TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover
TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover
III. Material und Methoden Abbildung 6:ELISA: (1): Coaten der Mikrotiter-Platte; (2): Beschichten der Platte mit den zu untersuchenden Proben (=Antigen); (3): Zugabe des Detektions-Antikörper + Substrat; (4): Zugabe der Stopplösung und Farbumschlag In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe für Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover wurde ein Sandwich-ELISA zur Bestimmung von bovinem Immunglobulin G1 und G2 sowie IgM verwendet (HUSSEN 2012). 3.6 ELISA zur Bestimmung des Gehaltes von IgG1, IgG2 sowie IgM im bovinen Plasma und im Kolostrum Zunächst wurden die Mikrotiterplatten (NUNC-Immuno Plate F96 Maxisorp) mit jeweils 75 µl Primärantikörper und Coating-Puffer pro Well beschichtet. Nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten auf einem Schüttler (Heidolph Titramax 1000) wurden die gecoateten Platten über Nacht bei 4° C im Kühlschrank inkubiert. Im nächsten Schritt wurden die Platten gewaschen. Anschließend wurde der verbliebene Puffer abgeschüttet und die Platten auf mehreren Lagen Zellstoff trocken geklopft. 26
III. Material und Methoden Nun folgte die Belegung der Platten mit den zu messenden Proben. Vor der Herstellung der Verdünnungsreihe für den Immunglobulin-ELISA wurden die Proben bei Raumtemperatur aufgetaut. Die Herstellung einer Verdünnungsreihe ist notwendig, da der ELISA einer Sättigungskinetik folgt. Auch das Lambert-Beer‘sche- Gesetz gilt nur für Extinktionen in einem bestimmten Bereich (≤ 0,01 mol*l -1 ) (OTTO 2011). Somit ist die Aussagekraft des ELISAs bei hohen Antigenkonzentrationen eingeschränkt. Mittels einer Verdünnungsreihe kann ein Bereich gefunden werden, in dem belastbare Messungen durchführbar sind. Anschließend wurden die Proben durchmischt und mit einer Pipettenspitze die oft schon mit bloßem Auge sichtbaren Fibrinkoagula entfernt. Im Folgenden wurden die Proben bei 2383 g für 6 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert (Labofuge 400, Heraeus, Rotortyp: 8172). Nach Titrationsversuchen zur Ermittlung der optimalen optischen Dichten (ODs) bei niedrigen Hintergrundwerten wurde eine Konzentration von 1 μg/ml sowohl für den Primärantikörper als auch für den Detektionsantikörper gewählt. Die idealen Verdünnungen, bei denen eine optimale Abstufung der ODs zu erkennen war, lagen zwischen 1x10 5 und 3x10 7 (Tabelle 5). Jede Probe wurde mit jeweils 75 µl/Well mit jeweils vier Verdünnungen/Probe im Doppelansatz aufgetragen (Tabelle 5). Auf jede Platte wurde außerdem das Referenzserum (Tabelle 9) im Doppelansatz aufgetragen. Die Platten wurden nun für eine Stunde auf einem Schüttler inkubiert und im Anschluss erneut gewaschen. Nach dem Trockenklopfen der Platten wurden sie mit 75 µl Detektionsantikörper/Well (Tabelle 9) beschichtet. Es folgte wiederum eine 45-minütige Inkubation auf dem Schüttler. Nach dem darauf folgenden Waschschritt wurden 75 µl einer Tetramethylbenzindin(TMB)-haltigen Substratlösung (6,24 mM/*l -1 in DMSO) auf die Platten gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 15 – 20 Minuten bei Raumtemperatur unter Ausschluss von Tageslicht kam es aufgrund der Bildung von Enzym-Substrat- Komplexen zwischen der Meerrettich-Peroxidase und dem TMB zu einem blauen Farbumschlag. Zum Stoppen der Reaktion wurden 50 µl 1 N H 2 SO 4 auf die Platte pipettiert, was zu einem gelben Farbumschlag führte. Die Farbintensität wurde in einem Plattenphotometer (ELISA-Reader Dynatech MR600 mit 2/86-PC und Seikosh- Nadeldrucker) bei einer Wellenlänge von 450 nm (Testfilter) und 630 nm 27
- Seite 1 und 2: Tierärztliche Hochschule Hannover
- Seite 3: Für Mama und Papa
- Seite 6 und 7: Inhaltsverzeichnis 4.1.4 Verlauf vo
- Seite 8 und 9: Abkürzungsverzeichnis kDa Lam. Mg
- Seite 10 und 11: Abbildungsverzeichnis Abbildungsver
- Seite 12 und 13: Tabellenverzeichnis Tabellenverzeic
- Seite 14 und 15: I. Einleitung Fettmobilisierung hab
- Seite 16 und 17: I. Einleitung Da die Leber das prim
- Seite 18 und 19: I. Einleitung 1.2 Supplementierung
- Seite 20 und 21: I. Einleitung effektive zellvermitt
- Seite 22 und 23: I. Einleitung IgG1 ist das vorherrs
- Seite 24 und 25: I. Einleitung 1.5 Verhalten der Imm
- Seite 26 und 27: I. Einleitung BARRINGTON et al. (19
- Seite 28 und 29: I. Einleitung Konzentrationen im Se
- Seite 30 und 31: II. Fragestellung II. FRAGESTELLUNG
- Seite 32 und 33: III. Material und Methoden Krankhei
- Seite 34 und 35: III. Material und Methoden 10 g tra
- Seite 36 und 37: III. Material und Methoden 3.4 Milc
- Seite 40 und 41: III. Material und Methoden (Referen
- Seite 42 und 43: III. Material und Methoden In den f
- Seite 44 und 45: IgG1 [mg*ml -1 ] IV. Ergebnisse Da
- Seite 46 und 47: IgM [mg*ml -1 ] IV. Ergebnisse 4.1.
- Seite 48 und 49: IgM [mg*ml -1 ] IgG2 [m g*m l -1 ]
- Seite 50 und 51: IgG2 [mg*ml -1 ] IV. Ergebnisse 25
- Seite 52 und 53: Energiebilanz [mJ] IV. Ergebnisse I
- Seite 54 und 55: FCM [kg] IV. Ergebnisse 4.5 Milchle
- Seite 56 und 57: [mg*ml -1 ] IV. Ergebnisse Für die
- Seite 58 und 59: IgM [mg*ml -1 ] IgG2 [mg*ml -1 ] IV
- Seite 60 und 61: IgG2 [mg*ml -1 ] IV. Ergebnisse Fü
- Seite 62 und 63: V. Diskussion V. DISKUSSION 5.1 Imm
- Seite 64 und 65: V. Diskussion ± 11,6 mg*ml -1 acht
- Seite 66 und 67: V. Diskussion In der vorliegenden S
- Seite 68 und 69: V. Diskussion 5.1.2 IgM-Bestimmung
- Seite 70 und 71: V. Diskussion plötzlichen Anstieg
- Seite 72 und 73: V. Diskussion 5.2 Abhängigkeit der
- Seite 74 und 75: V. Diskussion Allerdings stammten i
- Seite 76 und 77: V. Diskussion 5.5.1 Abhängigkeit d
- Seite 78 und 79: V. Diskussion 5.6 Immunglobulinbest
- Seite 80 und 81: VI. Zusammenfassung Verlauf von IgG
- Seite 82 und 83: VII. Summary Dietary treatments had
- Seite 84 und 85: VIII. Literaturverzeichnis BLAKEMOR
- Seite 86 und 87: VIII. Literaturverzeichnis CURTAIN,
III. Material und Methoden<br />
Nun folgte die Belegung der Platten mit den zu messenden Proben. Vor der<br />
Herstellung der Verdünnungsreihe für den Immunglobulin-ELISA wurden die Proben<br />
bei Raumtemperatur aufgetaut. Die Herstellung einer Verdünnungsreihe ist<br />
notwendig, da der ELISA einer Sättigungskinetik folgt. Auch das Lambert-Beer‘sche-<br />
Gesetz gilt nur für Extinktionen in einem bestimmten Bereich (≤ 0,01 mol*l -1 ) (OTTO<br />
2011). Somit ist die Aussagekraft des ELISAs bei hohen Antigenkonzentrationen<br />
eingeschränkt. Mittels einer Verdünnungsreihe kann ein Bereich gefunden werden, in<br />
dem belastbare Messungen durchführbar sind.<br />
Anschließend wurden die Proben durchmischt und mit einer Pipettenspitze die oft<br />
schon mit bloßem Auge sichtbaren Fibrinkoagula entfernt. Im Folgenden wurden die<br />
Proben bei 2383 g für 6 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert (Labofuge 400,<br />
Heraeus, Rotortyp: 8172).<br />
Nach Titrationsversuchen zur Ermittlung der optimalen optischen Dichten (ODs) bei<br />
niedrigen Hintergrundwerten wurde eine Konzentration von 1 μg/ml sowohl für den<br />
Primärantikörper als auch für den Detektionsantikörper gewählt. Die idealen<br />
Verdünnungen, bei denen eine optimale Abstufung der ODs zu erkennen war, lagen<br />
zwischen 1x10 5 und 3x10 7 (Tabelle 5).<br />
Jede Probe wurde mit jeweils 75 µl/Well mit jeweils vier Verdünnungen/Probe im<br />
Doppelansatz aufgetragen (Tabelle 5). Auf jede Platte wurde außerdem das<br />
Referenzserum (Tabelle 9) im Doppelansatz aufgetragen. Die Platten wurden nun für<br />
eine Stunde auf einem Schüttler inkubiert und im Anschluss erneut gewaschen. Nach<br />
dem Trockenklopfen der Platten wurden sie mit 75 µl Detektionsantikörper/Well<br />
(Tabelle 9) beschichtet.<br />
Es folgte wiederum eine 45-minütige Inkubation auf dem Schüttler. Nach dem darauf<br />
folgenden Waschschritt wurden 75 µl einer Tetramethylbenzindin(TMB)-haltigen<br />
Substratlösung (6,24 mM/*l -1 in DMSO) auf die Platten gegeben.<br />
Nach einer Inkubationszeit von 15 – 20 Minuten bei Raumtemperatur unter<br />
Ausschluss von Tageslicht kam es aufgrund der Bildung von Enzym-Substrat-<br />
Komplexen zwischen der Meerrettich-Peroxidase und dem TMB zu einem blauen<br />
Farbumschlag.<br />
Zum Stoppen der Reaktion wurden 50 µl 1 N H 2 SO 4 auf die Platte pipettiert, was zu<br />
einem gelben Farbumschlag führte. Die Farbintensität wurde in einem<br />
Plattenphotometer (ELISA-Reader Dynatech MR600 mit 2/86-PC und Seikosh-<br />
Nadeldrucker) bei einer Wellenlänge von 450 nm (Testfilter) und 630 nm<br />
27
Change language