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III. Material und Methoden Abbildung 6:ELISA: (1): Coaten der Mikrotiter-Platte; (2): Beschichten der Platte mit den zu untersuchenden Proben (=Antigen); (3): Zugabe des Detektions-Antikörper + Substrat; (4): Zugabe der Stopplösung und Farbumschlag In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe für Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover wurde ein Sandwich-ELISA zur Bestimmung von bovinem Immunglobulin G1 und G2 sowie IgM verwendet (HUSSEN 2012). 3.6 ELISA zur Bestimmung des Gehaltes von IgG1, IgG2 sowie IgM im bovinen Plasma und im Kolostrum Zunächst wurden die Mikrotiterplatten (NUNC-Immuno Plate F96 Maxisorp) mit jeweils 75 µl Primärantikörper und Coating-Puffer pro Well beschichtet. Nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten auf einem Schüttler (Heidolph Titramax 1000) wurden die gecoateten Platten über Nacht bei 4° C im Kühlschrank inkubiert. Im nächsten Schritt wurden die Platten gewaschen. Anschließend wurde der verbliebene Puffer abgeschüttet und die Platten auf mehreren Lagen Zellstoff trocken geklopft. 26
III. Material und Methoden Nun folgte die Belegung der Platten mit den zu messenden Proben. Vor der Herstellung der Verdünnungsreihe für den Immunglobulin-ELISA wurden die Proben bei Raumtemperatur aufgetaut. Die Herstellung einer Verdünnungsreihe ist notwendig, da der ELISA einer Sättigungskinetik folgt. Auch das Lambert-Beer‘sche- Gesetz gilt nur für Extinktionen in einem bestimmten Bereich (≤ 0,01 mol*l -1 ) (OTTO 2011). Somit ist die Aussagekraft des ELISAs bei hohen Antigenkonzentrationen eingeschränkt. Mittels einer Verdünnungsreihe kann ein Bereich gefunden werden, in dem belastbare Messungen durchführbar sind. Anschließend wurden die Proben durchmischt und mit einer Pipettenspitze die oft schon mit bloßem Auge sichtbaren Fibrinkoagula entfernt. Im Folgenden wurden die Proben bei 2383 g für 6 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert (Labofuge 400, Heraeus, Rotortyp: 8172). Nach Titrationsversuchen zur Ermittlung der optimalen optischen Dichten (ODs) bei niedrigen Hintergrundwerten wurde eine Konzentration von 1 μg/ml sowohl für den Primärantikörper als auch für den Detektionsantikörper gewählt. Die idealen Verdünnungen, bei denen eine optimale Abstufung der ODs zu erkennen war, lagen zwischen 1x10 5 und 3x10 7 (Tabelle 5). Jede Probe wurde mit jeweils 75 µl/Well mit jeweils vier Verdünnungen/Probe im Doppelansatz aufgetragen (Tabelle 5). Auf jede Platte wurde außerdem das Referenzserum (Tabelle 9) im Doppelansatz aufgetragen. Die Platten wurden nun für eine Stunde auf einem Schüttler inkubiert und im Anschluss erneut gewaschen. Nach dem Trockenklopfen der Platten wurden sie mit 75 µl Detektionsantikörper/Well (Tabelle 9) beschichtet. Es folgte wiederum eine 45-minütige Inkubation auf dem Schüttler. Nach dem darauf folgenden Waschschritt wurden 75 µl einer Tetramethylbenzindin(TMB)-haltigen Substratlösung (6,24 mM/*l -1 in DMSO) auf die Platten gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 15 – 20 Minuten bei Raumtemperatur unter Ausschluss von Tageslicht kam es aufgrund der Bildung von Enzym-Substrat- Komplexen zwischen der Meerrettich-Peroxidase und dem TMB zu einem blauen Farbumschlag. Zum Stoppen der Reaktion wurden 50 µl 1 N H 2 SO 4 auf die Platte pipettiert, was zu einem gelben Farbumschlag führte. Die Farbintensität wurde in einem Plattenphotometer (ELISA-Reader Dynatech MR600 mit 2/86-PC und Seikosh- Nadeldrucker) bei einer Wellenlänge von 450 nm (Testfilter) und 630 nm 27
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Seite 72 und 73: V. Diskussion 5.2 Abhängigkeit der
Seite 74 und 75: V. Diskussion Allerdings stammten i
Seite 76 und 77: V. Diskussion 5.5.1 Abhängigkeit d
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Seite 80 und 81: VI. Zusammenfassung Verlauf von IgG
Seite 82 und 83: VII. Summary Dietary treatments had
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Seite 86 und 87: VIII. Literaturverzeichnis CURTAIN,
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VIII. Literaturverzeichnis HARASZTI
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VIII. Literaturverzeichnis KRUSE, V
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VIII. Literaturverzeichnis MALLARD,
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VIII. Literaturverzeichnis PETERSON
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VIII. Literaturverzeichnis SMITH, K
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IX. Anhang X. ANHANG Verwendete Che
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IX. Anhang Tabelle 9: Verwendete An
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IX. Anhang Tabelle 11: Zusammensetz
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IX. Anhang Tabelle 13: Originaldate
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X. Danksagung VIII. DANKSAGUNG Bere
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X. Danksagung und Privatprobleme) d
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