gemessen. Während des Messvorgangs
wurde die Verstärkung einreguliert, so dass PI- und FITC-PNA-positive Ereignisse
eine mindestens um den Faktor 10 erhöhte Fluoreszenzintensität im Vergleich zu PIbzw.
FITC-PNA-negativen Ereignissen aufwiesen.
Die Feineinstellung der Verstärkung wurde über eine Doppelfärbung einer
verdünnten Samenprobe wie folgt durchgeführt: 2,5 µl PI-Stammlösung
(Endkonzentration: 2,7 µg/ml) und 5 µl FITC-PNA-Stammlösung (Endkonzentration:
3 µg/ml) wurden in 492,5 µl verdünntes Sperma überführt und für 5 Min bei
Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 10 µl der gefärbten
Spermiensuspension in 890 µl HBS überführt und analysiert. Die Einstellung der
Verstärkungen wurde an jedem Untersuchungstag überprüft und gegebenenfalls
erneut angepasst. Das Gerät war für alle Messungen auf den Parameter FSC
getriggert. Sämtliche Messungen erfolgten mit einer Flussrate zwischen 400 und 800
Partikeln pro Sekunde. Zwischen den Analysen wurde das Gerät mit
Sheathflüssigkeit gespült. Pro Messung wurden 10.000 Ereignisse erfasst.
Zur Korrektur der Fremdpartikel wurde weiterhin in Anlehnung an PETRUNKINA et
al. (2010) nach 12 h Lagerungsdauer eine Bestimmung des Fremdpartikelgehaltes in
jeder Spermaprobe vorgenommen. Dazu wurden 985 µl destilliertes Wasser mit 5 µl
PI-Stammlösung (Endkonzentration: 2,7 µg/ml) und 10 µl verdünntem Sperma
gemischt und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert (Henning, 2009) und mit den
genannten Geräteeinstellungen gemessen. Über eine Korrekturformel
(PETRUNKINA u. HARRISON 2010) wurden Nicht-DNA-haltige Ereignisse von der
Auswertung eliminiert.
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