TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

Material und Methoden
90°-Winkel zum Objektträger positioniert, so dass der Tropfen durch Kapillarkräfte
eingesogen wurde. Nach Fokussierung und Einstellung der Lichtintensität wurde der
automatisierte Messvorgang gestartet. Das Intervall zwischen Kammerbefüllung und
Ende der Messung betrug maximal 60 Sekunden.
3.5.2 Membranintegrität
3.5.2.1 Gerät
Ein Durchflusszytometer der Baureihe „Galaxy“ (Fa. Partec, Münster) wurde
verwendet. Dieses ist mit einem Argonionenlaser (488 nm; 20 mW) zur Anregung der
Farbstoffe sowie drei verschiedenen Filtern: FL-1 (537,5/22,5 nm) für grünes
Fluoreszenzlicht, FL-2 (590/25 nm) für oranges Fluoreszenzlicht und FL-3 (630 nm
LP) für rotes Fluoreszenzlicht ausgestattet. Die Steuerung erfolgte über die Software
FloMax 2.0 (Fa. Partec, Münster).
3.5.2.2 Farbstoffe
Plasmamembrandefekte Spermien wurden durch rote Anfärbung mit dem
zellimpermeablen DNA- und RNA-Farbstoff Propiumjodid (PI) (Fa. Sigma-Aldrich,
Steinheim) identifiziert (TAS u. WESTERNENG 1981). Akrosomdefekte Spermien
wurden nach grüner Anfärbung mit Peanut Agglutinin, welches an
Fluoreszeinisothiocyanat (FITC-PNA, Axxora GmbH, Lörrach) gekoppelt war,
ermittelt (FLESCH et al. 1998).
3.5.2.3 Geräteeinstellung und Fremdpartikelkorrektur
Die Grundeinstellung der Signalverstärkungen aller relevanten Parameter erfolgte zu
Beginn eines jeden Versuchsabschnittes wie bei Henning (2009) beschrieben. Sie
wurde für die gesamte Versuchsdauer beibehalten. Dabei wurden die Verstärkung
der Vorwärtsstreuung (FSC = forward scatter) als Maß für die Partikelgröße und die
Seitwärtsstreuung (SSC = side scatter) als Maß für die Komplexität bzw. Granularität
der Partikel auf linearen Skalen festgelegt. Dazu wurde eine ungefärbte Probe, d.h.
10 µl verdünntes Sperma mit 890 µl HBS (pH 7,4, 300 mOsmol) verwendet. Es
wurde darauf geachtet, im FCS-Histogramm eine glockenförmige Verteilungskurve
abzubilden. In einem Punktewolkendiagramm (dotplot) wurden FSC (Abszisse) und
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