TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover
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Material und Methoden 3 Material und Methode 3.1 Versuchsdesign Experiment 1: Eberspezifität der Reaktivität auf Bikarbonat bei flüssigkonservierten Eberspermatozoen Über einen Untersuchungszeitraum von sechs Wochen wurde wöchentlich je ein Ejakulat von sieben institutseigenen Ebern untersucht (n=42 Ejakulate). Alle Ejakulate wurden mit kommerziell erhältlicher Beltsville Thawing Solution (BTS, Fa. Minitüb, Tiefenbach) verdünnt. Anschließend wurde jedes Ejakulat in zwei Portionen aufgeteilt und diese jeweils bei 17°C und bei 5°C gelagert. Folgende Untersuchungen wurden am Tag der Verdünnung bei Raumtemperatur und nach 24, 72 und 120 Stunden Lagerung durchgeführt: - Membranintegrität (Plasma- und Akrosommembran) mittels Durchflusszytometrie. - Spermienmotilität mittels computergestützter Spermienanalyse (CASA) . - Kinetik des Calciuminflux mittels Durchflusszytometrie. Experiment 2: Bezug zwischen der Reaktivität auf Bikarbonat und anderen spermatologischen Parametern bei einer Stichprobe von Eberspermaportionen aus Besamungsstationen Je sechs mit BTS verdünnte Ejakulate aus 13 Besamungstationen (n=78 Ejakulate) wurden wie folgt untersucht: - Membranintegrität (Plasma- und Akrosommembran) mittels Durchflusszytometrie nach 24 h und 96 h. - Spermienmotilität mittels computergestützter Spermienanalyse (CASA) nach 24 h und 72 h. - Kinetik des Calciuminflux mittels Durchflusszytometrie,nach 24 h und 96 h. Alle verwendeten Geräte und Verbrauchsmaterialen sind in im Anhang dieser Arbeit aufgelistet. Chemikalien inklusive der Bezugsquellen sowie die Gebrauchslösungen sind ebenfalls im Anhang aufgeführt. 12
Material und Methoden 3.2 Versuchstiere Für Experiment 1 wurde über einen Zeitraum von 6 Wochen jeweils ein Ejakulat/Woche von sieben klinisch gesunden institutseigenen Ebern im Alter von zwei bis sieben Jahren der Rassen Pietrain und Deutsche Landrasse gewonnen (n=42). Die Ejakulate (n=78) für Experiment 2 stammten von 78 Ebern der Rasse Pietrain aus 13 verschiedenen Besamungsstationen. Die Tiere wurden ein- bis zweimal pro Woche zur Samengewinnung herangezogen. Vor Versuchsbeginn waren alle Eber durch spermatologische Untersuchung mehrerer Ejakulate als normosperm im Sinne der Gewährschaftsbestimmungen des Zentralverbandes der deutschen Schweineproduktion (ZDS) aus dem Jahr 2005 eingestuft worden. Nach diesen Vorgaben lag der Anteil motiler Spermien im nativen Sperma bei mind. 70 % und der Anteil morphologisch abweichender Spermien bei maximal 25 %. Der Transport von den Besamungsstationen in das Labor der Reproduktionsmedizinischen Einheit der Kliniken erfolgte durch einen Kurierdienst, so dass gewährleistet war, dass die Besamungstuben am Tag nach der Gewinnung im Labor eintrafen. Direkt nach Erhalt des Samens wurde eine Temperaturkontrolle durchgeführt. Das Sperma wurde anschließend bis zur Untersuchung in einem Klimaschrank (Fa. Minitüb, Landshut) bei +17°C gelagert. Es wurde nur Sperma verwendet, das bei Ankunft eine Temperatur von +15°C bis +25°C aufwies. 3.3 Samengewinnung Die Ejakulate (spermienreiche und –arme Phase ohne Bulbourethraldrüsensekret) wurden am Phantom mittels der sogenannten „Handmethode“ in einen auf +38°C vorgewärmten Samenauffangbecher (Fa. Minitüb, Landshut) aufgefangen, welcher mit einem ebenfalls auf +38°C vorgewärmten Samenauffangbeutel (US Bag, Fa. Minitüb, Landshut) ausgekleidet war. Das Sperma wurde unmittelbar danach in einer auf ca. +35°C vorgewärmter Styroporkiste ins Labor transportiert. 13
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3 Material und Methode<br />
3.1 Versuchsdesign<br />
Experiment 1: Eberspezifität der Reaktivität auf Bikarbonat bei flüssigkonservierten<br />
Eberspermatozoen<br />
Über einen Untersuchungszeitraum von sechs Wochen wurde wöchentlich je ein<br />
Ejakulat von sieben institutseigenen Ebern untersucht (n=42 Ejakulate). Alle<br />
Ejakulate wurden mit kommerziell erhältlicher Beltsville Thawing Solution (BTS, Fa.<br />
Minitüb, Tiefenbach) verdünnt.<br />
Anschließend wurde jedes Ejakulat in zwei Portionen aufgeteilt und diese jeweils bei<br />
17°C und bei 5°C gelagert. Folgende Untersuchungen wurden am Tag der<br />
Verdünnung bei Raumtemperatur und nach 24, 72 und 120 Stunden Lagerung<br />
durchgeführt:<br />
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Durchflusszytometrie.<br />
- Spermienmotilität mittels computergestützter Spermienanalyse (CASA) .<br />
- Kinetik des Calciuminflux mittels Durchflusszytometrie.<br />
Experiment 2: Bezug zwischen der Reaktivität auf Bikarbonat und anderen<br />
spermatologischen Parametern bei einer Stichprobe von Eberspermaportionen<br />
aus Besamungsstationen<br />
Je sechs mit BTS verdünnte Ejakulate aus 13 Besamungstationen (n=78 Ejakulate)<br />
wurden wie folgt untersucht:<br />
- Membranintegrität (Plasma- und Akrosommembran) mittels<br />
Durchflusszytometrie nach 24 h und 96 h.<br />
- Spermienmotilität mittels computergestützter Spermienanalyse (CASA) nach<br />
24 h und 72 h.<br />
- Kinetik des Calciuminflux mittels Durchflusszytometrie,nach 24 h und 96 h.<br />
Alle verwendeten Geräte und Verbrauchsmaterialen sind in im Anhang dieser Arbeit<br />
aufgelistet. Chemikalien inklusive der Bezugsquellen sowie die Gebrauchslösungen<br />
sind ebenfalls im Anhang aufgeführt.<br />
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