TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover
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<strong>Tierärztliche</strong> <strong>Hochschule</strong> <strong>Hannover</strong><br />
Konzentrationen der Immunglobuline IgG1, IgG2 und IgM im peripartalen<br />
Zeitraum bei Hochleistungsmilchkühen unter Berücksichtigung der<br />
Energiebilanz sowie der Fütterung mit konjugierten Linolsäuren<br />
INAUGURAL-DISSERTATION<br />
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin<br />
- Doctor medicinae veterinariae -<br />
(Dr. med. vet.)<br />
vorgelegt von<br />
Jana Horn<br />
Bückeburg<br />
<strong>Hannover</strong> 2013
Wissenschaftliche Betreuung:<br />
Prof. Dr. Gerhard Breves<br />
Physiologisches Institut<br />
1. Gutachter: Prof. Dr. Gerhard Breves<br />
2. Gutachter: Prof. Dr. Jürgen Rehage<br />
Tag der mündlichen Prüfung: 15.11.2013<br />
Mit freundlicher Unterstützung der H. Wilhelm Schaumann Stiftung sowie der Jutta<br />
und Georg Bruns-Stiftung
Für Mama und Papa
Inhaltsverzeichnis<br />
INHALTSVERZEICHNIS<br />
Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................ I<br />
I. Einleitung ................................................................................................................. 1<br />
1.1 Der Stoffwechsel der Milchkuh im peripartalen Zeitraum .................................. 1<br />
1.2 Supplementierung der Futterration mit konjugierten Linolsäuren ...................... 6<br />
1.3 Das Immunsystem ............................................................................................. 7<br />
1.4 Immunglobuline des Rindes .............................................................................. 9<br />
1.4.1 Immunglobulin G ......................................................................................... 9<br />
1.4.2 Immunglobulin M ....................................................................................... 11<br />
1.5 Verhalten der Immunglobuline im peripartalen Zeitraum ................................. 12<br />
1.6 Immunisierung des neu geborenen Kalbes ..................................................... 15<br />
II. Fragestellung ........................................................................................................ 18<br />
III. Material und Methoden ........................................................................................ 19<br />
3.1 Tiere ................................................................................................................ 19<br />
3.2 Fütterung ......................................................................................................... 20<br />
3.3 Blutprobenentnahme ....................................................................................... 23<br />
3.4 Milchleistung, Milchprobenentnahme und -aufbereitung ................................. 24<br />
3.5 Bestimmung von Immunglobulin-Isotypen mittels ELISA ............................... 25<br />
3.6 ELISA zur Bestimmung des Gehaltes von IgG1, IgG2 sowie IgM im bovinen<br />
Plasma und im Kolostrum ..................................................................................... 26<br />
3.6 Statistische Auswertung .................................................................................. 29<br />
IV. Ergebnisse .......................................................................................................... 31<br />
4.1 Verlauf der Plasma-Immunglobuline im peripartalen Zeitraum ........................ 31<br />
4.1.1 Verlauf von Gesamt-IgG im Plasma .......................................................... 31<br />
4.1.2 Verlauf von IgG1 im Plasma...................................................................... 32<br />
4.1.3 Verlauf von IgG2 im Plasma...................................................................... 33
Inhaltsverzeichnis<br />
4.1.4 Verlauf von IgM im Plasma ....................................................................... 34<br />
4.2 Verlauf der Immunglobuline in Abhängigkeit der Laktationszahl .................. 35<br />
4.3 Verlauf der Immunglobuline in Abhängigkeit der Fütterung ......................... 37<br />
4.4 Energiebilanz (EB) ....................................................................................... 39<br />
4.4.1 Zusammenhang zwischen Energiebilanz und Immunglobulingehalt im<br />
Plasma ............................................................................................................... 40<br />
4.5 Milchleistung ................................................................................................ 42<br />
4.6 Transfer der Plasma-Immunglobuline ins Kolostrum.................................... 43<br />
4.7 Aufnahme kolostraler Immunglobuline durch das Kalb ................................ 47<br />
V. Diskussion ............................................................................................................ 50<br />
5.1 Immunglobulinbestimmung im Plasma ............................................................ 50<br />
5.1.1 IgG-Bestimmung im Plasma...................................................................... 51<br />
5.1.2 IgM-Bestimmung im Plasma ..................................................................... 56<br />
5.2 Abhängigkeit der Ig-Plasmakonzentrationen von der Laktationszahl .............. 60<br />
5.3 Abhängigkeit der Ig-Plasmakonzentrationen von der Fütterung ...................... 60<br />
5.4 Abhängigkeit der Ig-Plasmakonzentrationen von der Energiebilanz ............... 62<br />
5.5 Immunglobulinbestimmung im Kolostrum ........................................................ 63<br />
5.5.1 Abhängigkeit der Immunglobulinkonzentrationen von der Laktationszahl . 64<br />
5.6 Immunglobulinbestimmung im Plasma der Kälber .......................................... 66<br />
VI. Zusammenfassung .............................................................................................. 67<br />
VII. Summary ............................................................................................................ 69<br />
VIII. Literaturverzeichnis ............................................................................................... i<br />
IX. ANHANG ............................................................................................................... a<br />
Verwendete Chemikalien ........................................................................................ a<br />
Originaldaten ......................................................................................................... 71<br />
X. Danksagung ......................................................................................................... 71
Abkürzungsverzeichnis<br />
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS<br />
a.p.<br />
BHB<br />
Ca<br />
CLA<br />
Co<br />
Cu<br />
DMSO<br />
EB<br />
ECM<br />
ELISA<br />
FCM<br />
FFS<br />
FPTA<br />
H 2 SO 4<br />
I<br />
Ig<br />
IFN-<br />
IGF<br />
IL-<br />
IU<br />
ante partum<br />
β-Hydroxybutyrat<br />
Kalzium<br />
konjugierte Linolsäuren<br />
Cobald<br />
Kupfer<br />
Dimethylsulfoxid<br />
Energiebilanz<br />
energy corrected milk<br />
Enzyme linked immunosorband assay<br />
fat corrected milk<br />
freie Fettsäuren<br />
failure of passive transfer<br />
Schwefelsäure<br />
Jod<br />
Immunglobulin<br />
Interferon<br />
Insulin-like Growth Factor<br />
Interleukin<br />
international Units (internationale Einheiten)<br />
I
Abkürzungsverzeichnis<br />
kDa<br />
Lam.<br />
Mg<br />
MHC<br />
Mn<br />
mRNA<br />
Na<br />
NADPH<br />
NEB<br />
NEL<br />
n.s.<br />
OD<br />
P<br />
PBMC<br />
pIgR<br />
PGF<br />
PMN<br />
p.p.<br />
RER<br />
Se<br />
SEM<br />
sRid<br />
TGF<br />
Kilo-Dalton<br />
Lamina<br />
Magnesium<br />
major histocompatibility complex<br />
Mangan<br />
messenger RNA<br />
Natrium<br />
Nikotinamid-Adenindinukleotid-Phosphat<br />
negative Energiebilanz<br />
Netto-Energie Laktation<br />
nicht signifikant<br />
optische Dichte<br />
Phosphat<br />
periphere mononukleäre Zellen<br />
polymerischer Immunglobulinrezeptor<br />
Platelet Growth Factor<br />
polymorphkernige Monozyten<br />
post partum<br />
raues endoplasmatisches Retikulum<br />
Selen<br />
Standardfehler<br />
single radial immunodiffusion<br />
Transforming Growth Factor<br />
II
Abkürzungsverzeichnis<br />
Th-Zellen<br />
TMB<br />
TNF-<br />
T<br />
T-Helferzellen<br />
Tetramethylbenzidin<br />
Tumornekrosefaktor<br />
Trockensubstanz<br />
V. Vena<br />
Zn<br />
Zink<br />
III
Abbildungsverzeichnis<br />
Abbildungsverzeichnis<br />
Abbildung 1: Molekularstruktur von Immunglobulin G............................................... 10<br />
Abbildung 2: Molekularstruktur von Immunglobulin M .............................................. 11<br />
Abbildung 3: Transport der Immunglobuline durch die Epithelzelle .......................... 13<br />
Abbildung 4: Übersicht über die Laktationsanzahl .................................................... 19<br />
Abbildung 5: Übersicht über die Probenentnahmen ................................................. 23<br />
Abbildung 6:ELISA ................................................................................................... 26<br />
Abbildung 7: Verlauf von Plasma-Gesamt-IgG bei Milchkühen der Rasse Holstein-<br />
Friesian im peripartalen Zeitraum ............................................................................. 31<br />
Abbildung 8: Verlauf von Plasma-IgG1 bei Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian<br />
im peripartalen Zeitraum ........................................................................................... 32<br />
Abbildung 9: Verlauf von Plasma-IgG2 bei Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian<br />
im peripartalen Zeitraum ........................................................................................... 33<br />
Abbildung 10: Verlauf von Plasma-IgM bei Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian<br />
im peripartalen Zeitraum ........................................................................................... 34<br />
Abbildung 11: IgG1 im Plasma von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in<br />
Abhängigkeit der Laktationszahl. .............................................................................. 35<br />
Abbildung 12: IgG2 im Plasma von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in<br />
Abhängigkeit von der Laktationszahl. ....................................................................... 36<br />
Abbildung 13: IgM im Plasma von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in<br />
Abhängigkeit von der Laktationszahl. ....................................................................... 36<br />
Abbildung 14: IgG1 im Plasma von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in<br />
Abhängigkeit der Fütterung unter Berücksichtigung der Laktation. .......................... 37<br />
Abbildung 15: IgG2 im Plasma von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in<br />
Abhängigkeit der Fütterung unter Berücksichtigung der Laktation. .......................... 38<br />
Abbildung 16: IgM im Plasma von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in<br />
Abhängigkeit der Fütterung. .................................................................................... 39<br />
Abbildung 17: Verlauf der EB von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian über den<br />
gesamten Versuchszeitraum .................................................................................... 39<br />
Abbildung 18: Verlauf der EB von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in<br />
Abhängigkeit der Laktationsnummer. ....................................................................... 40<br />
IV
Abbildungsverzeichnis<br />
Abbildung 19: Übersicht über die Korrelationen zwischen EB und<br />
Immunglobulinspiegel im Plasma von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian an<br />
Tag -7 und Tag 7 für alle untersuchten Isotypen (IgG1, IgG2 und IgM). .................. 41<br />
Abbildung 20: Verlauf der Milchleistung von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian<br />
über den Versuchszeitraum. ..................................................................................... 42<br />
Abbildung 21: Verlauf der Milchleistung von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian<br />
in Abhängigkeit der Laktationszahl. .......................................................................... 43<br />
Abbildung 22: Konzentrationen von IgG1, IgG2 und IgM im Kolostrum von<br />
Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian. ................................................................. 44<br />
Abbildung 23: Gehalt von Gesamt IgG im Kolostrum von Milchkühen der Rasse<br />
Holstein-Friesian in Abhängigkeit der Laktationszahl.. ............................................. 45<br />
Abbildung 24: Gehalt von IgG1 im Kolostrum von Milchkühen der Rasse Holstein-<br />
Friesian in Abhängigkeit von der Laktationszahl. ...................................................... 45<br />
Abbildung 25: Gehalt von IgG2 im Kolostrum von Milchkühen der Rasse Holstein-<br />
Friesian in Abhängigkeit von der Laktationszahl. ...................................................... 46<br />
Abbildung 26: Gehalt von IgM im Kolostrum von Milchkühen der Rasse Holstein-<br />
Friesian in Abhängigkeit von der Laktationszahl. ...................................................... 46<br />
Abbildung 27: IgG1-Plasmakonzentrationen von Kälbern der Rasse Holstein-Friesian<br />
................................................................................................................................. 47<br />
Abbildung 28: IgG2-Plasmakonzentrationen von Kälbern der Rasse Holstein-Friesian<br />
................................................................................................................................. 48<br />
Abbildung 29: IgM-Plasmkonzentrationen von Kälbern der Rasse Holstein-<br />
Friesian………………………………………………………………………………………49<br />
V
Tabellenverzeichnis<br />
Tabellenverzeichnis<br />
Tabelle 1: Normales und krankhaftes Lipomobilisationsgeschehen bei der Milchkuh 4<br />
Tabelle 2: Verteilung der an Mastitis erkrankten Versuchstiere innerhalb der<br />
unterschiedlichen Fütterungsgruppen....................................................................... 20<br />
Tabelle 3: Zusammensetzung der Futtermittel (%). ................................................. 21<br />
Tabelle 4: Fütterungsdesign. .................................................................................... 22<br />
Tabelle 5: Übersicht der aufgetragenen Verdünnungen ........................................... 28<br />
Tabelle 6: Vergleich zwischen Literaturdaten und eigenen Messungen der<br />
Immunglobulinspiegel im Plasma a.p. ...................................................................... 59<br />
Tabelle 7: Vergleich zwischen Literaturdaten und eigenen Messungen der<br />
Immunglobulinspiegel im Kolostrum ......................................................................... 65<br />
Tabelle 8: Durchführung ELISA .................................................................................. b<br />
Tabelle 9: Verwendete Antikörper ............................................................................... c<br />
Tabelle 10: Übersicht über verwendete Lösungen ..................................................... d<br />
Tabelle 11: Zusammensetzung der verwendeten Puffer ............................................ e<br />
Tabelle 12: Originaldaten IgG1 (Plasma).................................................................. 71<br />
Tabelle 13: Originaldaten IgG2 (Plasma).................................................................. 72<br />
Tabelle 14: Originaldaten IgM (Plasma) ................................................................... 73<br />
Tabelle 15: Originaldaten IgG1 (Plasma) und EB (Tier 1 bis 36) .............................. 74<br />
Tabelle 16: Originaldaten IgG1 (Plasma) und EB (Tier 37 bis 66) ............................ 75<br />
Tabelle 17: Originaldaten IgG2 (Plasma) und EB (Tier 1 bis 39) .............................. 76<br />
Tabelle 18: Originaldaten IgG2 (Plasma) und EB (Tier 40 bis 66) ............................ 77<br />
Tabelle 19: Originaldaten IgM (Plasma) und EB ....................................................... 78<br />
Tabelle 20: Originaldaten Kolostrum (Tier 1 bis 59) ................................................. 79<br />
Tabelle 21: Originaldaten Kolostrum (Tier 60 bis 66) ............................................... 80<br />
Tabelle 22: Originaldaten Kälber IgG1 (Plasma) ...................................................... 80<br />
Tabelle 23: Originaldaten Kälber IgG2 (Plasma) ...................................................... 81<br />
Tabelle 24: Originaldaten Plasma Kälber IgM (Plasma) ........................................... 81<br />
IV
I. Einleitung<br />
I. EINLEITUNG<br />
1.1 Der Stoffwechsel der Milchkuh im peripartalen Zeitraum<br />
Durch gezielte züchterische Ansätze sowie durch stetige Verbesserung von Haltung<br />
und Fütterung haben sich die Laktationsleistungen in der modernen Milchviehhaltung<br />
in den vergangenen fünf Jahrzehnten mehr als verdoppelt. JANINHOFF (2012) gibt<br />
in seiner Wirtschaftlichkeitsanalyse von 2009 – 2012 an, dass für eine rentable<br />
Milchwirtschaft Jahresleistungen von 8.000 bis 9.000 kg/Jahr erforderlich sind.<br />
Die Milchleistung weist während des Laktationszyklus einen charakteristischen<br />
Verlauf auf. Zu Beginn der Laktation steigt sie stark an, wobei maximale<br />
Tagesleistungen in der 7.-14. Laktationswoche erreicht werden. In dieser Zeit ist mit<br />
etwa 25 kg/Tag die maximale Trockenmasseaufnahmekapazität ausgeschöpft<br />
(BREVES u. RODEHUTSCORD 2007). Bei sehr hoher Milchleistung müsste das Tier<br />
zur Bedarfsdeckung aufgrund der begrenzten Aufnahmekapazität eine<br />
Energiekonzentration von mehr als 8 MJ Nettoenergie Laktation (NEL) aufnehmen.<br />
Diese hohen NEL-Konzentrationen können jedoch nicht erreicht werden, da über<br />
einen ausreichend hohen Anteil von Grundfutter auch die Strukturwirksamkeit und<br />
damit die Wiederkäuergerechtigkeit der Ration sichergestellt werden muss<br />
(INGVARTSEN u. ANDERSEN 2000; PETERSON et al. 2005; BREVES u.<br />
RODEHUTSCORD 2007).<br />
Neben den Grenzen der Energiedichte zeigt auch der freiwillige Verzehr im<br />
peripartalen Zeitraum charakteristische Veränderungen. PETERSON et al. (2005)<br />
konnten zeigen, dass sich in den letzten vier Wochen a.p. die<br />
Trockenmasseaufnahme um bis zu 50% reduzierte und erst zum Ende der vierten<br />
Laktationswoche eine Trockenmasseaufnahme von 22-24 kg/Tag erreicht wurde. Der<br />
Übergang von der Spätträchtigkeit zur Frühlaktation ist der Zeitpunkt der niedrigsten<br />
Trockenmasseaufnahme. In dieser Periode ist somit die Aufnahme der benötigten<br />
Energiemengen mit dem Futter nicht möglich.<br />
Folglich kommt es peripartal zur Ausprägung einer negativen Energiebilanz (NEB)<br />
mit starker Mobilisation von Körperfett.<br />
Die Auswahl der Grundfuttermittel kann bei hoher Leistung zwar noch einen Einfluss<br />
auf die NEL-Konzentration, die Energieaufnahme und damit auf das Ausmaß der<br />
1
I. Einleitung<br />
Fettmobilisierung haben, dennoch ist die Entwicklung einer negativen Energiebilanz<br />
unvermeidlich. Diese kann unter Umständen bis zu 12 Wochen andauern (BULANG<br />
et al. 2006).<br />
Der Abbau von Körpersubstanz geht unter anderem mit der Bereitstellung von<br />
Metaboliten für die Milchfettsynthese einher. Allerdings kann eine hohe Milchleistung<br />
auch bei moderater Mobilisierung von Körperreserven erzielt werden (LEE u. KIM<br />
2006; DUSKE et al. 2009; HAMMON et al. 2009; VAN DORLAND et al. 2009). Die<br />
Mechanismen, die dieser unterschiedlichen Anpassungsfähigkeit zugrunde liegen,<br />
sind zum jetzigen Zeitpunkt noch unbekannt.<br />
Der bei NEB vorliegende katabole Zustand führt zu charakteristischen<br />
Veränderungen hormoneller und chemischer Parameter. So kommt es zu einer<br />
Abnahme der Plasmakonzentrationen von Insulin, IGF-1, Leptin und Glukose und zu<br />
einer Zunahme der Plasmakonzentrationen von nicht-veresterten Fettsäuren (FFS)<br />
und β-Hydroxybutyrat (BHB) (BUTLER 2003).<br />
Gerade besonders hoch leistende Tiere befinden sich nun in einer labilen<br />
metabolischen Stoffwechsellage, die bei zusätzlichen peripartalen Belastungen wie<br />
Futterwechsel, Bewegungsmangel, Klimaschwankungen, Schwergeburten oder<br />
Vorerkrankungen (Labmagenverlagerung oder Mastitis) schnell entgleisen kann.<br />
(DIRKSEN et al. 2006). Die genannten Faktoren führen zu verminderter<br />
Futteraufnahme. Um den Energiebedarf für Erhaltung und Laktation decken zu<br />
können, muss der Organismus auf eigene Reserven zurückgreifen.<br />
Zur Energiegewinnung wird dem Intermediärstoffwechsel vermehrt Glukose<br />
entzogen. Die entstandene Hypoglykämie soll über eine vermehrte Glukoneogenese<br />
ausgeglichen werden. Dieses entzieht dem Citratzyklus jedoch Oxalactetat, das nun<br />
in der Leber als Reaktionspartner für die aus dem Fettstoffwechsel anfallenden C2-<br />
Bruchstücke fehlt. Bei einer starken Anflutung freier Fettsäuren in der Leber und<br />
damit vermehrt stattfindender β-Oxidation entstehen aus dem biologisch aktivierten<br />
C2-Bruchstück Acetyl-Coenzym A nun sehr schnell Ketonkörper. Dieses geschieht<br />
gerade in der frühen Laktation in großem Umfang. Daher besteht die Gefahr der<br />
Entwicklung einer Ketose. Der Begriff Ketose beschreibt die Akkumulation von<br />
Ketonkörpern (β-Hydroxy-Butyrat, Acetoazetat und Aceton) in den<br />
Körperflüssigkeiten. Überschreitet das Ausmaß der Bildung der Ketonkörper<br />
dasjenige von Verbrauch und Ausscheidung, kann es zu Symptomen wie<br />
Gewichtsabnahme, Milchrückgang und zu einer Beeinträchtigung der Fruchtbarkeit<br />
2
I. Einleitung<br />
kommen. Die Grenzwerte für eine subklinische Ketose liegen dabei bei 0,7 mmol*l -1<br />
BHB für trockenstehende Kühe bzw. 1,4 mmol*l -1 BHB für frisch abgekalbte Kühe<br />
(DIRKSEN et al. 2006).<br />
Der Überschuss an nicht benötigten Fettsäuren wird v.a. bei überkonditionierten<br />
Tieren in der Leber gespeichert (MCNAMARA 2000). Die Hyperlipomobilisation kann<br />
zu einer die Funktion der Leber erheblich einschränkenden Hepatosteatose führen.<br />
Sind mehr als 30 % des Lebergewebes betroffen, kommt es zu einer Verschiebung<br />
des Gleichgewichts zwischen lipostabilisierenden und damit antiautoperoxidativen<br />
Substanzen und eingelagertem Fett (DIRKSEN et al. 2006). Die Gefahr der<br />
Membranschädigungen nimmt damit zu. Da überbelastetes Lebergewebe nicht mehr<br />
ausreichend Eiweiß produziert, kommt es zu einem Mangel an Apolipoprotein,<br />
welches für die Ausschleusung resynthetisierter Triglyzeride aus der Leber benötigt<br />
wird. Dies wiederum führt zu einer zunehmenden Hepatosteatose (DIRKSEN et al.<br />
2006), die mit reduziertem Gesundheitsstatus, reduzierter Produktivität und<br />
verminderter Fruchtbarkeit in Verbindung gebracht werden kann (WENSING et al.<br />
1997).<br />
Die Inzidenz einer Hepatosteatose ist eng assoziiert mit der Inzidenz anderer<br />
metabolischer Erkrankungen, v.a. Ketose und Labmagenverlagerung. Die<br />
Akkumulation von Lipiden in der Leber führt ebenfalls zu einer stärkeren Ausprägung<br />
und Schwere infektiöser Erkrankungen wie Mastitis (HILL et al. 1985) und Metritis<br />
(HARASZTI et al. 1982). Auch fieberhafte Allgemeininfektionen können gehäuft<br />
vorkommen (DIRKSEN et al. 2006). Durch lokale Durchblutungsstörungen kommt es<br />
zur Entstehung von Klauenerkrankungen, v.a. zu Klauenrehe (ONYIRO et al. 2008;<br />
KUJALA et al. 2010). Eine herabgesetzte Kontraktionsfähigkeit der Muskulatur kann<br />
zu Wehenschwäche sowie Puerperal- und Peristaltikstörungen (STENGÄRDE et al.<br />
2012) führen.<br />
Des Weiteren werden bei Kühen, die eine ausgeprägte Fettleber besitzen,<br />
schlechtere Fruchtbarkeitsergebnisse erzielt (LÓPEZ-GATIUS et al. 2005; KAFI u.<br />
MIRZAEI 2010). Die herabgesetzte Immunität und Kontraktilität begünstigen eine<br />
gestörte Involution und Entzündungen der Gebärmutter. Außerdem führt der<br />
Energiemangel zu einem verzögerten Anlaufen der Ovaraktivität. Niedrige<br />
Konzentrationen an IGF-1, Insulin und Glukose hemmen Follikelwachstum und -<br />
reifung (MARKUSFELD 1987; STEVENSON u. CALL 1988; REIST et al. 2003;<br />
BOSSAERT et al. 2008).<br />
3
I. Einleitung<br />
Da die Leber das primäre Metabolisierungsorgan für Steroidhormone darstellt,<br />
resultiert aus der Steigerung der Leberperfusion eine erhöhte Abbaurate der<br />
Sexualsteroide, die bei unveränderter Syntheserate zu einer Abnahme der<br />
Konzentrationen an Sexualsteroiden im peripheren Plasma führt. Dies wiederum wird<br />
als Ursache einer verminderten Konzeptionsrate, einer verkürzten Oestrusdauer, des<br />
gehäuften Auftretens multipler Ovulationen und einer verminderten Eizellqualität<br />
diskutiert (WILTBANK et al. 2006).<br />
Eine Übersicht über die physiologischen und pathologischen Vorgänge innerhalb des<br />
Lipomobilisationsgeschehens gibt Tabelle 1.<br />
Tabelle 1: Normales und krankhaftes Lipomobilisationsgeschehen bei der Milchkuh (DIRKSEN et al. 2006)<br />
Normales<br />
Lipomobilisationsgeschehen<br />
überwachte, „verhaltene“ Fütterung und<br />
mäßige körperliche Bewegung während<br />
der Trockenstehzeit (< 55 Tage)<br />
Ansammlung mäßiger<br />
Körperfettreserven a.p.<br />
gesundes, ungestörtes Puerperium<br />
gute Milchleistung<br />
gute, allmählich zunehmende Fresslust<br />
Glukoneogenese ↑<br />
normale Lipomobilisationsrate<br />
leichte bis mäßige Leberverfettung<br />
(< 20 %) ohne Funktionsstörung<br />
keine/ subklinische Ketose<br />
normaler abkalbe-/laktationsbedingter<br />
Gewichtsrückgang<br />
normales Einsetzen der Brunst<br />
normale Fruchtbarkeit<br />
Zwischenkalbezeit < 370 Tage<br />
Entgleisung des Energiestoffwechsels<br />
(Lipomobilisationssyndrom)<br />
unkontrollierte, zu energiereiche<br />
Fütterung während der u.U. verlängerten<br />
Trockenstehzeit (> 60 Tage), fehlende<br />
Bewegung<br />
Entwicklung übermäßiger<br />
Körperfettreserven a.p.<br />
peripartale Belastung/ Erkrankung<br />
extrem hohe Milchleistung<br />
Appetitrückgang<br />
Glukoneogenese ↓<br />
überschießende Lipomobilisation<br />
hochgradige Verfettung der Leber<br />
(> 25 %) mit Funktionsstörung<br />
klinisch manifeste Ketose<br />
übermäßiger, auf Lipomobilisation und<br />
Eiweißfreisetzung beruhender, länger<br />
anhaltender Gewichtsrückgang<br />
verzögertes/ schwaches Einsetzen der<br />
Brunst<br />
herabgesetzte Fruchtbarkeit<br />
Zwischenkalbezeit > 380 Tage<br />
Im Gegensatz zu den leistungsbedingten Reproduktionsstörungen gibt es<br />
gegenwärtig keine fundierte Wissensgrundlage, um die Bedeutung der Milchleistung<br />
für das vermehrte Auftreten von infektiös bedingten Erkrankungen zu erklären.<br />
4
I. Einleitung<br />
Allerdings kommt es in der peripartalen Periode zu Veränderungen verschiedener<br />
immunologischer Parameter, die sowohl das angeborene wie auch das adaptive<br />
Immunsystem betreffen.<br />
MEHRZAD et al. (2002) konnten zeigen, dass bei Kühen im peripartalen Zeitraum die<br />
Anzahl an neutrophilen Granulozyten im Blut signifikant reduziert ist. Weiterhin sind<br />
die Adhäsionsfähigkeit und die Migration der Zellen in die Milchdrüse beeinträchtigt.<br />
Interessanterweise weisen diese Zellen eine erhöhte phagozytotische Aktivität auf,<br />
was auf eine verbesserte funktionelle Aktivität schließen lässt. Allerdings zeigen<br />
diese Zellen eine verminderte „respiratory burst“-Fähigkeit, was in einer verminderten<br />
Eliminierungsrate für Bakterien resultiert.<br />
Die Eigenschaften von bovinen Lymphozyten in der peripartalen Periode wurden<br />
bereits von mehreren Arbeitsgruppen untersucht. KEHRLI und GOFF (1989) konnten<br />
beim Rind eine signifikante Reduktion des Vorkommens von T-Lymphozyten im Blut<br />
beschreiben. Funktionelle Studien zeigten weiterhin einen Wechsel von einer T-<br />
Helfer(Th)-1- zu einer Th2-Antwort (KEHRLI u. GOFF 1989). Die bei der Th2-Antwort<br />
produzierten immunregulatorischen Zytokine (v.a. IL-10 und TGF-β) haben nach<br />
einer Infektion die Aufgabe, die immunologische Homöostase wieder herzustellen,<br />
um Schäden am Tier einzugrenzen.<br />
Nachfolgende Arbeiten konnten zeigen, dass einige dieser immunsuppressiven<br />
Effekte einer NEB durch zusätzliche Fütterung hoch energetischer Substrate wie<br />
leicht fermentierbarer Kohlenhydrate umgekehrt werden konnten (STABEL et al.<br />
2003; OHTSUKA et al. 2006).<br />
In einem Tierversuch, in dem jeweils 25 Milchkühe mit einerseits hohen FFS-<br />
Konzentrationen a.p. und starker Fettmobilisation p.p. und andererseits mit niedriger<br />
FFS-Konzentration a.p. und geringer Fettmobilisation p.p. gehalten wurden, konnte<br />
MÖSCH (2011) keinen Einfluss der FFS-Konzentration a.p. bzw. der Fettmobilisation<br />
nach der Geburt auf den Verlauf der Immunglobulin(Ig)G-Konzentration zwischen<br />
dem 8. Tag a.p. und dem 56. Tag p.p. zeigen. Allerdings ist ein starker Anstieg der<br />
FFS-Konzentration zwischen Tag 8 a.p. und Tag 3 p.p. mit einer erniedrigten IgG-<br />
Konzentration an Tag 3 p.p. verbunden (MÖSCH 2011). Die Autorin schloss daraus,<br />
dass eine stark erhöhte FFS-Konzentration zu Beginn der Laktation mit einer<br />
Abnahme der IgG-Konzentration korreliert. Allerdings hatten die Parameter BHB,<br />
Leptin, Rückenfettdicke und IGF-1 keinen signifikanten Einfluss auf die IgG-<br />
Konzentration (MÖSCH 2011)<br />
5
I. Einleitung<br />
1.2 Supplementierung der Futterration mit konjugierten Linolsäuren<br />
Konjugierte Linolsäuren (CLA) sind Isomere der Linolsäure, die u.a. durch mikrobielle<br />
Fermentationsprozesse im Pansen (KEPLER et al. 1966) synthetisiert werden.<br />
Aufgrund ihrer Milchfett-reduzierenden Effekte (BAUMGARD et al. 2000) werden<br />
CLA häufig in Futterrationen für Milchkühe eingemischt. Milchfett macht etwa 50%<br />
der gesamten Milchenergie aus und entspricht somit dem größten Anteil des<br />
Energieverlustes über die Milch (TYRRELL u. REID 1965). Durch eine<br />
Supplementation mit CLAs soll erreicht werden, dass durch die eingesparte Energie<br />
der Ausbildung einer negativen Energiebilanz entgegengewirkt werden kann.<br />
Grundsätzlich haben Fettsäuren die Fähigkeit, Immunantworten durch Veränderung<br />
der Phospholipidzusammensetzung der Immunzellen zu modulieren und auch<br />
nachgeschaltete Signalwege zu beeinflussen (MILES u. CALDER 1998). Die<br />
Fütterung von pflanzlichen oder tierischen Ölen mit hohem Anteil an ungesättigten<br />
Omega-3-Fettsäuren reduziert inflammatorische Reaktionen und die Produktion von<br />
Interleukin (IL)-1, IL-6 und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) in verschiedenen Spezies<br />
(CALDER et al. 2002).<br />
Einige Studien haben bereits gezeigt, dass das bovine Immunsystem sensitiv auf<br />
Fettsäuren reagiert. So konnten LACETERA et al. (2001; 2002) sowohl beim Rind als<br />
auch beim Schaf zeigen, dass hohe Konzentrationen an FFS im Blut oder hohe<br />
Konzentrationen der selben Fettsäuren (Palmitat, Palmitoleat, Stearat, Oleat und<br />
Linoleat) im Kulturmedium mit einer Beeinträchtigung der Lymphozytenantwort auf<br />
Mitogene einhergehen. Der Anstieg der FFS im Blut als Konsequenz der<br />
Lipomobilisation könnte somit ein möglicher Grund für die in der Frühlaktation<br />
bestehende unzureichende Effektivität des Immunsystems während einer negativen<br />
Energiebilanz sein (KEHRLI et al. 2006). Weiterhin konnten THANASAK et al. (2005)<br />
in einer in vitro-Studie zeigen, dass bovine periphere Blutmonozyten (PBMC) in der<br />
Anwesenheit von mehrfach ungesättigten Fettsäuren funktionell beeinträchtigt<br />
werden.<br />
Aufgrund dieser Befunde sind die Auswirkungen einer Fettsäure-supplementierten<br />
Fütterung auf die Immunglobulinfraktionen besonders interessant und sollen in der<br />
vorliegenden Studie untersucht werden.<br />
6
I. Einleitung<br />
1.3 Das Immunsystem<br />
Das Immunsystem besteht aus einer Vielzahl von Zellen und Molekülen, die in der<br />
Lage sind, fremde, in den Organismus eindringende Mikroorganismen zu erkennen<br />
und zu eliminieren. In der Literatur unterscheidet man dabei die angeborene<br />
(unspezifische) Immunität von der erworbenen (spezifischen) Immunität. Rein<br />
funktionell ist diese Unterscheidung allerdings nicht möglich, da beide Systeme eng<br />
zusammenarbeiten.<br />
Das angeborene oder unspezifische Immunsystem ist schnell aktivierbar und dient im<br />
frühen Stadium einer Infektion als primäre Immunabwehr. Die unspezifische Abwehr<br />
wird von Phagozyten wie z.B. polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN)<br />
und Makrophagen gebildet (RAINARD u. RIOLLET 2006).<br />
Makrophagen erkennen, phagozytieren und eliminieren unspezifische<br />
Fremdpathogene. Sie produzieren Zytokine wie IL-1β, IL-6 und TNF-α. Weiterhin<br />
sind sie in der Lage, über den Major Histocompatibility Complex (MHC) Klasse II-<br />
Rezeptor Antigen zu präsentieren und bilden so die Verbindung zwischen<br />
angeborenem und spezifischem Immunsystem (RAINARD u. RIOLLET 2006).<br />
Nach der Einleitung der inflammatorischen Antwort sind die vorherrschenden Zellen<br />
am Infektionsherd v.a. PMN. Die Migration dieser Zellen aus dem Blut zum Ort der<br />
Entzündung wird als Chemotaxis bezeichnet (SURIYASATHAPORN et al. 1999).<br />
Am Entzündungsherd angekommen, phagozytieren sowohl PMN als auch ansässige<br />
Makrophagen eindringende Mikroorganismen und töten sie ab (PAAPE et al. 1991).<br />
Sobald ein Mikroorganismus phagozytiert ist, kommt es in aktivierten Makrophagen<br />
durch die Aktivierung einer NADPH-abhängigen Oxidase zum so genannten<br />
respiratory burst. Die Oxidase katalysiert die Reduktion von Sauerstoff zu einem<br />
hoch reaktiven Sauerstoff-Radikal, das für die aufgenommenen Bakterien hoch<br />
toxisch ist. Nach dem respiratory burst werden die aufgenommenen Bestandteile des<br />
Mikroorganismus über Exozytose ausgeschieden.<br />
Die spezifische Immunität besteht aus Antikörpern, Makrophagen (Antigenpräsentierenden<br />
Zellen) sowie B- und T-Lymphozyten, die spezifische<br />
Mikroorganismen erkennen (SORDILLO et al. 1997). Sie wird bei einer länger<br />
bestehenden oder persistierenden Infektion aktiviert.<br />
T-Zellen können in T-Helferzellen und zytotoxische T-Zellen eingeteilt werden. T-<br />
Helferzellen produzieren Zytokine wie IL-2 und Interferon (IFN)-γ, die für eine<br />
7
I. Einleitung<br />
effektive zellvermittelte Immunantwort entscheidend sind. Zytotoxische T-Zellen<br />
erkennen und eliminieren mit Antigen infizierte Zellen sowie alte oder beschädigte<br />
Immunzellen.<br />
Die B-Lymphozyten differenzieren sich zu Plasmazellen, die Antikörper<br />
(Immunglobuline) wie IgG1, IgG2 oder IgM produzieren oder als Gedächtniszellen<br />
fungieren (SORDILLO et al. 1997).<br />
Sowohl die angeborene als auch die spezifische Immunabwehr haben eine<br />
umfassende Mechanismendiversität. Ihre Interaktion ermöglicht dem Organismus,<br />
zwischen Eigen- und Fremdmolekülen zu unterscheiden.<br />
8
I. Einleitung<br />
1.4 Immunglobuline des Rindes<br />
1.4.1 Immunglobulin G<br />
IgG bildet mit 70-75 % des Gesamtimmunglobulins die im Serum hauptsächlich<br />
vorkommende Immunglobulinklasse und spielt aus diesem Grund eine Hauptrolle in<br />
der Antikörper-vermittelten Immunantwort. Es wird von Plasmazellen in der Niere,<br />
den Lymphknoten und dem Knochenmark produziert und sezerniert.<br />
IgG hat ein Molekulargewicht von 180 kDa und besteht aus zwei identischen leichten<br />
Ketten und zwei identischen schweren γ- Ketten. Durch ihre Anordnung zueinander<br />
entsteht die für Antikörper-Monomere typische Y-Struktur (Abbildung 1) (BUTLER<br />
1983; TIZARD 2004).<br />
Da es das kleinste der Immunglobulinmoleküle ist, kann IgG am leichtesten aus den<br />
Blutgefäßen in das umliegende Gewebe austreten. Dies spielt v.a. im entzündeten<br />
Gewebe bei erhöhter Gefäßpermeabilität eine wichtige Rolle (BUTLER et al. 1972a,<br />
1972b; BUTLER 1983).<br />
IgG bindet z.B. auf Bakterienoberflächen an spezifische Antigene. Die Anwesenheit<br />
der Antikörper auf der Bakterienoberfläche führt zur Agglutination und zur<br />
Opsonierung der Bakterien (CURTAIN et al. 1970).<br />
Man unterscheidet drei Subklassen bovinen IgGs: IgG1, IgG2 und IgG3. Die<br />
konstanten Domänen der Subklassen weisen eine 95%ige Homologie ihrer<br />
Aminosäuresequenzen auf. Die größten Unterschiede kommen dabei in der Hinge-<br />
Region vor. Die Hinge-Region ist der Teil des Moleküls, der die schweren Ketten<br />
über Disulfidbrücken miteinander verbindet und somit die Flexibilität und<br />
Beweglichkeit des gesamten Moleküls bestimmt.<br />
So weist IgG1 im Gegensatz zu IgG2 eine sehr flexible Hinge-Region auf, die aus<br />
216 – 231 Aminosäuren besteht. Die Fab-Fragmente, d.h. die „Arme“ des y-förmigen<br />
Moleküls, können um ihre Symmetrieachse rotieren.<br />
Die Hinge-Region des IgG2-Moleküls besteht aus nur 12 Aminosäuren und vier<br />
Disulfidbrücken und weist somit eine beschränkte Flexibilität auf (TIZARD 2004).<br />
Der unterschiedliche Aufbau der Immunglobulinsubklassen führt zu Unterschieden in<br />
Effektorfunktionen wie Komplementaktivierung und Fc-Rezeptor-Bindung. Die<br />
Subklassen weisen ebenso unterschiedliche biologische Aktivitäten auf.<br />
9
I. Einleitung<br />
IgG1 ist das vorherrschende Immunglobulin in mukösen Sekreten des Rindes<br />
(CURTAIN et al. 1970) und ist sowohl im Kolostrum als auch im Speichel des Rindes<br />
konzentriert. Radioaktive Markerstudien (CURTAIN et al. 1970) haben gezeigt, dass<br />
der größere Anteil dieses Immunglobulins nicht aus dem Plasma stammt, sondern<br />
lokal synthetisiert wird. Immunfluoreszenzstudien weisen darauf hin, dass IgG1 von<br />
lymphoiden Zellen produziert wird, die in der Lam. propria und der Basis der Mikrovilli<br />
in der Schleimhaut des Darm-, des Atem- und Genitaltrakts nachgewiesen werden<br />
konnten. Zusätzlich gibt es einen selektiven Transportmechanismus für IgG1 aus<br />
dem Plasma. Im Gegensatz dazu stammt der größte Anteil des IgG2 in den mukösen<br />
Sekreten aus dem Plasmapool.<br />
Einen weiteren Hinweis auf den selektiven Transport von IgG1 im Vergleich zu IgG2<br />
konnten CURTAIN et al. (1970) in einer Studie mit radioaktiv markierten Antikörpern<br />
liefern. Dort konnte gezeigt werden, dass der Transport und die initiale Eliminierung<br />
von IgG1 in vaginale Sekrete viel schneller verlief als der von IgG2.<br />
Abbildung 1: Molekularstruktur von Immunglobulin G<br />
10
I. Einleitung<br />
1.4.2 Immunglobulin M<br />
IgM wird von Plasmazellen in der Niere, in den Lymphknoten und im Knochenmark<br />
produziert. Es ist mit 5-15% des Gesamtimmunglobulins das am zweithöchsten<br />
konzentrierte Immunglobulin im Blut.<br />
Im Organismus kommt IgM in zwei unterschiedlichen Formen vor: als Monomer, als<br />
Teil des B-Zell-Rezeptors an die Zelloberfläche von B-Lymphozyten gekoppelt, sowie<br />
als im Serum lösliches Pemtamer. Letzteres stellt bei der Konfrontation mit einem<br />
Antigen den vorherrschenden Immunglobulinisotyp der Primärantwort dar. Zwar<br />
spielt IgM auch bei der sekundären Immunantwort eine Rolle, wird aber durch die<br />
dort vorherrschende Dominanz des IgG maskiert (TIZARD 2004).<br />
Das membranale IgM ist ein 180 kDa schweres Immunglobulin-Monomer, welches<br />
auf der B-Zell-Oberfläche als Antigenrezeptor fungiert.<br />
Das sekretorische IgM besteht aus fünf strukturell konventionell aufgebauten 180<br />
kDa-Untereinheiten, die durch Disulfidbrücken in einer zirkulatorischen Form<br />
verbunden sind (Abbildung 2). Das absolute Molekulargewicht der sekretorischen<br />
Form beträgt 900 kDa. Ein kleines Polypeptid, die J-(joining)Kette (15 kDa), verbindet<br />
zwei der Einheiten, um den Kreis zu vervollständigen (BUTLER 1983; TIZARD 2004).<br />
Obwohl nur in geringeren Konzentrationen sezerniert, ist IgM effizienter als IgG, was<br />
Komplementaktivierung, Opsonierung, Virusneutralisation und Agglutination angeht.<br />
Aufgrund ihrer Größe können IgM-Pentamere auch bei akuten Entzündungen i.d.R.<br />
nicht ins Gewebe übertreten (TIZARD 2004).<br />
Abbildung 2: Molekularstruktur von Immunglobulin M<br />
11
I. Einleitung<br />
1.5 Verhalten der Immunglobuline im peripartalen Zeitraum<br />
In den letzten vier bis acht Wochen vor der Abkalbung kommt es beim Rind unter<br />
dem hormonellen Einfluss von Östrogen und Progesteron zu einem starken Abfall<br />
der Serumkonzentrationen von IgG und IgM. Die niedrigsten Serumspiegel werden<br />
dabei um den Geburtszeitpunkt herum erreicht (DETILLEUX et al. 1995; FRANKLIN<br />
et al. 2005). Etwa vier Wochen p.p. sind die Serumkonzentrationen von IgG1 wieder<br />
so hoch wie etwa fünf Wochen a.p., während die IgM-Konzentrationen zunächst<br />
niedrig bleiben. Diese Beobachtung spricht dafür, dass der erhöhte Transfer von<br />
IgG1 ins Euter so lange erhalten bleibt, bis die Serumkonzentrationen wieder im<br />
Normbereich liegen (SASAKI et al. 1976).<br />
Das Ausmaß der IgG-Reduktion scheint laut HERR et al. (2011) von der initialen IgG-<br />
Konzentration beim Trockenstellen abhängig zu sein. Im Gegensatz zu IgM ist das<br />
Ausmaß der IgG-Reduktion mit der IgG-Konzentration im Kolostrum korreliert.<br />
BRANDON et al. (1971) zeigten, dass sich die Konzentrationen von IgG2 nicht<br />
signifikant verändern, während DETILLEUX et al. (1995) beobachten konnten, dass<br />
es um den Abkalbezeitpunkt zu einem Anstieg der IgG2-Konzentration im Serum<br />
kommt.<br />
Die Konzentration von IgG1 im Kolostrum ist zu Beginn der Sekretbildung etwa 11-<br />
fach höher als die von IgG2 und erreicht ihr Maximum etwa zwei Wochen a.p. Nach<br />
der Geburt fällt die Konzentration von IgG1 in der Milch stark ab und ist etwa vier<br />
Wochen p.p. nur noch vier bis fünf Mal höher als die IgG2-Konzentration (BRANDON<br />
et al. 1971). Der schnelle Anstieg der IgG1-Konzentrationen im Serum am Ende der<br />
aktiven Kolostrumbildung spricht für eine sehr hohe Syntheserate von IgG1.<br />
BUTLER et al. (1972a; 1972b) konnten zum Zeitpunkt der Abkalbung einen Abfall<br />
der IgG1-Konzentrationen im Kolostrum und p.p. einen Anstieg dieses Proteins im<br />
Serum nachweisen. Diese Ergebnisse unterstützen die Vermutung, dass es zu einer<br />
Abnahme des selektiven Transports ins Euter kommt. Bei Eintritt der Milchproduktion<br />
kommt es zu einer Verdünnung der Immunglobulinkonzentrationen im Milchserum.<br />
Veränderungen im Verhältnis von IgG1 zu Gesamtprotein in Serum und Milch<br />
suggerieren, dass es zu einer Reduktion der selektiven Transportmechanismen<br />
kommt (BUTLER et al. 1972a; BUTLER et al. 1972b).<br />
Anders als bei IgG1 kommt es sowohl bei IgG2 als auch bei IgM im peripartalen<br />
Zeitraum im Serum und auch im Kolostrum nicht zu signifikanten Veränderungen der<br />
12
I. Einleitung<br />
Konzentrationen. Dennoch ist die Konzentration von IgM im Kolostrum etwa 2-7 Mal<br />
höher als vergleichbare Werte im Serum (BRANDON et al. 1971). Diese höheren<br />
Konzentrationen könnten, wie bereits beim Schaf beschrieben (LEE u. LASCELLES<br />
1970; MCDOWELL u. LASCELLES 1970) mit einer lokalen Synthese durch<br />
Plasmazellen zusammenhängen. Ebenfalls wäre für IgM ein selektiver<br />
Transportmechanismus durch das Drüsenepithel denkbar. Obwohl die<br />
Konzentrationen von IgG1 und IgG2 im Serum von Kühen etwa gleich hoch sind, ist<br />
IgG1 das vorherrschende Immunglobulin im bovinen Kolostrum. Es entstammt dem<br />
zirkulierenden IgG1-Pool des Serums und wird während der Kolostrumbildung zu<br />
einem Großteil über die Alveolarepithelzellen der Milchdrüse ins Kolostrum<br />
transportiert (BUTLER 1983). Bei diesem Mechanismus handelt es sich um einen<br />
aktiven und Rezeptor-vermittelten, selektiven Transport der Immunglobuline mittels<br />
zytoplasmatischer Vesikel (Abbildung 3) (BRANDTZAEG 1981).<br />
basolateral<br />
luminal<br />
Abbildung 3: Transport der Immunglobuline durch die Epithelzelle; • sekretorische Komponente<br />
13
I. Einleitung<br />
BARRINGTON et al. (1997) konnten immunhistochemisch spezifische Anfärbungen<br />
für bovines IgG1 sowohl in Alveolarepithelien von hochtragenden Kühen als auch in<br />
Kolostrum-produzierendem Gewebe nachweisen. Studien von SASAKI et al. (1976)<br />
zeigten, dass die Menge der transportierten Immunglobuline etwa vier bis sechs<br />
Wochen a.p. zunimmt, so dass das Maximum der Transportkapazität kurz vor oder<br />
zum Zeitpunkt der Geburt erreicht wird.<br />
Dieser rapide Anstieg, v.a. von IgG1, ist von einer reduzierten Plasmakonzentration<br />
und einer verkürzten Lebensspanne der Immunglobuline begleitet und bezeichnet<br />
nicht nur eine akut erhöhte Syntheserate, sondern auch einen Transfer dieses<br />
Proteins aus Immunglobulinspeichern wie Milz und Lymphknoten in das periphere<br />
Blut (SASAKI et al. 1976).<br />
Nach der Abkalbung nimmt die Transportrate rapide ab und ist während der Laktation<br />
und in der frühen Trockenstehphase nur minimal (BLAKEMORE u. GARNER 1956;<br />
MACKENZIE u. LASCELLES 1968). Der Transportmechanismus bleibt jedoch in<br />
allen Phasen der Laktation funktionsfähig. Vermutlich besitzen die Alveolarepithelien<br />
zwei unterschiedliche Typen von IgG1-Rezeptoren: Rezeptoren mit niedriger Affinität,<br />
die während der Laktation ausgebildet werden und solche mit höherer Affinität, die<br />
etwa eine Woche a.p. erscheinen (SASAKI et al. 1976).<br />
LARSON et al. (1980) schlossen daraus, dass der erhöhte Immunglobulintransfer<br />
nicht durch den Vorgang des Trockenstellens der Kuh, sondern durch die<br />
herannahende Geburt eingeleitet wird. Dabei weist die Menge an Östrogen, das bei<br />
tragenden Kühen mit dem Urin ausgeschieden wird, einen engen Zusammenhang<br />
zur Transportkapazität der sekretorischen Epithelzellen für IgG1 auf.<br />
SMITH et al. (1971) konnten in einer Studie an nicht laktierenden, nicht tragenden<br />
Rindern zeigen, dass eine Applikation von Östrogen und Progesteron über sieben<br />
Tage zu einer Bildung von Sekret führt, dass in seiner Zusammensetzung dem<br />
physiologischen bovinen Kolostrum entspricht. Die Verschiebung von Serumprotein<br />
in die Milchdrüse scheint, verglichen mit IgG2 oder Serumalbumin, selektiv für IgG1<br />
zu sein. Die Menge an IgG2 blieb unbeeinflusst von der Hormonapplikation und war<br />
im Vergleich zu IgG1 immer niedrig. KACSKOVICS et al. (2000) konnten bei Kühen<br />
ein Protein nachweisen, das als IgG-Fc-Rezeptor fungiert. Dieses Protein scheint für<br />
die Akkumulation von IgG und den selektiven und aktiven Transport aus dem Serum<br />
in das Lumen des Euters verantwortlich zu sein.<br />
14
I. Einleitung<br />
Die bovine Milchdrüse sezerniert in allen Phasen der Laktation selektiv Serum-γ-<br />
Globuline (IgG). Dieses findet jedoch verstärkt in der Phase der Kolostrumbildung<br />
statt, wenn die kolostralen IgG-Werte die des Serums um das bis zu Fünffache<br />
überschreiten (SASAKI et al. 1976). Dagegen gibt es kaum Unterschiede zwischen<br />
IgM in Kolostrum und Serum.<br />
Die Tatsache, dass der selektive Transport von IgG1 einer hormonellen Kontrolle zu<br />
unterliegen scheint, führt zu der Annahme, dass IgG1 nur eine kleine Rolle beim<br />
Schutz der Milchdrüse vor Infektionen spielt. MACKENZIE und LASCELLES (1968)<br />
zeigten, dass beim Schaf eine Infektion oder akute Entzündung den selektiven<br />
Transport von IgG1 in die Milchdrüse hemmt.<br />
1.6 Immunisierung des neu geborenen Kalbes<br />
Im Gegensatz zu anderen Säugetieren, bei denen Immunglobuline bereits<br />
diaplazentar von der Mutter auf den Fetus übertragen werden und somit für einen<br />
passiven Schutz des Neugeborenen zum Zeitpunkt der Geburt sorgen, lässt die<br />
Plazenta epitheliochorialis des Rindes eine diaplazentare Aufnahme maternaler<br />
Antikörper nicht zu (BRAMBELL 1966; BUSH u. STALEY 1980). Kälber werden also<br />
nahezu ohne passiven Immunschutz geboren und sind daher nach der Geburt auf<br />
eine möglichst zeitnahe und ausreichende Aufnahme von Antikörpern aus dem<br />
Kolostrum angewiesen, um einen ersten spezifischen Schutz gegen Infektionserreger<br />
zu erhalten (ERHARD et al. 1999).<br />
Sowohl KLAUS (1969) als auch PIERCE (1955) konnten zeigen, dass Kälber bei der<br />
Geburt nicht vollständig agammaglobulinämisch sind, sondern bereits geringe<br />
Konzentrationen von IgG und IgM im Serum nachgewiesen werden können.<br />
Eventuell werden diese Mengen vom bovinen Fetus selbst synthetisiert, so wie es<br />
bereits beim Menschen (VAN FURTH et al. 1965) und auch bei Ratten und Hühnern<br />
(READE et al. 1965) beschrieben wurde. Es kann davon ausgegangen werden, dass<br />
die Bildung dieser Immunglobuline durch Antigenstimulierung des Fetus während der<br />
Trächtigkeit induziert wird. Es ist bekannt, dass bovine Feten bereits pränatal auf<br />
spezifische Pathogene mit einer Immunantwort reagieren (KOBAYASHI u. TIZARD<br />
1976).<br />
Nach der Kolostrumaufnahme bis zur 12. Stunde p.p. steigen die IgG- und IgM-<br />
Spiegel beträchtlich an. Dabei ist die Korrelation zwischen den IgG- und IgM-<br />
15
I. Einleitung<br />
Konzentrationen im Serum 24 Stunden p.p. und dem IgG- bzw. IgM-Gehalt im<br />
Kolostrum hoch signifikant (BENDER u. BOSTEDT 2009).<br />
Die Absorption kolostraler Immunglobuline aus dem Gastrointestinaltrakt (v.a.<br />
Jejunum und Ileum) neugeborener Kälber ist ein unselektiver Prozess. IgG und IgM<br />
werden i.d.R. gleichwertig gut aufgenommen. PIERCE und FEINSTEIN (1965)<br />
kamen zu dem Schluss, dass der Intestinaltrakt des neugeborenen Kalbes<br />
verschiedene Proteine mehr oder weniger wahllos absorbiert. Das neugeborene Kalb<br />
ist in der Lage, aufgrund der niedrigen proteolytischen Aktivität seines Darminhaltes<br />
und des Vorkommens von Trypsininhibitoren im Kolostrum die aufgenommenen<br />
Immunglobuline unzerstört zu absorbieren.<br />
Die Absorption wird durch einen pinozytischen Mechanismus der Mukosazellen vom<br />
fetalen Typ ermöglicht. Diese Zellen werden nach und nach durch ausgereifte Zellen<br />
ersetzt, die die Fähigkeit der pinozytischen Absorption verloren haben (SMEATON u.<br />
SIMPSON-MORGAN 1985).<br />
BUSH und STALEY (1980) zeigten, dass der Prozess, aufgrund dessen das<br />
Darmepithel seine Permeabilität für die Antikörper verliert („gut closure“; CLOVER u.<br />
ZARKOWER (1980)), etwa 12 Std. p.p. eingeleitet und durchschnittlich 24 Std. p.p.<br />
abgeschlossen ist. Danach ist der passive Transfer von Antikörpern nahezu<br />
unmöglich. Die Abnahme der Absorptionsfähigkeit der intestinalen Mukosa tritt<br />
schrittweise auf und variiert für die unterschiedlichen Isotypen in ihrer<br />
Geschwindigkeit. Nach KIM und SCHMIDT (1983) tritt der Schluss der<br />
Darmschranke für IgM erheblich früher ein als für IgG. Außerdem bleibt IgM aufgrund<br />
seiner Größe länger zwischen den Mikrovilli im intestinalen Lumen hängen und wird<br />
somit erst mit einiger Verspätung resorbiert.<br />
Eine ungenügende Kolostrum- und somit auch Immunglobulinaufnahme führt zu<br />
einer erhöhten Morbiditäts- und Mortalitätsrate, verursacht durch klassische<br />
Kälbererkrankungen wie Septikämie, Diarrhoe, Pneumonie und Omphalophlebitis<br />
(MCGUIRE et al. 1976; REA et al. 1996).<br />
In diesem Zusammenhang hat sich in der englischsprachigen Literatur der Begriff<br />
des „Failures of passive tranfer of antibodies (FPTA)“ durchgesetzt (GAY et al. 1983;<br />
BESSER u. GAY 1994). Gründe für einen unzureichenden Transfer von<br />
Immunglobulinen können in Mängeln bei der Geburtsüberwachung, einem<br />
schlechten Gesundheitszustand der Muttertiere und bei den Neugeborenen selbst<br />
liegen (Unreife, intestinale Malabsorption) (VOGELS et al. 2013). Untersuchungen<br />
16
I. Einleitung<br />
von McGUIRE et al. (1976) konnten zeigen, dass bei 69 % der in der ersten<br />
Lebenswoche verendeten Kälber ein Immundefizit vorliegt. Ebenso weisen nach REA<br />
et al. (1996) IgG-defiziente Kälber ein höheres Sterblichkeitsrisiko auf.<br />
Mit zunehmendem Abbau der maternalen Antikörper muss das Kalb nach<br />
entsprechendem Antigenkontakt mit der Eigensynthese von spezifischen Antikörpern<br />
beginnen. Die aktive eigene Immunität ersetzt somit den schwindenden passiven<br />
maternalen Immunschutz.<br />
Nach Untersuchungen von WITTUM und PERINO (1995) und PERINO (1995) gilt ein<br />
Serum IgG-Gehalt von 16 mg*ml -1 24 Std. nach der Geburt als ausreichend. Unter<br />
der Voraussetzung, dass das neugeborene Kalb innerhalb der ersten 12 – 15<br />
Lebensstunden zwei Kolostrumgaben von jeweils 2 l erhält, gilt ein Kolostrumgehalt<br />
von IgG von mindestens 50 mg*ml -1 als notwendig für die Ausbildung eines<br />
effizienten Immunschutzes (GUY et al. 1994; ARTHINGTON et al. 1997).<br />
17
II. Fragestellung<br />
II. FRAGESTELLUNG<br />
Der peripartale Zeitraum ist für die Hochleitungsmilchkuh ein sehr sensibler<br />
Abschnitt, in dem das Tier hohen Belastungen ausgesetzt ist. Stoffwechselstörungen<br />
und Erkrankungen in diesem Zeitraum können sich auf die gesamte Laktation, die<br />
darauf folgende erneute Konzeption und damit auf die Nutzungsdauer des<br />
Einzeltieres negativ auswirken.<br />
HERR (2009) untersuchte bereits den Verlauf der Immunglobuline G und M im<br />
Plasma von Kühen in einem Zeitraum acht Wochen a.p. bis vier Wochen p.p. unter<br />
Berücksichtigung des Geburtsablaufs. Allerdings enthielt diese Studie keine<br />
Unterscheidung der einzelnen Immunglobulin-Isotypen. Weiterhin wurden keine<br />
Korrelationen zwischen der Ausprägung einer negativen Energiebilanz und dem<br />
Verlauf der Immunglobulintiter berechnet.<br />
Diese Studie soll daher im Hinblick auf die Auswirkungen der negativen<br />
Energiebilanz auf die Antikörperspiegel von IgG1 und IgG2 sowie IgM im Plasma und<br />
im Kolostrum bzw. der Milch des Muttertieres neue Erkenntnisse liefern.<br />
Außerdem soll anhand von Serumproben der Kälber die Übertragung der kolostralen<br />
Antikörper nachvollzogen werden.<br />
Da in dem Versuchsvorhaben täglich Futteraufnahme und Leistung des Einzeltieres<br />
erfasst wurde, konnte die Energiebilanz berechnet werden. Es sollte daher überprüft<br />
werden, ob ein kausaler Zusammenhang zwischen einer ausgeprägten negativen<br />
Energiebilanz und einem erhöhten Abfall der Immunglobulintiter hergestellt werden<br />
kann.<br />
Weiterhin wurde ein Teil der Probanden mit einer Linolsäure-supplementierten Diät<br />
gefüttert. Die Auswirkung einer Fütterung von ungesättigten Fettsäuren auf<br />
Immunzellen wurde bereits von verschiedenen Arbeitsgruppen untersucht<br />
(LACETERA et al. 2002; LACETERA et al. 2004b; LACETERA et al. 2004a;<br />
THANASAK et al. 2005; LACETERA et al. 2007). Die Auswirkung einer Fettsäuresupplementierten<br />
Fütterung auf die einzelnen Immunglobulinfraktionen scheint<br />
gerade in Hinblick auf die Ergebnisse der vorangegangenen Studien auf Zellebene<br />
besonders interessant und soll in der vorliegenden Studie ebenfalls untersucht<br />
werden.<br />
18
Tierzahl<br />
III. Material und Methoden<br />
III. MATERIAL UND METHODEN<br />
3.1 Tiere<br />
Das Tierkollektiv für die vorgelegte Untersuchung umfasste insgesamt 63 Rinder der<br />
Rasse Deutsche Schwarzbunte, die im Institut für Tierernährung des Friedrich-<br />
Löffler-Institutes in Braunschweig gehalten wurden. Das Alter der Tiere betrug<br />
durchschnittlich 3,5 ± 1,5 Jahre (2 bis 9 Jahre). Die durchschnittliche Laktationszahl<br />
der Versuchstiere betrug 2,3 ± 1,2 Laktationen. Die Auswahl, Haltung und Fütterung<br />
der Tiere sowie das Schema zur Probenentnahme ist im Detail bei Petzold et al.<br />
(2013) beschrieben.<br />
Nach der Laktationszahl verteilten sich die untersuchten Tiere wie folgt:<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
1. 2. 3. 4. 5. 7.<br />
Anzahl der Laktationen<br />
Abbildung 4: Übersicht über die Laktationsanzahl<br />
Die Gruppeneinteilung erfolgte anhand der Parameter Milchleistung in der<br />
vorausgegangenen Laktation, Lebendmasse und Laktationsnummer. Hierbei wurde<br />
auf eine gleichmäßige Verteilung der Versuchstiere nach BCS, Lebensmasse und<br />
Erstlaktation in allen Gruppen geachtet.<br />
Von den Versuchstieren erkrankten sieben Tiere postpartal an Ketose, fünf an<br />
Milchfieber und 28 an Mastitis, davon zwölf mehrfach. Dabei stammten 75% der an<br />
Mastitis erkrankten Tiere aus den CLA-Gruppen. Die Tiere wurden dem jeweiligen<br />
19
III. Material und Methoden<br />
Krankheitsbild entsprechend behandelt. Bei der Darstellung der<br />
Immunglobulingehalte im maternalen Plasma als Funktion der Zeit wurde überprüft,<br />
ob durch Proben der Tiere mit Mastitis diese Zeitverläufe beeinflusst wurden. Da<br />
diese Effekte statistisch nicht nachzuweisen waren, wurde auf die Elimination der<br />
Proben von erkrankten Tieren verzichtet. Eine Tötung aufgrund vorangegangener<br />
Krankheit erfolgte bei fünf Tieren, von denen jeweils eines aufgrund von Milchfieber,<br />
Mastitis und Fremdkörpererkrankung euthanasiert wurde und zwei aufgrund von<br />
Mastitis zur Schlachtung freigegeben wurden.<br />
Tabelle 2: Verteilung der an Mastitis erkrankten Versuchstiere innerhalb der unterschiedlichen<br />
Fütterungsgruppen.<br />
Mastitis<br />
Rezidivierende Mastitiden<br />
CLA-20 7 4<br />
CLA-60 5 4<br />
KON-20 3 2<br />
KON-60 - 2<br />
Die Geburtsverläufe verliefen über den gesamten Versuchszeitraum ohne besondere<br />
Schwierigkeiten. Insgesamt wurden 28 männliche und 34 weibliche Kälber geboren.<br />
Ein Kalb kam als Totgeburt zur Welt. Nach der Abkalbung verblieben die Kälber für<br />
16 bis 24 Stunden bei ihren Muttertieren und hatten während dieser Zeit die<br />
Möglichkeit, Kolostrum ad libitum aufzunehmen. Die genaue Menge an<br />
aufgenommenem Kolostrum konnte nicht dokumentiert werden. Nachdem die Kälber<br />
von ihren Muttertieren getrennt wurden, wurden sie mit handelsüblichem<br />
Milchaustauscher versorgt.<br />
3.2 Fütterung<br />
Die Versorgung der Tiere mit Energie und Nährstoffen wurden entsprechend der<br />
Empfehlungen der GfE (2001) vorgenommen. Alle Tiere erhielten eine Mischration,<br />
die im Versuchsverlauf aus variierenden Anteilen Kraftfutter (Grundmischung) und<br />
20
III. Material und Methoden<br />
Silage (60% Mais- und 40% Grassilage auf Trockenmassebasis) zusammengesetzt<br />
wurde. Diese Mischration wurde ad libitum angeboten.<br />
Tabelle 3: Zusammensetzung der Futtermittel (%). CLA: konjugierte Linolsäuren, TMR trocken: totale Mischration<br />
für trocken stehende Kühe, TMR Lak: totale Mischration für laktierende Kühe<br />
Futtermittel<br />
Kontrolle<br />
(Silafat®)<br />
CLA (Lutrell®<br />
Pure)<br />
TMR<br />
trocken<br />
TMR Lak<br />
Rapsextraktionsschrot 20 20 20 20<br />
Weizen 41 41 41 41<br />
Sojaextraktionsschrot 6,5 6,5 6,5 6,5<br />
Trockenschnitzel 25,5 25,5 30,5 30,3<br />
Mineralfuttermischung<br />
BASU 3800<br />
Mineralfuttermischung<br />
BASU 243401<br />
2 2 2 -<br />
- - - 2<br />
Futterkalk - - - 0,2<br />
CLA-Gemisch<br />
(Luta CLA 20 P)<br />
Fettmischung<br />
(Grasso Sila Fat 2)<br />
- 5,0 - -<br />
5,0 - - -<br />
Die Mineralfuttermischung für trocken stehende Kühe enthielt 60 g Ca, 105 g Na, 80<br />
g P, 50 g Mg, 7000 mg Zn, 4800 mg Mn, 1250 mg Cu, 100 mg I, 40 mg Se, 30 mg<br />
Co, 800.000 IU Vitamin A, 100.000 IU Vitamin D 3 und 1.500 mg Vitamin E pro kg. Mit<br />
Beginn der Laktation bekamen die Tiere ein Mineralfutter mit 140 g Ca, 120 g Na, 70<br />
g P, 40 g Mg, 6.000 mg Zn, 5.400 mg Mn, 1.000 mg Cu, 100 mg I, 40 mg Se, 25 mg<br />
Co, 1.000.000 IU Vitamin A, 100.000 IU Vitamin D 3 und 1.500 mg Vitamin E pro kg.<br />
Zusätzlich erhielten die Tiere eine Zulage von pansenstabilen konjugierten<br />
Linolsäuren, die in 2 kg Kraftfutter eingemischt wurden und den Tieren über eine<br />
Abrufstation zugänglich waren. Die Fettsäuren wurden dabei in das Kraftfutter<br />
eingepresst, um eine Entmischung zu vermeiden. Wasser stand den Kühen ad<br />
libitum zur Verfügung. Die Tiere waren in einem nicht klimatisierten Boxenlaufstall<br />
untergebracht.<br />
Die Kühe wurden in vier Versuchsgruppen eingeteilt und vor der Abkalbung mit<br />
Rationen mit hohem und niedrigem Kraftfutteranteil jeweils mit und ohne Zusatz von<br />
21
III. Material und Methoden<br />
10 g trans-10, cis-12-CLA/Tag und 10 g cis-9, trans-11-CLA/Tag gefüttert (enthalten<br />
in 100 g CLA-Gemisch, Lutrell® Pure, BASF SE, Ludwigshafen) bzw. mit 100 g einer<br />
pansenstabilen Kontrollfettmischung auf Stearinsäurebäsis (Silafat®, BASF SE,<br />
Ludwigshafen). Nach der Abkalbung wurde der Versuch weitergeführt, wobei dann<br />
alle Tiere im gleichen Verhältnis mit Grund- und Kraftfutter versorgt wurden. Ab Tag<br />
31 p.p. wurden die ursprünglichen CLA-Gruppen ein weiteres Mal aufgeteilt. Jeweils<br />
acht Tiere wurden weiterhin mit CLA substituiert, während die anderen acht Tiere<br />
stattdessen mit Kontrollfett gefüttert wurden (Tabelle 4).<br />
Der hohe Kraftfutteranteil in den letzten Wochen der Trächtigkeit sollte eine<br />
präpartale Prädisposition für eine deutlich ketogene Stoffwechsellage post partum<br />
provozieren, um auf dieser Grundlage im Vergleich zu einer angepassten Fütterung<br />
mit niedrigem Kraftfutteranteil die Wirkungen der CLA besser untersuchen zu<br />
können.<br />
Tabelle 4: Fütterungsdesign.<br />
Legende: Kon: Fütterung mit Kontrollfett auf Stearinsäurebasis. CLA: Supplementierung mit 100 g konjugierten<br />
Linolsäuren/Tag.<br />
Versuchsperiode I: -20: 20% Kraftfutter in der Ration (Versuchsperiode I). -60: 60% Kraftfutter in der Ration<br />
Versuchsperiode II: 50% Kraftfutter in der Ration (alle Fütterungsgruppen).<br />
Versuchsperiode III: B: keine Supplementierung mit CLA<br />
Zeitraum<br />
Gruppe<br />
I<br />
Tag 21 bis 1 a.p.<br />
CLA KF<br />
n<br />
(g/d) (%)<br />
II<br />
Tag 1 bis 30 p.p.<br />
CLA<br />
Gruppe n<br />
(g/d)<br />
KF<br />
(%)<br />
III<br />
Tag 31 bis 60 p.p.<br />
CLA<br />
Gruppe n<br />
(g/d)<br />
KF<br />
(%)<br />
Kon-20 16 0 20 Kon-20 16 0 50 Kon-20 16 0 50<br />
Kon-60 15 0 60 Kon-60 15 0 50 Kon-60 15 0 50<br />
CLA-20 16 100 20 CLA-20 16 100 50<br />
CLA-60 16 100 60 CLA-60 16 100 50<br />
CLA-20A 8 100 50<br />
CLA-20B 8 0 50<br />
CLA-60A 8 100 50<br />
CLA-60B 8 0 50<br />
22
III. Material und Methoden<br />
Zu Versuchsbeginn wurde die Lebendmasse aller Tiere bestimmt. Über den<br />
gesamten Versuchszeitraum erfolgte eine tierindividuelle Erfassung der Kraft- und<br />
Grundfutteraufnahme. Während der Laktation wurden zusätzlich die Parameter<br />
Milchleistung, Lebendmasse sowie wöchentlich die Bestimmung der<br />
Milchzusammensetzung (Fett, Eiweiß, somatische Zellzahl) erfasst. Zusätzlich<br />
wurden Milchproben für weitere Untersuchungen gesammelt.<br />
Die Berechnung der Energiebilanz erfolgte an den Tagen -7, 7, 14, 21, 42 und 56<br />
relativ der Abkalbung nach folgender Formel:<br />
EB [mJ] = T-Aufnahme [kg/Tag]*NEL [mJ/kg] T des jeweiligen Futtermittels – 0,293<br />
MJ NEL/kg KG 0,75 – 3,17 MJ NEL/kg FCM.<br />
Dabei entspricht NEL der Nettoenergie Laktation und KG 0,75 dem metabolischen<br />
Körpergewicht. Für 1 kg FCM wurden 3,17 MJ NEL gerechnet.<br />
Lebendmasse, tägliche Futteraufnahme und Milchleistung wurden vor der Analyse<br />
der Daten zu wöchentlichen Mittelwerten zusammengefasst.<br />
3.3 Blutprobenentnahme<br />
Die Blutprobenentnahme aus der V. jugularis erfolgte ab dem errechneten 259.<br />
Trächtigkeitstag an den in Abbildung 2 dargestellten Tagen. Die Plasma-Monovetten<br />
wurden bei 2000 g und 15°C für 15 min zentrifugiert (Varifuge 3.OR, Heraeus). Nach<br />
der Aliquotierung des Plasmas wurde es bei -18°C eingefroren. Von den Kälbern<br />
wurde ebenfalls Blut aus der V. jugularis gewonnen. Die Probennahme erfolgte hier<br />
unmittelbar nach der Geburt, noch vor Kolostrumaufnahme, dann unmittelbar nach<br />
Kolostrumaufnahme und am 42. Lebenstag (Abbildung 5).<br />
vor Kolostrumaufnahme<br />
nach Kolostrumaufnahme<br />
- 21 - 14 - 7 - 3 1 3 7 14 21 28 42 56<br />
- 40 Geburt 60<br />
Abbildung 5: Übersicht über die Probenentnahmen<br />
23
III. Material und Methoden<br />
3.4 Milchleistung, Milchprobenentnahme und -aufbereitung<br />
Die Milchleistung wurde ab Tag 7 p.p. über den gesamten Versuchszeitraum täglich<br />
erfasst. Vor Auswertung der Daten wurde ein wöchentlicher Mittelwert gebildet. Zur<br />
besseren Vergleichbarkeit ist die Milchleistung im Folgenden als fat corrected milk<br />
(FCM) dargestellt. Der FCM wurde nach folgender Formel berechnet (GAINES<br />
1928): FCM [kg/Tag] = ((Milchfett [%] * 0,15) + 0,4) * Milchleistung [kg/Tag].<br />
Die Milchprobenentnahme erfolgte jeweils morgens in den ersten sieben Tagen nach<br />
der Geburt sowie an Tag 14 und 21 p.p.. Es wurden etwa 250 ml Sekret gewonnen.<br />
Dabei handelt es sich um Sammelmilchproben aus allen Eutervierteln des jeweiligen<br />
Tieres. Die Milchproben wurden zunächst bis zu ihrer weiteren Verwendung bei<br />
-18°C eingefroren.<br />
Als Vorbereitung für den ELISA wurden die Milchproben für 2 x 10 min bei 18.670 g<br />
und 4°C zentrifugiert (RC-5C bzw. RC-5B Sorvall Superspeed Centrifuge, Dupont,<br />
Rotortyp: SS34). Nach der ersten Zentrifugation wurde das Milchfett abgenommen,<br />
dass sich durch das Zentrifugieren an der Oberfläche der Milch abgesetzt hatte.<br />
Anschließend wurde das verbliebene Milchserum noch einmal zentrifugiert und nach<br />
der zweiten Zentrifugation eventuelle Überstände aus Milchfett erneut verworfen. Die<br />
Milchproben wurden anschließend aliquotiert und bis zur weiteren Verwendung bei<br />
-18°C eingefroren. Vor der Herstellung der Verdünnungsreihe für den Immunglobulin-<br />
ELISA wurden die Proben zunächst bei Raumtemperatur aufgetaut und dann bei<br />
6.800 g für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert (Espresso-Zentrifuge,<br />
Thermo Scientific).<br />
24
III. Material und Methoden<br />
3.5 Bestimmung von Immunglobulin-Isotypen (IgG1 und IgG2 sowie IgM)<br />
mittels ELISA (enzyme-linked immunosorband assay)<br />
Bei dem so genannten „ELISA“ (enzyme-linked immunosorband assay) handelt es<br />
sich um einen Mikrotiterplattentest, der auf dem Nachweis spezifischer Antikörper-<br />
Antigen-Komplexe beruht.<br />
Zunächst wird ein markerspezifischer Antikörper, der so genannte primäre Antikörper<br />
an einen festen Träger gebunden, z.B. in einer Polyvinylchlorid- oder Polystyrolplatte<br />
mit üblicherweise 96 Vertiefungen (so genannte 96-Well-Mikrotiterplatten). Proteine<br />
binden fest an die Polystyrolplatte, so dass nach der Entfernung ungebundener<br />
primärer Antikörper durch Waschen die Vertiefungen auf den Platten mit einer<br />
dünnen Schicht Antikörper bedeckt („gecoatet“) sind.<br />
Im Folgenden wird die Probe in verschiedenen Verdünnungsstufen auf das<br />
gebundene Material gegeben.<br />
Im nächsten Schritt wird ein sekundärer Antikörper dazugegeben, der spezifisch an<br />
die zu untersuchende Probe bindet. Der sekundäre Antikörper ist mit einem Enzym<br />
(z.B. alkalische Phosphatase (AP), Peroxidase oder Urease) gekoppelt, das die<br />
Umwandlung eines farbloses Substrats in ein farbiges Produkt katalysiert.<br />
Ungebundene sekundäre Antikörper werden durch Waschen wieder entfernt, danach<br />
wird das Substrat dazugegeben.<br />
Ist die antigene Zielsubstanz in der Probe vorhanden, bindet sie an den primären<br />
Antikörper und der sekundäre Antikörper bindet dann an ein anderes Epitop an der<br />
Probe. Das gekoppelte Enzym katalysiert eine Farbreaktion (siehe Abbildung 5). Die<br />
großen Vorteile dieses Testverfahrens sind die leichte Durchführung, die Möglichkeit<br />
der Automatisierung und die Messung der Farbtiefe in kurzer Zeit mit Hilfe eines<br />
Photometers.<br />
25
III. Material und Methoden<br />
Abbildung 6:ELISA: (1): Coaten der Mikrotiter-Platte; (2): Beschichten der Platte mit den zu untersuchenden<br />
Proben (=Antigen); (3): Zugabe des Detektions-Antikörper + Substrat; (4): Zugabe der Stopplösung und<br />
Farbumschlag<br />
In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe für Immunologie der <strong>Tierärztliche</strong>n<br />
<strong>Hochschule</strong> <strong>Hannover</strong> wurde ein Sandwich-ELISA zur Bestimmung von bovinem<br />
Immunglobulin G1 und G2 sowie IgM verwendet (HUSSEN 2012).<br />
3.6 ELISA zur Bestimmung des Gehaltes von IgG1, IgG2 sowie IgM im bovinen<br />
Plasma und im Kolostrum<br />
Zunächst wurden die Mikrotiterplatten (NUNC-Immuno Plate F96 Maxisorp) mit<br />
jeweils 75 µl Primärantikörper und Coating-Puffer pro Well beschichtet. Nach einer<br />
Inkubationszeit von 30 Minuten auf einem Schüttler (Heidolph Titramax 1000) wurden<br />
die gecoateten Platten über Nacht bei 4° C im Kühlschrank inkubiert.<br />
Im nächsten Schritt wurden die Platten gewaschen. Anschließend wurde der<br />
verbliebene Puffer abgeschüttet und die Platten auf mehreren Lagen Zellstoff trocken<br />
geklopft.<br />
26
III. Material und Methoden<br />
Nun folgte die Belegung der Platten mit den zu messenden Proben. Vor der<br />
Herstellung der Verdünnungsreihe für den Immunglobulin-ELISA wurden die Proben<br />
bei Raumtemperatur aufgetaut. Die Herstellung einer Verdünnungsreihe ist<br />
notwendig, da der ELISA einer Sättigungskinetik folgt. Auch das Lambert-Beer‘sche-<br />
Gesetz gilt nur für Extinktionen in einem bestimmten Bereich (≤ 0,01 mol*l -1 ) (OTTO<br />
2011). Somit ist die Aussagekraft des ELISAs bei hohen Antigenkonzentrationen<br />
eingeschränkt. Mittels einer Verdünnungsreihe kann ein Bereich gefunden werden, in<br />
dem belastbare Messungen durchführbar sind.<br />
Anschließend wurden die Proben durchmischt und mit einer Pipettenspitze die oft<br />
schon mit bloßem Auge sichtbaren Fibrinkoagula entfernt. Im Folgenden wurden die<br />
Proben bei 2383 g für 6 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert (Labofuge 400,<br />
Heraeus, Rotortyp: 8172).<br />
Nach Titrationsversuchen zur Ermittlung der optimalen optischen Dichten (ODs) bei<br />
niedrigen Hintergrundwerten wurde eine Konzentration von 1 μg/ml sowohl für den<br />
Primärantikörper als auch für den Detektionsantikörper gewählt. Die idealen<br />
Verdünnungen, bei denen eine optimale Abstufung der ODs zu erkennen war, lagen<br />
zwischen 1x10 5 und 3x10 7 (Tabelle 5).<br />
Jede Probe wurde mit jeweils 75 µl/Well mit jeweils vier Verdünnungen/Probe im<br />
Doppelansatz aufgetragen (Tabelle 5). Auf jede Platte wurde außerdem das<br />
Referenzserum (Tabelle 9) im Doppelansatz aufgetragen. Die Platten wurden nun für<br />
eine Stunde auf einem Schüttler inkubiert und im Anschluss erneut gewaschen. Nach<br />
dem Trockenklopfen der Platten wurden sie mit 75 µl Detektionsantikörper/Well<br />
(Tabelle 9) beschichtet.<br />
Es folgte wiederum eine 45-minütige Inkubation auf dem Schüttler. Nach dem darauf<br />
folgenden Waschschritt wurden 75 µl einer Tetramethylbenzindin(TMB)-haltigen<br />
Substratlösung (6,24 mM/*l -1 in DMSO) auf die Platten gegeben.<br />
Nach einer Inkubationszeit von 15 – 20 Minuten bei Raumtemperatur unter<br />
Ausschluss von Tageslicht kam es aufgrund der Bildung von Enzym-Substrat-<br />
Komplexen zwischen der Meerrettich-Peroxidase und dem TMB zu einem blauen<br />
Farbumschlag.<br />
Zum Stoppen der Reaktion wurden 50 µl 1 N H 2 SO 4 auf die Platte pipettiert, was zu<br />
einem gelben Farbumschlag führte. Die Farbintensität wurde in einem<br />
Plattenphotometer (ELISA-Reader Dynatech MR600 mit 2/86-PC und Seikosh-<br />
Nadeldrucker) bei einer Wellenlänge von 450 nm (Testfilter) und 630 nm<br />
27
III. Material und Methoden<br />
(Referenzfilter) gemessen und als OD erfasst. Diese Dualmessung ermöglicht die<br />
Elimination von Messfehlern durch Schmutz, Kratzer oder Feuchtigkeit auf der<br />
Mikrotiterplatte. Die anschließende Auswertung erfolgt mit Hilfe eines<br />
Computerprogramms (MR5000 ELISA-Messung für MS DOS). Die logarithmierten<br />
Serumverdünnungen (X-Achse) wurden anschließend gegen die logarithmierten ODs<br />
(Y-Achse) aufgetragen. Die ELISA-Units unbekannter Proben wurden durch den<br />
Vergleich mit den Werten des Referenzserums (100 Units) im linearen Bereich als<br />
relative Werte angegeben und danach bezüglich der bekannten<br />
Immunglobulinkonzentrationen des Referenzserums in mg*ml -1 berechnet.<br />
Tabelle 5: Übersicht der aufgetragenen Verdünnungen<br />
Nachweis für: Verdünnungen Probe Verdünnungen Referenz<br />
IgG1 (Plasma)<br />
10 5<br />
10 5<br />
3x10 5<br />
3x10 5<br />
10 6<br />
10 6<br />
3x10 6 3x10 6<br />
IgG2 (Plasma)<br />
10 6<br />
10 5<br />
3x10 6<br />
3x10 5<br />
10 7<br />
10 6<br />
3x10 7 3x10 6<br />
IgG1 / IgG2 (Kolostrum)<br />
3x10 5<br />
3x10 5<br />
10 6<br />
10 6<br />
3x10 6<br />
3x10 6<br />
10 7 10 7<br />
IgM (Plasma)<br />
3x10 5<br />
3x10 5<br />
10 6<br />
10 6<br />
3x10 6<br />
3x10 6<br />
10 7 10 7<br />
28
III. Material und Methoden<br />
3.6 Statistische Auswertung<br />
Die statistische Auswertung und Darstellung der Daten erfolgte mit den<br />
Computerprogrammen GraphPad Prism 5 (Graph Pad Software) und IBM SPSS<br />
Statistics 20 (IBM).<br />
Der Verlauf der Immunglobulinspiegel im Plasma wurde bis Tag 28 mittels<br />
multifaktorieller Varianzanalyse für wiederholte Beobachtungen (Repeated<br />
measurements (RM) ANOVA) zunächst mit den Faktoren „Zeit“ und<br />
„Laktationsnummer“ für die einzelnen Immunglobulin-Isotypen ausgewertet.<br />
Zusätzlich wurde der Fisher LSD-Test für den Vergleich der einzelnen<br />
Entnahmezeitpunkte miteinander angewendet.<br />
Zusätzlich wurden die Immunglobulinwerte der einzelnen Isotypen an den<br />
verschiedenen Zeitpunkten untereinander mittels einfaktorieller Varianzanalyse (One-<br />
Way ANOVA) verglichen. Da ab Tag 30 des Versuchsablaufes die Fütterung<br />
nochmals umgestellt wurde, wurden die letzten beiden Zeitpunkte (Tag 42 und Tag<br />
56) ausschließlich mittels One-Way ANOVA verglichen.<br />
Um den Einfluss der Fütterung auf den Verlauf der Immunglobulin-Isotypen zu<br />
untersuchen, wurde ebenfalls bis Tag 28 eine multifaktorielle Varianzanalyse für die<br />
Faktoren „Zeit“, „Kraftfuttermenge a.p.“ und „Gruppe“ durchgeführt. Die<br />
Untersuchung der letzten beiden Entnahmezeitpunkte erfolgte wieder mittels One-<br />
Way ANOVA.<br />
Bei fehlenden Werten wurde bei der Berechnung der Zeitverläufe via RM ANOVA<br />
das betroffene Tier nicht mit berücksichtigt. Im Vergleich der Zeitpunkte miteinander<br />
wurden allerdings lediglich die fehlenden Werte ausgelassen.<br />
Die Auswertung der Immunglobulinspiegel im Kolostrum erfolgte ebenfalls mittels<br />
One-Way ANOVA. Um einen Unterschied zwischen den einzelnen Isotypen zu<br />
ermitteln, wurde eine One-Way ANOVA für wiederholte Beobachtungen<br />
durchgeführt.<br />
Die Plasmaproben der Kälber wurden ebenfalls mit einer One-Way ANOVA<br />
analysiert.<br />
Um zu überprüfen, ob ein Zusammenhang zwischen der Ausprägung der negativen<br />
Energiebilanz und der Höhe der Immunglobulinspiegel besteht, wurden an den<br />
jeweiligen Entnahmezeitpunkten lineare Korrelationen berechnet.<br />
29
III. Material und Methoden<br />
In den folgenden Kapiteln werden in den Darstellungen jeweils arithmetische<br />
Mittelwerte (x‾) und entsprechende Standardfehler (SEM) angegeben. Für die<br />
Signifikanzangaben gilt Folgendes:<br />
n.s.<br />
p < 0,05<br />
p < 0,01<br />
p < 0,001<br />
nicht signifikant<br />
* schwach signifikant<br />
** signifikant<br />
*** hoch signifikant<br />
30
Gesamt IgG [mg*ml -1 ]<br />
IV. Ergebnisse<br />
IV. ERGEBNISSE<br />
4.1 Verlauf der Plasma-Immunglobuline im peripartalen Zeitraum<br />
4.1.1 Verlauf von Gesamt-IgG im Plasma<br />
Zwischen dem Ende des 8. Monats der Trächtigkeit und der Zeit unmittelbar a.p. kam<br />
es zu einem Abfall der intravasalen IgG-Konzentration (19,85 ± 1,45 mg*ml -1 auf<br />
14,91 ± 1,68 mg*ml -1 ). Unmittelbar nach der Geburt stiegen die IgG-Werte wieder an<br />
und erreichten an Tag 21 mit 18,07 ± 1,51 mg*ml -1 die Ausgangskonzentration. Am<br />
Ende des Versuchszeitraums sank der IgG-Spiegel noch einmal leicht bis auf einen<br />
Wert von 14,58 ± 1,30 mg*ml -1 ab.<br />
25<br />
20<br />
15<br />
a<br />
ac<br />
abcd abc<br />
bcd bd<br />
abcd abc<br />
ab<br />
abcd<br />
abcd<br />
10<br />
d<br />
5<br />
0<br />
-20 0 20 40 60<br />
Tage<br />
Abbildung 7: Verlauf von Plasma-Gesamt-IgG bei Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian im peripartalen<br />
Zeitraum (n=63). Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). RM One-Way ANOVA; Tukey<br />
Post Test: Zeiteffekt: ***; Unterschiedliche Buchstaben stehen für signifikant unterschiedliche Mittelwerte<br />
31
IgG1 [mg*ml -1 ]<br />
IV. Ergebnisse<br />
Da sich das intravasale Gesamt-IgG aus den Isotypen IgG1 und IgG2<br />
zusammensetzt, werden im Folgenden die einzelnen Isotypen separat dargestellt.<br />
4.1.2 Verlauf von IgG1 im Plasma<br />
Zwischen dem Messungen zu Beginn des Versuchs und unmittelbar peripartal sank<br />
die IgG1-Konzentration von 8,21 ± 0,77 mg*ml -1 auf 2,90 ± 0,27 mg*ml -1 . Bis zum<br />
Ende des Versuchs wurde mit IgG1-Spiegeln von 8,34 ± 1,26 mg*ml -1 die<br />
Ausgangskonzentration wieder erreicht.<br />
12<br />
10<br />
8<br />
6<br />
4<br />
a<br />
ab<br />
bcd<br />
d<br />
abc<br />
bcd<br />
cd<br />
ab<br />
a<br />
a<br />
a<br />
2<br />
d<br />
0<br />
-20 0 20 40 60<br />
Tage<br />
Abbildung 8: Verlauf von Plasma-IgG1 bei Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian im peripartalen Zeitraum<br />
(n=63). Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). RM One-Way ANOVA; Tukey Post<br />
Test: Zeiteffekt: ***; Unterschiedliche Buchstaben stehen für signifikant unterschiedliche Mittelwerte<br />
32
IgG2 [mg*ml -1 ]<br />
IV. Ergebnisse<br />
4.1.3 Verlauf von IgG2 im Plasma<br />
An Tag -21 lagen die Werte für IgG2 bei 12,7 ± 1,24 mg*ml -1 . Im weiteren Verlauf<br />
waren keine signifikanten Veränderungen zu beobachten. Zum Geburtszeitpunkt<br />
wurden Werte von 13,88 ± 1,66 mg*ml -1 gemessen. Zum Ende der Versuchsperiode<br />
lagen die Werte bei 11,58 ± 1,22 mg*ml -1 .<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
-20 0 20 40 60<br />
Tage<br />
Abbildung 9: Verlauf von Plasma-IgG2 bei Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian im peripartalen Zeitraum<br />
(n=63). Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). RM One-Way ANOVA; Tukey Post<br />
Test: n.s.<br />
33
IgM [mg*ml -1 ]<br />
IV. Ergebnisse<br />
4.1.4 Verlauf von IgM im Plasma<br />
Für die Messung von IgM wurden 18 Tiere anhand ihrer Laktationzahl ausgewählt.<br />
Zu Beginn der Messungen lagen die Werte für IgM bei 6,66 ± 0,98 mg*ml -1 . Zum<br />
Geburtszeitpunkt kam es zu einem rapiden Abfall der intravasalen IgM-<br />
Konzentration. An Tag -3 wurden lediglich Werte von 0,59 ± 0,18 mg*ml -1 gemessen.<br />
Bereits an Tag 1 p.p. wurden wieder Plasmaspiegel von 6,69 ± 1,69 erreicht. Diese<br />
blieben bis zum Ende der Versuchsperiode konstant. An Tag 56 lagen die Werte bei<br />
5,30 ± 1,40 mg*ml -1 .<br />
10<br />
8<br />
6<br />
a<br />
a<br />
a<br />
a<br />
a a<br />
ab<br />
ab<br />
a<br />
a<br />
a<br />
4<br />
2<br />
0<br />
b<br />
-20 0 20 40 60<br />
Tage<br />
Abbildung 10: Verlauf von Plasma-IgM bei Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian im peripartalen Zeitraum<br />
(n=18). Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM).RM One-Way ANOVA; Tukey Post<br />
Test: Zeiteffekt: ***; Unterschiedliche Buchstaben stehen für signifikant unterschiedliche Mittelwerte<br />
34
IgG1 [m g*m l -1 ]<br />
IV. Ergebnisse<br />
4.2 Verlauf der Immunglobuline in Abhängigkeit der Laktationszahl<br />
In Abhängigkeit der Laktationszahl waren deutliche Unterschiede im Verlauf der<br />
unterschiedlichen Immunglobulin-Isotypen feststellbar. So zeigten Färsen signifikant<br />
niedrigere Ausgangswerte von IgG1 an Tag -21 (4,05 ± 0,79 mg*ml -1 ) und signifikant<br />
niedrigere IgG1-Spiegel zum Zeitpunkt der Geburt (1,95 ± 0,42 mg*ml -1 ) und<br />
erreichten auch post partum nicht so hohe Plasmaspiegel wie Tiere mit mehreren<br />
Laktationen.<br />
Insgesamt zeigten Kühe mit zwei oder mehr Laktationen über die gesamte<br />
Versuchsperiode höhere Plasmaspiegel an IgG1. So lagen die Plasmaspiegel bei<br />
Kühen in der 2. Laktation an Tag -21 bei 7,12 ± 0,78 mg*ml -1 und zum Zeitpunkt der<br />
Geburt 2,76 ± 0,65 mg*ml -1 . Für Tiere mit mehr als zwei Laktationen lagen die<br />
Plasmaspiegel an Tag -21 bei 11,14 ± 1,33 mg*ml -1 und zum Zeitpunkt der Geburt<br />
bei 3,66 ± 0,42 mg*ml -1 .<br />
15<br />
10<br />
a<br />
a<br />
1. Laktation (N=16)<br />
2. Laktation (N=25)<br />
> 2. Laktation (N=22)<br />
a<br />
a<br />
a<br />
5<br />
b<br />
ab<br />
a<br />
a<br />
b<br />
b<br />
b<br />
0<br />
-30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60<br />
Tage um den Geburtszeitpunkt<br />
Abbildung 11: IgG1 im Plasma von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in Abhängigkeit der Laktationszahl.<br />
Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM).Two Way ANOVA: Zeiteffekt: ***, Effekt der<br />
Laktation: **, Interaktion Zeit/Laktation: *; Fisher LSD Test: Unterschiedliche Buchstaben stehen für signifikant<br />
unterschiedliche Mittelwerte.<br />
35
IgM [mg*ml -1 ]<br />
IgG2 [m g*m l -1 ]<br />
IV. Ergebnisse<br />
Im zeitlichen Verlauf von IgG2 und IgM konnten dagegen keine Unterschiede<br />
zwischen den einzelnen Laktationsgruppen festgestellt werden (Abbildung 12 und<br />
13).<br />
20 1. Laktation (N=16)<br />
2. Laktation (N=25)<br />
15<br />
> 2. Laktation (N=22)<br />
10<br />
5<br />
0<br />
-20 0 20 40 60<br />
Tage um den Geburtszeitpunkt<br />
Abbildung 12: IgG2 im Plasma von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in Abhängigkeit von der<br />
Laktationszahl. Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). Two Way ANOVA: Zeiteffekt: *,<br />
Interaktion Zeit/Laktation: *<br />
20<br />
15<br />
1. Laktation (N=6)<br />
2. Laktation (N=6)<br />
> 2. Laktation (N=6)<br />
10<br />
5<br />
0<br />
-20 0 20 40 60<br />
Tage um den Geburtszeitpunkt<br />
Abbildung 13: IgM im Plasma von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in Abhängigkeit von der<br />
Laktationszahl. Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). Two Way ANOVA: Zeiteffekt: **<br />
36
IgG1 [mg*ml -1 ]<br />
IV. Ergebnisse<br />
4.3 Verlauf der Immunglobuline in Abhängigkeit der Fütterung<br />
Wie bereits in Kapitel 3.2 beschrieben, wurden die Kühe in vier Versuchsgruppen<br />
eingeteilt und vor der Abkalbung mit Rationen mit hohem und niedrigem<br />
Kraftfutteranteil jeweils mit und ohne Zusatz von 10 g trans-10, cis-12-CLA/Tag und<br />
10 g cis-9, trans-11-CLA/Tag gefüttert.<br />
Nach der Abkalbung wurde der Versuch weitergeführt, wobei dann alle Tiere im<br />
gleichen Verhältnis mit Grund- und Kraftfutter versorgt wurden (siehe Tabelle 4).<br />
Um den Einfluss der Fütterung auf den Verlauf der Immunglobulin-Isotypen zu<br />
untersuchen, wurde bis Tag 28 eine multifaktorielle Varianzanalyse für die Faktoren<br />
„Zeit“, „Kraftfuttermenge a.p.“ und „Gruppe“ durchgeführt. Der Faktor „Laktation“<br />
wurde separat betrachtet.<br />
Dabei konnten für IgG1 und IgG2 keine Unterschiede zwischen den einzelnen<br />
Fütterungsgruppen gezeigt werden (siehe Abbildung 14 und 15).<br />
15<br />
10<br />
5<br />
I II III<br />
Kon-20 (N=16)<br />
Kon-60 (N=15)<br />
CLA-20A (N=16)<br />
CLA-20B (N=16)<br />
CLA-60A (N=16)<br />
CLA-60B (N=16)<br />
0<br />
-30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60<br />
Tage um den Geburtszeitpunkt<br />
Abbildung 14: IgG1 im Plasma von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in Abhängigkeit der Fütterung unter<br />
Berücksichtigung der Laktation. Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). Two Way<br />
ANOVA (bis Tag 28): Zeiteffekt: ***; One Way ANOVA (Tag 42 und 56): n.s.<br />
37
IgG2 [mg*ml -1 ]<br />
IV. Ergebnisse<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
I II III<br />
Kon-20 (N=16)<br />
Kon-60 (N=15)<br />
CLA-20A (N=16)<br />
CLA-20B (N=16)<br />
CLA-60A (N=16)<br />
CLA-60B (N=16)<br />
5<br />
0<br />
-30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60<br />
Tage um den Geburtszeitpunkt<br />
Abbildung 15: IgG2 im Plasma von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in Abhängigkeit der Fütterung unter<br />
Berücksichtigung der Laktation. Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). Two Way<br />
ANOVA (bis Tag 28): Zeiteffekt: (*);One Way ANOVA (Tag 42 und 56): n.s.<br />
Da der Einfluss der Fütterung nach Betrachtung von IgG1 und IgG2 eine<br />
untergeordnete Rolle zu spielen schien und der Einfluss der Laktation<br />
vielversprechende Ergebnisse zeigte, wurden die Tiere für die Bestimmung von IgM<br />
ausschließlich nach ihrer Laktationsnummer ausgewählt. Bis auf signifikante<br />
Unterschiede zwischen der CLA-60B-Gruppe und den Kontrollgruppen an Tag 42<br />
konnten hier ebenfalls keine Unterschiede zwischen den einzelnen<br />
Fütterungsgruppen gezeigt werden.<br />
38
Energiebilanz [mJ]<br />
IgM [mg*ml -1 ]<br />
IV. Ergebnisse<br />
25<br />
20<br />
15<br />
I II III<br />
Kon-20 (N=6)<br />
Kon-60 (N=4)<br />
CLA-20B (N=3)<br />
CLA-60B (N=4)<br />
10<br />
5<br />
0<br />
-20 0 20 40 60<br />
Tage um den Geburtszeitpunkt<br />
a<br />
b<br />
b<br />
Abbildung 16: IgM im Plasma von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in Abhängigkeit der Fütterung.<br />
Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM).Two Way ANOVA (bis Tag 28): Zeiteffekt: ***;<br />
One Way ANOVA (Tag 42 und 56): Unterschiedliche Buchstaben stehen für signifikant unterschiedliche<br />
Mittelwerte<br />
4.4 Energiebilanz (EB)<br />
Anhand von Daten, die im Rahmen der Dissertation von PETZOLD et al. (2013) am<br />
Friedrich-Löffler-Institut in Braunschweig erhoben wurden, wurde die Energiebilanz<br />
berechnet, um eine Übersicht über die Stoffwechselsituation der Milchkühe über den<br />
Versuchszeitraum zu erhalten.<br />
Von Tag -7 a.p. zu Tag 7 p.p. kam es zu einem signifikanten Abfall der Energiebilanz<br />
von anfänglich 41,49 ± 4,32 mJ auf -33,52 ± 9,84 mJ. Bis zum Ende der<br />
Versuchsperiode wurden keine positiven Bilanzwerte erreicht.<br />
60<br />
40<br />
a<br />
20<br />
0<br />
-20<br />
-40<br />
-60<br />
Tage<br />
0 20 40 60<br />
d<br />
b c<br />
bcd<br />
e<br />
Abbildung 17: Verlauf der EB von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian über den gesamten<br />
Versuchszeitraum (n=63). Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). One Way-ANOVA,<br />
Tukey Post Test: Unterschiedliche Buchstaben stehen für signifikant unterschiedliche Mittelwerte<br />
39
Energiebilanz [mJ]<br />
IV. Ergebnisse<br />
In Abhängigkeit der Laktationszahl waren ab Tag 14 p.p. deutliche Unterschiede<br />
zwischen der 1. und den nachfolgenden Laktationen feststellbar. Tiere der 1.<br />
Laktation befanden sich an Tag 14 p.p. in einer Energiebilanz von -2,22 ± 4,67 mJ<br />
und lagen damit deutlich über den Werten der Kühe in der 2. Laktation (-36,87 ± 4,85<br />
mJ) bzw. der nachfolgenden Laktationen (-42,85 ± 4,50 mJ). Die statistische<br />
Auswertung dieser Daten ergab, dass die Kühe in der 1. Laktation bis auf den letzten<br />
Messwert (Tag 56) signifikant höhere Energiebilanzwerte aufwiesen.<br />
60<br />
30<br />
1. Laktation (N=16)<br />
2. Laktation (N=25)<br />
> 2. Laktation (N=22)<br />
0<br />
-30<br />
a<br />
a<br />
ab<br />
0 20 40 60<br />
Tage<br />
b<br />
b<br />
b<br />
b<br />
a<br />
b<br />
Abbildung 18: Verlauf der EB von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in Abhängigkeit der<br />
Laktationsnummer. Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). RM One Way-ANOVA:<br />
Zeiteffekt:**; Fisher LSD Test: Unterschiedliche Buchstaben stehen für signifikant unterschiedliche Mittelwerte<br />
4.4.1 Zusammenhang zwischen Energiebilanz und Immunglobulingehalt im Plasma<br />
Um einen möglichen Zusammenhang zwischen dem Energiehaushalt und der<br />
humoralen Immunität zu charakterisieren, wurden die Immunglobulinspiegel im<br />
Plasma an allen Entnahmezeitpunkten mit der jeweiligen Energiebilanz korreliert.<br />
Dabei konnte kein Zusammenhang festgestellt werden.<br />
Da der Zeitpunkt um die Abkalbung ausschlaggebend für die Fragestellung dieser<br />
Arbeit war, sind in Abbildung 19 beispielhaft die Korrelationen für die Tage -7 und 7<br />
p.p. für alle drei Isotypen dargestellt.<br />
40
IV. Ergebnisse<br />
Korrelation NEB/IgG1 (Plasma) Tag -7 a.p.<br />
Korrelation NEB/IgG1 (Plasma) Tag 7 p.p.<br />
15<br />
10<br />
Tag -7 (N=46)<br />
R 2 : 0,0005<br />
25<br />
20<br />
15<br />
R 2 : 0,1<br />
Tag 7 (N=15)<br />
5<br />
10<br />
5<br />
-50 0 50 100<br />
NEB<br />
-100 -50 0 50 100<br />
NEB<br />
Korrelation NEB/IgG2 (Plasma) Tag -7 a.p.<br />
Korrelation NEB/IgG2 (Plasma) Tag 7 p.p.<br />
40<br />
Tag -7 (N=46)<br />
30<br />
Tag 7 (N=15)<br />
30<br />
R 2 : 0,02<br />
20<br />
R 2 : 0,008<br />
20<br />
10<br />
10<br />
-50 0 50 100<br />
NEB<br />
-100 -50 0 50 100<br />
NEB<br />
20<br />
15<br />
Korrelation NEB/IgM (Plasma) Tag -7 a.p.<br />
R 2 : 0,15<br />
Tag -7 (N=14)<br />
Korrelation NEB/IgM (Plasma) Tag 7 p.p.<br />
25<br />
20<br />
15<br />
R 2 : 0,1<br />
Tag 7 (N=3)<br />
mg*ml -1<br />
10<br />
mg*ml -1<br />
10<br />
5<br />
5<br />
0<br />
0 20 40 60 80 100<br />
NEB<br />
-40 -20 0 20 40<br />
NEB<br />
Abbildung 19: Übersicht über die Korrelationen zwischen EB und Immunglobulinspiegel im Plasma von<br />
Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian an Tag -7 und Tag 7 für alle untersuchten Isotypen (IgG1, IgG2 und<br />
IgM).<br />
41
FCM [kg]<br />
IV. Ergebnisse<br />
4.5 Milchleistung<br />
Die Milchleistung zeigte von Tag 7 p.p. bis Tag 42 p.p. einen leichten Anstieg (von<br />
39,21 ± 1,94 kg an Tag 14 p.p. auf 42,96 ± 1,20 kg an Tag 42 p.p.), der allerdings<br />
statistisch nicht abzusichern war.<br />
50<br />
45<br />
40<br />
35<br />
0 20 40 60<br />
Tage<br />
Abbildung 20: Verlauf der Milchleistung von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian über den Versuchszeitraum<br />
(FCM: fat corrected milk). Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). RM One Way-<br />
ANOVA; Tukey Post Test: n.s.<br />
42
FCM [kg]<br />
IV. Ergebnisse<br />
In Abhängigkeit der Laktationsnummer zeigten sich deutliche Unterschiede in der<br />
Milchleistung zwischen Kühen in der ersten und denen der nachfolgenden<br />
Laktationen. Ab Tag 14 p.p. zeigten die Kühe der 1. Laktation über den gesamten<br />
Versuchszeitraum hinweg signifikant niedrigere Milchleistung im Vergleich mit den<br />
Kühen der zweiten oder späteren Laktationen (siehe Abbildung 21).<br />
50<br />
40<br />
30<br />
a<br />
a<br />
b<br />
a<br />
a<br />
b<br />
a<br />
a<br />
b<br />
a<br />
a<br />
b<br />
1. Laktation (N=16)<br />
2. Laktation (N=25)<br />
> 2. Laktation (N=22)<br />
20<br />
10<br />
0<br />
0 20 40 60<br />
Tage<br />
Abbildung 21: Verlauf der Milchleistung von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in Abhängigkeit der<br />
Laktationszahl. Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). RM One Way-ANOVA; Fisher<br />
LSD-Test: Unterschiedliche Buchstaben stehen für signifikant unterschiedliche Mittelwerte<br />
4.6 Transfer der Plasma-Immunglobuline ins Kolostrum<br />
Um den Transfer der unterschiedlichen Ig-Isotypen aus dem Plasma ins Kolostrum<br />
nachvollziehen zu können, wurden die Kolostrumproben ebenfalls mittels ELISA<br />
untersucht. Da die Erfassung der Tagesmilchmengen erst ab Tag 7 p.p. erfolgte, war<br />
eine quantitative Bestimmung der über das Kolostrum abgegebenen Mengen an<br />
Immunglobulinen nicht möglich. Sowohl IgG1, IgG2 und IgM sind im Kolostrum<br />
vorhanden, wobei das Verhältnis IgG1:IgG2:IgM etwa 4:2:1 beträgt.<br />
Da die Ergebnisse der Messungen der ersten fünf Tiere darauf hinwiesen, dass nach<br />
Tag 3 p.p. kaum noch nachweisbare Immunglobulingehalte im Kolostrum vorhanden<br />
sind, wurden von den restlichen Tieren nur die Proben der Tage 1 bis 3 p.p.<br />
untersucht.<br />
43
[mg*ml -1 ]<br />
IV. Ergebnisse<br />
Für die Untersuchung von IgM im Kolostrum wurde eine Stichprobe von zehn Tieren<br />
ausgewählt. Dabei wurden die Tiere berücksichtigt, von denen auch die<br />
Plasmaproben ihrer Kälber zur Verfügung standen.<br />
50<br />
***<br />
***<br />
40<br />
30<br />
IgG1 (N=63)<br />
IgG2 (N =63)<br />
IgM (N=10)<br />
20<br />
**<br />
***<br />
***<br />
10<br />
0<br />
***<br />
**<br />
1 2 3 1 2 3 1 2 3<br />
Tage p.p.<br />
Abbildung 22: Konzentrationen von IgG1, IgG2 und IgM im Kolostrum von Milchkühen der Rasse Holstein-<br />
Friesian. Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). Two Way ANOVA mit Tukey Post<br />
Test: Zeiteffekt: ***, Effekt des Isotyps: ***, Interaktion Zeit/Isotyp: ***<br />
In Abhängigkeit der Laktationszahl waren für Gesamt-IgG zunächst keine<br />
signifikanten Unterschiede im Immunglobulingehalt des Kolostrums feststellbar<br />
(Abbildung 23).<br />
44
IgG1 [mg*ml -1 ]<br />
Gesamt IgG [mg*ml -1 ]<br />
IV. Ergebnisse<br />
100<br />
80<br />
60<br />
1. Laktation (N=16)<br />
2. Laktation (N=22)<br />
> 2. Laktation (N=25)<br />
40<br />
20<br />
0<br />
1 2 3<br />
Tage p.p.<br />
Abbildung 23: Gehalt von Gesamt IgG im Kolostrum von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in<br />
Abhängigkeit der Laktationszahl. Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM).Two Way<br />
ANOVA mit Tukey Post Test.<br />
Bei getrennter Betrachtung der einzelnen Isotypen waren jedoch eindeutige<br />
Unterschiede zwischen den einzelnen Laktationszahlen erkennbar. Dabei zeigten<br />
Tiere der 1. Laktation mit 60,83 ± 11,83 mg*ml -1<br />
an Tag 1 p.p. deutlich höhere<br />
Immunglobulinspiegel von IgG1 im Kolostrum als Tiere der 2. Laktation (50,28 ± 5,80<br />
mg*ml -1 ) oder als Tiere in höheren Laktationen (35,64 ± 5,58 mg*ml -1 ).<br />
80<br />
60<br />
40<br />
**<br />
1. Laktation (N=16)<br />
2. Laktation (N=22)<br />
< 2. Laktation (N=25)<br />
20<br />
0<br />
1 2 3<br />
Tage p.p.<br />
Abbildung 24: Gehalt von IgG1 im Kolostrum von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in Abhängigkeit von<br />
der Laktationszahl. Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). Two Way ANOVA mit<br />
Tukey Post Test: Zeiteffekt: ***<br />
45
IgM [mg*ml -1 ]<br />
IgG2 [mg*ml -1 ]<br />
IV. Ergebnisse<br />
Im Gegensatz dazu wiesen die Tiere der 1. Laktation an Tag 1 deutlich niedrigere<br />
Werte von IgG2 auf (11,22 ± 2,47 mg*ml -1 ) als die Tiere der anderen<br />
Laktationsgruppen (16,55 ± 1,96 mg*ml -1 für Tiere der 2. Laktation respektive 17,80 ±<br />
1,73 mg*ml -1 für Tiere > 2. Laktation).<br />
25<br />
20<br />
15<br />
*<br />
1. Laktation (N=16)<br />
2. Laktation (N=22)<br />
< 2. Laktation (N=25)<br />
10<br />
5<br />
0<br />
1 2 3<br />
Tage p.p.<br />
Abbildung 25: Gehalt von IgG2 im Kolostrum von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in Abhängigkeit von<br />
der Laktationszahl. Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). Two Way ANOVA mit<br />
Tukey Post Test: Zeiteffekt: ***<br />
Für IgM konnten statistisch keine Unterschiede zwischen den einzelnen<br />
Laktationsgruppen nachgewiesen werden.<br />
8<br />
6<br />
> 2. Laktation (N=4)<br />
2. Laktation (N=3)<br />
1. Laktation (N=3)<br />
4<br />
2<br />
0<br />
1 2 3<br />
Tage p.p.<br />
Abbildung 26: Gehalt von IgM im Kolostrum von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in Abhängigkeit von<br />
der Laktationszahl. Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). Two Way ANOVA mit<br />
Tukey Post Test: n.s.<br />
46
IgG1 [mg*ml -1 ]<br />
IV. Ergebnisse<br />
4.7 Aufnahme kolostraler Immunglobuline durch das Kalb<br />
Um die Aufnahme der kolostralen Immunglobuline durch das Neugeborene<br />
überprüfen zu können, wurden die Plasmaproben der Kälber ebenfalls mittels ELISA-<br />
Technik auf IgG1, IgG2 und IgM untersucht. Zur Verfügung standen dabei Proben<br />
von 19 Kälbern zu den Zeitpunkten vor und direkt nach der Kolostrumaufnahme<br />
sowie vom 42. Lebenstag.<br />
Die untersuchten Kälber hatten vor der Kolostrumaufnahme einen IgG1-<br />
Plasmaspiegel von 0,76 ± 0,06 mg*ml -1 . Bereits direkt nach der Kolostrumaufnahme<br />
konnte ein signifikanter Anstieg auf 6,45 ± 1,57 mg*ml -1 beobachtet werden. An Tag<br />
42 wiesen die Kälber einen Plasmaspiegel von 11,43 ± 1,47 mg*ml -1 auf und lagen<br />
damit im Bereich adulter Tiere.<br />
*<br />
14 ***<br />
vor Kolostrumaufnahme (N=19)<br />
nach Kolostrumaufnahme (N=19)<br />
12<br />
10<br />
8<br />
6<br />
4<br />
2<br />
0<br />
Tag 42 (N=19)<br />
**<br />
Abbildung 27: IgG1-Plasmakonzentrationen von Kälbern der Rasse Holstein-Friesian (n=19). Angaben als<br />
arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). RM One Way ANOVA mit Tukey Post Test<br />
47
IgG2 [mg*ml -1 ]<br />
IV. Ergebnisse<br />
Für IgG2 konnte kein signifikanter Unterschied vor und nach der Kolostrumaufnahme<br />
beobachtet werden (3,60 ± 0,27 mg*ml -1 vor der Kolostrumaufnahme respektive 4,07<br />
± 0,39 mg*ml -1 nach der Kolostrumaufnahme). Allerdings waren die Plasmaspiegel<br />
an Tag 42 mit 6,37 ± 0,81 mg*ml -1<br />
vorangegangenen Entnahmezeitpunkten.<br />
signifikant höher als an den beiden<br />
8<br />
*<br />
*<br />
vor Kolostrumaufnahme (N=19)<br />
nach Kolostrumaufnahme (N=19)<br />
6<br />
Tag 42 (N=19)<br />
4<br />
2<br />
0<br />
Abbildung 28: IgG2-Plasmakonzentrationen von Kälbern der Rasse Holstein-Friesian (n=19). Angaben als<br />
arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). RM One Way ANOVA mit Tukey Post Test<br />
48
IgM [mg*ml -1 ]<br />
IV. Ergebnisse<br />
Auch für IgM wurde ein Anstieg der Plasmakonzentration nach der<br />
Kolostrumaufnahme festgestellt (von 0,92 ± 0,39 mg*ml -1 auf 3,27 ± 1,11 mg*ml -1 ).<br />
Dieser ließ sich statistisch jedoch nicht bestätigen. Es gab jedoch einen statistisch<br />
signifikanten Effekt in der Zunahme der Plasma-IgM-Konzentration von vor der<br />
Kolostrumaufnahme zu Tag 42 (4,29 ± 1,05 mg*ml -1 ).<br />
6<br />
4<br />
*<br />
vor Kolostrumaufnahme (N=19)<br />
nach Kolostrumaufnahme (N=19)<br />
Tag 42 (N=19)<br />
2<br />
0<br />
Abbildung 29: IgM-Plasmakonzentrationen von Kälbern der Rasse Holstein-Friesian (n=13). Angaben als<br />
arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). RM One Way ANOVA mit Tukey Post Test<br />
49
V. Diskussion<br />
V. DISKUSSION<br />
5.1 Immunglobulinbestimmung im Plasma<br />
Trotz der großen Bedeutung, die dem Immunstatus des Rindes gerade im<br />
peripartalen Zeitraum in Klinik und Wissenschaft beigemessen wird, gibt es<br />
auf diesem Themengebiet bisher nur wenig publizierte Daten.<br />
Mit Hilfe eines in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Immunologie der<br />
<strong>Tierärztliche</strong>n <strong>Hochschule</strong> <strong>Hannover</strong> entwickelten Sandwich-ELISAs<br />
(HUSSEN 2012) konnten in der vorliegenden Studie IgG und IgM und<br />
erstmals auch die unterschiedlichen Isotypen von IgG (IgG1 und IgG2)<br />
quantitativ bestimmt werden. Ab der dritten Woche a.p. konnte ein<br />
signifikanter Abfall der Plasmakonzentration von IgG1 beobachtet werden.<br />
Die Konzentrationen von IgG2 blieben während des gesamten<br />
Untersuchungszeitraumes konstant.<br />
LARSON beschrieb als einer der ersten Autoren (1958) eine Abnahme der<br />
γ 1 -Globulin-Konzentration im Serum von Kühen von der 6. Woche a.p. bis<br />
zur Geburt. Allerdings konnten mit der von ihm gewählten Methode der<br />
Gelelektrophorese lediglich Proteinfraktionen gemessen werden, welche<br />
nicht genauer bestimmt werden konnten. Darauf basierend folgten einige<br />
Studien, die sich mit der Quantifizierung der Immunglobulingehalte im<br />
bovinen Serum beschäftigten. Daraus resultierten sehr unterschiedliche<br />
Immunglobulinkonzentrationen, die für IgG mit Werten von 9,3 bis 36,8 ±<br />
11,6 mg*ml -1 und für IgM von 2,6 bis 8,6 mg*ml -1 angegeben wurden<br />
(KLAUS et al. 1969; CURTAIN et al. 1970; BRANDON et al. 1971;<br />
DUNCAN et al. 1972; J. E. BUTLER 1973; NORMAN u. HOHENBOKEN<br />
1981; GUNNINK 1984; DETILLEUX et al. 1995; FRANKLIN et al. 2005;<br />
HERR et al. 2011). Diese hohe Varianz ist möglicherweise darauf<br />
zurückzuführen, dass die Messungen unabhängig vom Leistungsstadium<br />
innerhalb der Reproduktionsperiode sowie mit unterschiedlichen Methoden<br />
(Radioimmunoassay, single radial immunodiffusion (sRid), ELISA) erfolgten<br />
(Tabelle 6.<br />
50
V. Diskussion<br />
Zwar geben die bereits publizierten Daten zu den Plasma IgG- und IgM-<br />
Konzentrationen eine gute Orientierung, allerdings lassen sie keine<br />
Rückschlüsse darüber zu, inwiefern die unterschiedlichen<br />
Reproduktionsabschnitte Einfluss auf die Antikörpergehalte im Plasma<br />
nehmen. Dabei wird in der Fachliteratur häufig die Meinung vertreten, dass<br />
die überdurchschnittlich hohe Anfälligkeit für Erkrankungen im peripartalen<br />
Zeitraum bei der Milchkuh in engem Zusammenhang mit einer Depression<br />
des Immunsystems stehe (GUNNINK 1984; GOFF u. HORST 1997; LEWIS<br />
1997; MALLARD et al. 1998). BOSTEDT und BERCHTHOLD postulierten<br />
bereits 1968, dass die humoralen Abwehrmechanismen des Milchrindes<br />
während der Geburt einer Depression unterliegen. Während der<br />
Austreibungsphase konnte eine signifikante Reduktion der eosinophilen<br />
Granulozyten gezeigt werden, die erst drei bis fünf Stunden p.p.<br />
abgeschlossen war. Die Dauer der Eosinopenie variierte dabei zwischen 12<br />
und 24 Stunden.<br />
5.1.1 IgG-Bestimmung im Plasma<br />
Die direkte Charakterisierung des Immunstatus der Milchkuh in diesem<br />
kritischen Zeitraum wurde erst in jüngerer Zeit Gegenstand einiger<br />
Untersuchungen (DETILLEUX et al. 1995; FRANKLIN et al. 2005; HERR et<br />
al. 2011). Diese Arbeitsgruppen beschäftigten sich mit der Bestimmung des<br />
tatsächlichen Immunglobulingehaltes im letzten Trimester der Trächtigkeit<br />
und den ersten drei Wochen p.p. In allen Publikationen konnte ein<br />
präpartaler Abfall der IgG- bzw. IgG1-Konzentration nachgewiesen werden.<br />
Allerdings gab es Unterschiede in Bezug auf die absoluten<br />
Immunglobulinkonzentrationen und auf den Beginn des<br />
Konzentrationsabfalls a.p. (Tabelle 6). DETILLEUX et al. (1995) konnten<br />
eine Reduktion des IgG1-Gehaltes von 5,6 mg*ml -1 (fünfte Woche a.p.) bis<br />
auf 2 mg*ml -1 (Geburt) feststellen. Dagegen beschrieben FRANKLIN et al.<br />
(2005) einen kontinuierlichen Abfall der IgG1-Konzentration von der vierten<br />
Woche a.p. bis zur Geburt (von 10,2 ± 0,9 auf 3,3 ± 0,7 mg*ml -1 intra<br />
partum) während HERR et al. (2011) einen Abfall des Gesamt-IgG von 36,8<br />
51
V. Diskussion<br />
± 11,6 mg*ml -1 acht Wochen a.p. auf 18,0 ± 9,1 mg*ml -1 einen Tag vor der<br />
Geburt nachweisen konnten. In der Studie von HERR et al. (2011) wurden<br />
auch unter der Geburt in den unterschiedlichen Geburtsphasen Blutproben<br />
für die Bestimmung für IgG gewonnen. Dabei konnte gezeigt werden, dass<br />
der Abfall der IgG-Konzentration erst bei Expulsion des Fetus mit 15,0 ± 6,4<br />
mg*ml -1 sein Minimum erreichte.<br />
Die Unterschiede in den absoluten Immunglobulinkonzentrationen stehen<br />
sicherlich mit dem versetzten Beginn der Studien in der achten bzw. fünften<br />
und vierten Woche a.p. in Zusammenhang. Außerdem haben HERR et al.<br />
(2011) sich auf die Bestimmung von Gesamt-IgG konzentriert, während in<br />
den anderen Studien IgG1 gemessen wurde. Darüber hinaus wurde die<br />
Studie von FRANKLIN et al. (2005) an 30 Rindern der Rasse Holstein<br />
Friesian und 20 Rindern der Rasse Jersey durchgeführt, wobei die<br />
Versuchs- und Kontrollgruppen unabhängig von der Rassenzugehörigkeit<br />
zusammengesetzt wurden. Weiterhin wurden sowohl die Rinder der<br />
Kontroll- als auch der Versuchsgruppe in der vierten und zweiten Woche<br />
a.p. mit Vakzinen gegen Rota- und Coronaviren sowie E. coli geimpft. Es ist<br />
daher fraglich, ob die angegebenen Immunglobulinkonzentrationen als<br />
Diskussionsgrundlage genutzt werden können, da sie aufgrund der<br />
erfolgten Impfung keine Referenzwerte darstellen können.<br />
DETILLEUX et al. (1995) konnten den Versuch zwar an einer größeren<br />
Tierzahl durchführen (137 Rinder der Rasse Holstein Friesian), Ziel der<br />
Studie war jedoch, eine genetisch determinierte Differenz der<br />
Immunfunktion bei verschiedenen Zuchtlinien milchbetonter Rassen zu<br />
untersuchen. Ebenso wie bei FRANKLIN et al. (2005) wurden die<br />
Konzentrationen von IgG1, IgG2 und IgM mittels radialer Immunodiffusion<br />
(sRid) bestimmt. Diese Methodik der Immunglobulinbestimmung ist<br />
allerdings besonders in dem niedrigen Konzentrationsbereich, in dem sich<br />
die intravasalen Immunglobulinkonzentrationen bewegen, mit nicht zu<br />
vernachlässigenden Ungenauigkeiten belegt (GRANZER 1986).<br />
HERR et al. (2011) verwendeten zur Bestimmung der<br />
Immunglobulinkonzentrationen einen von BENDER (2004) und BENDER<br />
und BOSTEDT (2008) entwickelten kompetitiven ELISA. Allerdings konnte<br />
52
V. Diskussion<br />
mit diesem Verfahren nur die Gesamtkonzentration an IgG bestimmt<br />
werden. Eine Differenzierung zwischen IgG1 und IgG2 war nicht möglich.<br />
Gerade bei der differenzierten Betrachtung der<br />
Immunglobulinkonzentrationen im peripartalen Zeitraum wäre eine<br />
Unterscheidung zwischen den einzelnen Isotypen durchaus interessant.<br />
Zum einen haben die Subtypen unterschiedliche Anteile am Gesamt-IgG<br />
(IgG1 etwa 60%, IgG2 etwa 40% des Gesamt-IgGs) (CURTAIN et al. 1970;<br />
BRANDON u. LASCELLES 1971; BUTLER 1973), zum anderen konnten<br />
SASAKI et al. (1976) in einer ähnlichen Studie ein unterschiedliches<br />
Verhalten der Isotypen im peripartalen Zeitraum zeigen. So kam es vor der<br />
Abkalbung zu einem Abfall von IgG1 im Plasma, während die Konzentration<br />
von IgG2 weitgehend unverändert blieb.<br />
Diese Beobachtung konnte in der vorliegenden Studie bestätigt werden.<br />
Allerdings gab es Unterschiede hinsichtlich der Immunglobulinkonzentration<br />
(Tabelle 6).<br />
HERR et al. (2011) ermittelten in einem ähnlichen Zeitraum (vier Wochen<br />
a.p.) einen Gesamt-IgG-Gehalt von 29,0 ± 11,6 mg*ml -1 . Von der Annahme<br />
ausgehend, dass IgG1 etwa 60% der Gesamt-IgG-Konzentration im Plasma<br />
ausmache (CURTAIN et al. 1970; BRANDON u. LASCELLES 1971; J. E.<br />
BUTLER 1973), errechneten HERR et al. (2011) einen IgG1-Gehalt von<br />
17,4 mg*ml -1 . Dieser Wert liegt deutlich über den Werten aus<br />
vorausgegangenen Studien von DETILLEUX et al. (1995), die fünf Wochen<br />
a.p. einen IgG1-Gehalt von etwa 6,0 mg*ml -1 ermittelten und FRANKLIN et<br />
al. (2005), die in ihrer Studie vier Wochen a.p. eine Konzentration von 10,2<br />
± 0,9 mg*ml -1 für IgG1 nachweisen konnten.<br />
Ähnliche Unterschiede gab es auch in Bezug auf das Ausmaß der<br />
absoluten Konzentrationsabnahme bis zur Geburt. DETILLEUX et al. (1995)<br />
zeigten eine IgG1-Reduktion von 5,6 mg*ml -1 auf 2,0 mg*ml -1 i.p., während<br />
FRANKLIN et al. (2005) einen präpartalen Abfall von 10,2 ± 0,9 mg*ml -1 auf<br />
3,3 ± 0,7 mg*ml -1 i.p. nachweisen konnten. HERR et al. (2011) konnten eine<br />
Abnahme des Gesamt-IgG-Gehaltes von 29,0 ± 11,6 mg*ml -1 auf 15,0 ± 6,4<br />
mg*ml -1 messen und ermittelten daraus rechnerisch eine anteiligen Verlust<br />
von 8,4 mg*ml -1 IgG1.<br />
53
V. Diskussion<br />
In der vorliegenden Studie wurde zum Geburtszeitpunkt ein Gesamt-IgG-<br />
Abfall von 19,85 ± 1,45 auf 14,91 ± 1,68 mg*ml -1 ermittelt. Der zum<br />
Geburtszeitpunkt ermittelte Wert setzte sich aus 2,9 ± 0,27 mg*ml -1 IgG1<br />
und 13,88 ± 1,66 mg*ml -1 IgG2 zusammen. Das bedeutet für IgG1 eine<br />
Gesamtreduktion von etwa 5,3 mg*ml -1 , während die Konzentration von<br />
IgG2 im Vergleich zum Messbeginn sogar um etwa 1,8 mg*ml -1 anstieg.<br />
Dieser Befund entspricht den Ergebnissen von KICKHÖFEN et al. (1968)<br />
und BUTLER (1969), die postulierten, dass nur IgG1 ins Kolostrum<br />
diffundiert, während IgG2 im Plasma verbleibt.<br />
Die Beobachtung, dass es bei der Milchkuh zu einem präpartalen Abfall der<br />
IgG1- und IgM-Konzentrationen kommt, erscheint zunächst widersprüchlich.<br />
Gerade im peripartalen Zeitraum sollte das Muttertier ein stabiles<br />
Immunsystem aufrechterhalten können. Ein bedeutender Faktor für die<br />
intravasale IgG1-Reduktion im letzten Trimester der Trächtigkeit ist die<br />
Diffusion der IgG1-Moleküle ins Kolostrum, wo sie zunächst akkumulieren.<br />
Diese Annahme wird von den Ergebnissen von LARSON (1958) gestützt,<br />
der erstmals präpartal (sechs Wochen a.p. bis zur Geburt) eine Erhöhung<br />
der Immunglobulinfraktion im trockenstehenden Euter bei gleichzeitigem<br />
Abfall der γ- und β-Globuline im Serum nachweisen konnte. Er stellte die<br />
These auf, dass während der Trockenstehphase ein Transfer der<br />
Immunglobuline aus dem Blut in das Euter existieren müsse. Allerdings<br />
konnte LARSON (1958) weder eine qualitative Angabe über den Isotyp<br />
noch eine quantitative Angabe über den absoluten Gehalt der<br />
Immunglobuline treffen. Auch KICKHÖFEN (1968) und BUTLER (1973)<br />
postulierten, die Erniedrigung der intravasalen γ- und β-Globuline in der<br />
Trockenstehperiode beruhe hauptsächlich auf einer Überführung des IgG1<br />
in die Milchdrüse, während IgG2 im Blut verbleibe. DETILLEUX et al. (1995)<br />
und FRANKLIN et al. (2005) beschrieben ebenfalls einen präpartalen Abfall<br />
von IgG1. Durch die vorgelegte Arbeit konnten diese Ergebnisse bestätigt<br />
werden.<br />
PRITCHETT et al. (1991) konnten in einer Studie an 919 Holstein-Friesian-<br />
Kühen zeigen, dass die Abkalbesaison, die Laktationsnummer, die Länge<br />
der Trockenstehperiode, das Zwischenkalbeintervall, die Milch- und<br />
Milchfettproduktion in der gesamten Laktation, das Gewicht des Kolostrums<br />
54
V. Diskussion<br />
und die Dauer von der Abkalbung bis zum ersten Melken einen Einfluss auf<br />
den IgG1-Gehalt im Kolostrum hatten. Somit ist nicht auszuschließen, dass<br />
auch die Immunglobulingehalte im Plasma von diesen Faktoren beeinflusst<br />
werden.<br />
Der Entzug des IgG1 aus dem maternalen Blutkreislauf im letzten Drittel der<br />
Gravidität und dessen Transfer ins Euter ist als physiologischer Vorgang zu<br />
bewerten. BARRINGTON et al. (1997) stellten in diesem Zusammenhang<br />
fest, dass im Eutergewebe trächtiger Milchkühe in der Trockenstehperiode<br />
vor allem IgG1-Rezeptoren exprimiert werden. Dabei konnten in<br />
trockenstehenden Eutern deutlich mehr Rezeptoren nachgewiesen werden<br />
als in laktierenden. So lässt sich die bereits von LARSON (1958),<br />
KICKHÖFEN et al. (1968) und BUTLER (1969) publizierte<br />
Umkompartimentierung der Immunglobuline (vorwiegend IgG1) ins Euter<br />
erklären. Weiterhin wurde der Frage nachgegangen, in welchen Zeitraum es<br />
zum Ausgleich des Verlustes der Immunglobuline im Plasma kommt. In<br />
dieser Studie konnte dabei ab Tag 3 p.p. ein sukzessiver Anstieg der IgG1-<br />
Konzentration im Plasma beobachtet werden. Etwa drei Wochen p.p.<br />
wurden die Ausgangskonzentrationen von IgG1 bereits wieder erreicht. Im<br />
Gegensatz dazu beschrieben HERR et al. (2011) bis zum Tag 7 p.p.<br />
konstant niedrigere Gesamt-IgG-Konzentrationen. Erst danach folgte ein<br />
stetiger Anstieg bis zur vierten Woche p.p. FRANKLIN et al. (2005)<br />
beschrieben zwar auch einen Anstieg der IgG1-Spiegel bis zur dritten<br />
Woche p.p., jedoch eignen sich die Messwerte aufgrund der Vakzinierung<br />
der Studientiere in der zweiten und vierten Woche a.p. nur bedingt zum<br />
Vergleich. Allerdings zeigen die Ergebnisse von DETILLEUX et al. (1995)<br />
einen Anstieg der IgG1-Konzentration. Auf diesem Niveau stagnierten die<br />
Werte bis zum Studienende (fünfte Woche p.p.). Für IgG2 zeigten<br />
DETILLEUX et al. (1995) einen protrahierten Anstieg der<br />
Plasmakonzentration bis zur dritten Woche p.p.<br />
55
V. Diskussion<br />
5.1.2 IgM-Bestimmung im Plasma<br />
Bei der Auswertung der Daten wurde ersichtlich, dass auch im Verlauf der<br />
IgM-Konzentration vom Ende der Laktation bis zur Geburt Unterschiede<br />
bestanden.<br />
In der Studie von FRANKLIN et al. (2005) blieben die IgM-Konzentrationen<br />
von der vierten Woche a.p. bis zur Geburt weitgehend konstant, wobei die<br />
Frage offen bleibt, inwiefern die Impfungen (Vakzinen gegen Rota- und<br />
Coronaviren sowie E. coli in der vierten und zweiten Woche a.p.) Einfluss<br />
auf die IgM-Konzentration genommen haben könnten. DETILLEUX et al.<br />
(1995) zeigten eine Abnahme der IgM-Konzentration von der fünften Woche<br />
a.p. bis zur Geburt, die allerdings statistisch nicht gesichert werden konnte.<br />
Post partum blieben die Werte auf einem konstant niedrigen Niveau. Die<br />
Ausgangskonzentrationen wurden auch zum Studienende nicht wieder<br />
erreicht.<br />
HERR et al. (2011) konnten dagegen ab der vierten Woche a.p. einen hoch<br />
signifikanten Abfall der intravasalen IgM-Konzentration nachweisen, der<br />
sich bis in die subpartale Periode fortsetzte. Nach der Geburt blieben die<br />
IgM-Spiegel über die gesamte Untersuchungsperiode bis zur vierten Woche<br />
p.p. auf einem konstanten Niveau und lagen deutlich unter den<br />
Konzentrationen zu Versuchsbeginn.<br />
Dieser Befund konnte durch die vorliegende Arbeit bestätigt werden.<br />
Allerdings kam es in dieser Studie erst unmittelbar vor der Geburt zu einem<br />
rapiden und sehr starken Abfall der IgM-Konzentration im Plasma. Da ein<br />
ähnliches Verhalten auch für IgG1 im Plasma beschrieben wurde, liegt die<br />
Vermutung nahe, dass auch IgM zum Geburtszeitpunkt ins Kolostrum<br />
umkompartimentiert wird. KICKHÖFEN et al. (1968) und BUTLER (1969)<br />
konnten auch im Kolostrum IgM-Konzentrationen nachweisen, die deutlich<br />
über den Konzentrationen im Plasma lagen. BOURNE und CURTIS (1973)<br />
beschrieben, dass ein großer Anteil des kolostralen IgM aus dem Serum<br />
stammt und mittels eines selektiven Transports aktiv in das Euter<br />
transportiert wird. Weiterhin zeigten BRANDTZAEG (1968) und<br />
56
V. Diskussion<br />
BRANDTZAEG et al. (1970; 1971a), dass menschliche Drüsenepithelien<br />
auch für IgM-Pentamere einen selektiven Transportmechanismus<br />
aufweisen. Hingegen stellten LASCELLES und McDOWELL (1970) die<br />
Vermutung auf, dass das Immunglobulin auf antigene Stimulation hin lokal<br />
im Euter synthetisiert wird.<br />
BARRINGTON et al. (1997) konnten mit Hilfe der Durchflusszytometrie in<br />
kurz vor der Geburt stehenden „trockenen“ Eutergeweben wesentlich<br />
höhere IgM-Konzentrationen nachweisen als in laktierenden Eutergeweben.<br />
Somit ist zumindest denkbar, dass auch eine Umkompartimentierung von<br />
IgM aus dem Plasma ins Euter möglich ist.<br />
UNDERDOWN (1989) konnte zeigen, dass der polymerische<br />
Immunglobulinrezeptor pIgR für den transzellulären Transport von sowohl<br />
dimerem IgA als auch von pentamerem IgM in Mukosa- und Drüsenzellen<br />
zuständig ist. Dieser Rezeptor konnte auch an der basolateralen Membran<br />
der Drüsenepithelzellen im bovinen Euter nachgewiesen werden (MOSTOV<br />
1994; HUNZIKER u. KRAEHENBUHL 1998).<br />
RINCHEVAL-ARNOLD et al. (2002) untersuchten die Ausprägung und die<br />
hormonelle Regulation des pIgR während der Entwicklung der Milchdrüse<br />
im Euter des Schafes. Dabei stellten sie fest, dass es im letzten Trimester<br />
der Trächtigkeit zu einer Akkumulation des Rezeptors im Euter kommt. Eine<br />
Behandlung mit Östradiol-17β und Progesteron führte zu einer leicht<br />
gesteigerten mRNA-Expression des pIgR. Eine zusätzliche Behandlung mit<br />
Glukokortikoiden führte zu einer signifikanten Akkumulation von pIgRmRNA<br />
in der Milchdrüse der behandelten Tiere. Bei Inhibition der Prolaktin-<br />
Sekretion konnte dagegen kein Anstieg in der mRNA-Expression gezeigt<br />
werden. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass eine Kombination<br />
von 17β-Östradiol, Progesteron, Glukokortikoiden und Prolaktin notwendig<br />
ist, um sowohl die Zelldifferenzierung im Euter als auch die Expression des<br />
pIgR zu induzieren. Außerdem kommt es v.a. in stark ausdifferenzierten<br />
Epithelzellen zur maximalen Ausprägung des pIgR.<br />
Zusammenfassend scheint die Expression des pIgR von komplexen<br />
Interaktionen zwischen Steroid- und Peptidhormonen reguliert zu werden.<br />
Dabei spielt der geburtsassoziierte rasche Abfall von Progesteron im<br />
Plasma eine besonders wichtige Rolle. Gleichzeitig kommt es zu einem<br />
57
V. Diskussion<br />
plötzlichen Anstieg von Prolaktin in Zusammenhang mit einem Anstieg der<br />
Glukokortikoid-Konzentration. Zu diesem Zeitpunkt ist Prolaktin<br />
möglicherweise ausschlaggebend für Aufrechterhaltung der pIgR-<br />
Expression auf hohem Niveau (RINCHEVAL-ARNOLD et al. 2002).<br />
In Studien an Ziegen und an Mäusen, bei denen radioaktiv markierte<br />
Disaccharide ins Euter appliziert wurden, konnte gezeigt werden, dass das<br />
Drüsenepithel während der Trächtigkeit auch für größere Moleküle<br />
durchlässig ist. LINZELL und PEAKER (1974) injizierten [ 14 C]-Saccharose in<br />
das Drüsenlumen von Ziegen und konnten den Marker unmittelbar nach der<br />
Injektion im Blut nachweisen. Nur eine geringe Fraktion des Markers war in<br />
der Milch nachweisbar. Im Gegensatz dazu konnte während der Laktation<br />
nach intramammärer Injektion kein Marker im Blut nachgewiesen werden<br />
(NGUYEN u. NEVILLE 1998). Weiterhin konnten LINZELL und PEAKER<br />
(1971, 1974) bei trächtigen Ziegen nachweisen, dass [ 14 C]-Saccharose<br />
auch aus dem Blut in die Milch diffundieren kann. Dass die tight junctions<br />
während der Trächtigkeit für große Moleküle durchlässig sind, wurde im<br />
Drüsenlumen trächtiger Mäuse durch den Transport von<br />
fluoreszenzmarkiertem Albumin und IgG aus dem Lumen ins Interstitium<br />
nachgewiesen (NGUYEN u. NEVILLE 1998). Während der Laktation waren<br />
diese Moleküle im Lumen der Milchdrüse gebunden.<br />
Elektronenmikroskopische Studien von PITELKA et al. (1973) zeigten, dass<br />
das Netzwerk der tight junctions während der Trächtigkeit noch<br />
unorganisiert ist und weniger Zell-Zell-Verbindungen aufweist als das hoch<br />
organisierte tight junctions-Netzwerk während der Laktation.<br />
Ergebnisse mehrerer Studien (LINZELL et al. 1975; ZETTL et al. 1992;<br />
FLINT u. GARDNER 1994; SINGER et al. 1994; THOMPSON 1996;<br />
NGUYEN et al. 2001) weisen darauf hin, dass Progesteron, Prolaktin und<br />
Glukokortikoide eine Rolle in der Regulation der tight junctions im<br />
Drüsenepithel der Milchdrüse spielen. Progesteron verhindert den Schluss<br />
der tight junctions während der Trächtigkeit, möglicherweise mit lokalen<br />
Faktoren wie TGF-β und Prostaglandin. Glukokortikoide werden für die<br />
Differenzierung des Drüsenepithels von trächtigen zum laktierenden Tier<br />
benötigt. Auch Prolaktin wird mit der Regulation der tight junctions im<br />
Drüsenepithel der Milchdrüse in Verbindung gebracht.<br />
58
V. Diskussion<br />
Weiterhin kommt es auf zellulärer Ebene zum Geburtszeitpunkt zu einer<br />
Reduktion der T- und B-Zellen im Blut. Um eine Immunantwort leisten zu<br />
können, ist eine zusätzliche Hilfe von antigenspezifischen T-Helferzellen für<br />
die B-Zellen sehr entscheidend. Die T-Zellhilfe führt zu Aktivierung,<br />
Proliferation und Ausdifferenzierung der B-Zellen in Antikörperproduzierende<br />
Plasmazellen (KUCHEN et al. 2007). Dieses könnte sich<br />
evtl. auch auf die Gesamtkonzentrationen der Immunglobuline im Plasma<br />
auswirken. Dazu kommt, dass IgM – zusammen mit IgA – eine deutlich<br />
geringere Halbwertszeit im Plasma hat (ca. vier Tage), da es durch pIgR<br />
schneller aus der Zirklulation entfernt werden kann (GODDEERIS 1998).<br />
Es kann nur spekuliert werden, ob sich der rapide Abfall der IgM-<br />
Konzentrationen im Plasma mit der Durchlässigkeit des Drüsenepithels a.p.<br />
erklären lässt, oder ob durch den pIgR doch ein aktiver Transport ins<br />
Drüsenlumen geschieht.<br />
Tabelle 6: Vergleich zwischen Literaturdaten und eigenen Messungen der Immunglobulinspiegel im<br />
Plasma a.p.<br />
59
V. Diskussion<br />
5.2 Abhängigkeit der Ig-Plasmakonzentrationen von der Laktationszahl<br />
Weiterhin wurde untersucht, ob eine Beziehung zwischen der<br />
Laktationsanzahl und der peripartalen Abnahme der IgG-Konzentration im<br />
Plasma besteht. HERR et al. (2011) gingen dieser Fragestellung in ihrer<br />
Studie erstmals nach, konnten allerdings über den gesamten<br />
Untersuchungszeitraum hinweg weder signifikante Unterschiede in den<br />
absoluten IgG-Konzentrationen noch einen von der Laktationszahl<br />
abhängigen IgG-Abfall a.p. feststellen.<br />
Im Gegensatz dazu konnten in dieser Studie für IgG1 deutliche<br />
Unterschiede zwischen den einzelnen Laktationsgruppen festgestellt<br />
werden. Insgesamt zeigten Kühe mit zwei oder mehr Laktationen über die<br />
gesamte Versuchsperiode signifikant höhere IgG1-Plasmaspiegel als Tiere<br />
in der ersten Laktation (11,4 ± 1,33 mg*ml -1 respektive 4,05 ± 0,79 mg*ml -1 ).<br />
Zur Geburt hin war bei diesen Tieren ebenfalls ein stärkerer Abfall von IgG1<br />
zu beobachten, ebenso wie ein steilerer Anstieg der Plasma-IgG1-<br />
Konzentration p.p..<br />
Im Verlauf von IgG2 und IgM konnten dagegen keine Unterschiede<br />
zwischen den einzelnen Laktationsgruppen festgestellt werden.<br />
5.3 Abhängigkeit der Ig-Plasmakonzentrationen von der Fütterung<br />
Im weiteren Verlauf wurde der Einfluss einer CLA-supplementierten<br />
Fütterung auf den Verlauf der unterschiedlichen Immunglobulin-Isotypen<br />
untersucht.<br />
Wie bereits erwähnt, wird die Immunfunktion von Milchkühen durch eine<br />
immunsupprimierte Zeitspanne um den Geburtszeitpunkt herum<br />
charakterisiert. Diese Immunsuppression führt u.a. zu einer reduzierten<br />
Monozytenantwort (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) auf<br />
Antigenstimulation (NONNECKE et al. 2003; LOISELLE et al. 2009). Dieses<br />
könnte durch eine p.p. erhöhte FFS-Konzentration im Serum hervorgerufen<br />
werden, die bei der erhöhten Fettmobilisierung in der Frühlaktation<br />
60
V. Diskussion<br />
freigesetzt werden. LACETERA et al. (2004b) konnten bereits zeigen, dass<br />
FFS die Proliferation von bovinem PBMCs in vitro hemmen. STAPLES et al.<br />
(2008) postulierten, dass eine Linolsäure-supplementierte Fütterung die<br />
Freisetzung von Prostaglandin F (PGF)-Metaboliten erhöhen könnte, da<br />
Linolsäure als Vorstufe dieses Metaboliten dient. Dieses kann um den<br />
Geburtszeitpunkt herum durchaus von Vorteil sein, da PGF-2α<br />
proinflammatorisch wirkt und somit zur Migration neutrophiler Granulozyten<br />
an den Ort des entzündlichen Geschehens beiträgt, so dass Entzündungen<br />
effektiver bekämpft werden können. Weiterhin wiesen Kühe, die mit CLA<br />
supplementiert worden waren, u.a. höhere Antikörperkonzentrationen im<br />
Kolostrum auf.<br />
Der Gehalt an FFS und BHB im Plasma der Tiere der vorliegenden<br />
Untersuchung wurde in einer anderen Studie bestimmt (PETZOLD et al.<br />
2013). Dabei konnte kein Einfluss der Fütterung nachgewiesen werden.<br />
Weiterhin konnte in der vorliegenden Studie entgegen den Ergebnissen von<br />
HUSSEN (2011b) ebenfalls kein Einfluss der Fütterung auf den Verlauf von<br />
IgG1, IgG2 und IgM nachgewiesen werden. Allerdings handelte es sich bei<br />
der Studie von HUSSEN (2011a, b) um eine Langzeitstudie, die einen<br />
Zeitraum von Tag -21 bis Tag 252 relativ zur Abkalbung untersuchte. Dabei<br />
traten die immunsuppressiven Effekte in der CLA100-Gruppe erst ab Tag<br />
21 p.p. auf. Von Tag 21 bis Tag 182 p.p. zeigte die CLA100-Gruppe<br />
signifikant niedrigere Anteile an CD4+αβ-T-Zellen als die Kontrollgruppe.<br />
Diese Wirkung zeigte vier Wochen nach dem Absetzen der CLAs (ab Tag<br />
210 p.p.) einen rückläufigen Effekt. Die IgG1- und IgG2-Spiegel waren in<br />
der CLA100-Gruppe ab Tag 7 p.p. signifikant niedriger als in den beiden<br />
anderen Gruppen. CLA100-Kühe zeigten ebenfalls signifikant niedrigere<br />
Milch-IgG1-Spiegel, verglichen mit den beiden anderen Gruppen.<br />
Die signifikant unterschiedlichen Mittelwerte für IgM an Tag 42 der<br />
vorliegenden Studie ergeben sich zwischen den Kontrollgruppen und der<br />
CLA-60B-Gruppe, die zu diesem Versuchszeitpunkt keinen Unterschied in<br />
der Fütterung der Kontrollgruppe aufwies. Somit sind die Unterschiede<br />
wahrscheinlich auf den geringen Stichprobenumfang und starke individuelle<br />
Schwankungen zurückzuführen.<br />
61
V. Diskussion<br />
Allerdings stammten in der vorliegenden Studie 75% der an Mastitis<br />
erkrankten Tiere (21 von insgesamt 28 Erkrankten) aus den mit CLA<br />
supplementierten Fütterungsgruppen. Dieser Befund passt zu den von<br />
HUSSEN et al. (2011a, b) gemachten Beobachtungen, dass die mit CLA<br />
gefütterten Tiere eine Depression der CD4+-T-Zellen zeigten. CD4+αβ-T-<br />
Helferzellen spielen eine zentrale Rolle in der Regulation des adaptiven<br />
Immunsystems (ROMANGNANI 2006). Ihre Bedeutung wird besonders<br />
deutlich bei angeborenen Infekten oder Infektionen, die zum Ausfall dieser<br />
Zellen führen. Ein Beispiel dafür ist das Humane Immundefizinz-Virus (HIV)<br />
(PIRZADA et al. 2006). CD4+αβ-T-Zellen erkennen die von MHC-Klasse-II<br />
präsentierten Peptide und sind, u.a. durch Sekretion von Zytokinen, für die<br />
Aktivierung von Makrophagen verantwortlich. Weiterhin unterstützen sie<br />
zytotoxische T-Zellen bei ihrer Aufgabe, virusinfizierte oder tumorentartete<br />
Zellen abzutöten und helfen B-Zellen bei der humoralen Immunantwort<br />
gegen T-Zell-abhängige Antigene (JANEWAY u. TRAVERS 2005).<br />
5.4 Abhängigkeit der Ig-Plasmakonzentrationen von der Energiebilanz<br />
Um eine Übersicht über die Stoffwechselsituation der Milchkühe im<br />
Versuchszeitraum zu erhalten, wurde die Energiebilanz berechnet und<br />
diese dann mit den Immunglobulinspiegeln im Plasma in Beziehung gesetzt.<br />
Tiere in der ersten Laktation wiesen über den gesamten Versuchszeitraum<br />
eine positivere Energiebilanz als Tiere in höheren Laktationen auf. In<br />
Zusammenhang mit der Milchleistung wird ersichtlich, dass die Färsen über<br />
den gesamten Versuchszeitraum hinweg deutlich weniger Milch<br />
produzierten als Kühe der 2. oder > 2. Laktation. Die<br />
Landwirtschaftskammer Schleswig-Holstein (MAHLKOW-NERGE 2012) gab<br />
für Färsen eine Jahresmilchmenge von 7.500 kg ECM (energy corrected<br />
milk) an, während Kühe der 2. Laktation 9.980 kg ECM und Kühe der 3.<br />
Laktation 10.469 kg ECM erreichten. Folglich liegt die Schlussfolgerung<br />
nahe, dass Färsen aufgrund ihrer geringeren Milchleistung auch einen<br />
geringeren Energieverlust zu Beginn der Laktation auszugleichen haben<br />
62
V. Diskussion<br />
und somit bereits früher als ältere Kühe wieder eine positive Energiebilanz<br />
aufweisen.<br />
Negative Effekte einer Energiemangelsituation auf Komponenten der<br />
zellulären Immunität sind bereits bekannt. Um proliferieren zu können, ist<br />
ausreichend Glukose für Lymphozyten essentiell (FOX et al. 2005).<br />
MEHRZAD et al. (2002) konnten im peripartalen Zeitraum außerdem eine<br />
signifikante Reduktion der Lymphozyten nachweisen. Da ihnen die<br />
Fähigkeit der autonomen Kontrolle für die Aufnahme der notwendigen<br />
metabolischen Substrate fehlt, sind auch T-Zellen von Glukose, Fettsäuren<br />
und Aminosäuren aus ihrer extrazellulären Umgebung angewiesen.<br />
Außerdem wird Energie für die Aktivierung von T-Zellen benötigt. Ruhende<br />
T-Zellen nutzen den Großteil ihrer Energiereserven, um ihren Stoffwechsel<br />
aufrecht zu erhalten. Stehen einer ruhenden T-Zelle nicht genügend<br />
Nährstoffe für die Aufrechterhaltung ihres Stoffwechsels zur Verfügung, wird<br />
die Apoptose der Zelle eingeleitet. Auch die replikative Zellteilung nach<br />
Antigenkontakt ist ein sehr energieaufwändiger Prozess, bei dem es bei<br />
naiven T-Zellen zu einem etwa 20-fachen Anstieg der Glukoseaufnahme<br />
innerhalb einer Stunde kommen kann (FOX et al. 2005). MEHRZAD et al.<br />
(2002) zeigten eine peripartale Reduktion der neutrophilen Granulozyten<br />
beim Rind. Die Zellen wiesen zwar eine erhöhte Phagozytoseleistung auf,<br />
zeigten aber ebenfalls eine reduzierte respiratory burst-Aktivität, was in<br />
einer verminderten bakteriziden Wirkung resultierte. Trotz dieser Einflüsse<br />
einer negativen Energiebilanz auf einige Zellen des angeborenen<br />
Immunsystems gibt es bisher keine Studien über die Auswirkungen eines<br />
Glukosemangels auf B-Zellen. Allerdings konnte in dieser Studie gezeigt<br />
werden, dass eine negative Energiebilanz zu keinem der untersuchten<br />
Zeitpunkte mit den Antikörpergehalten im Plasma korreliert.<br />
5.5 Immunglobulinbestimmung im Kolostrum<br />
Der Gesamt-IgG-Gehalt im Kolostrum spricht mit 61,51 ± 4,71 mg*ml -1 für<br />
ein qualitativ hochwertiges Kolostrum. Nach GUY et al. (1994) und<br />
ARTHINGTON et al. (1997) sollte hochwertiges Kolostrum mindestens 50<br />
mg*ml -1 an IgG enthalten.<br />
63
V. Diskussion<br />
5.5.1 Abhängigkeit der Immunglobulinkonzentrationen von der<br />
Laktationszahl<br />
Die Unterschiede zwischen den einzelnen Laktationsgruppen konnten auch<br />
bei der Bestimmung der Immunglobulinsubtypen im Kolostrum beobachtet<br />
werden. Auch hier gab es deutliche Unterschiede im IgG1-Gehalt in<br />
Abhängigkeit der Laktationszahl. Dabei wiesen Färsen an Tag 1 die<br />
höchsten gemessenen Werte an IgG1 im Kolostrum auf. Im Gegensatz<br />
dazu wiesen diese Tiere deutlich niedrigere Werte von kolostralem IgG2 auf<br />
(8,40 ± 1,41 mg*ml -1 ) als die Tiere der anderen Laktationsgruppen (11,65 ±<br />
2,45 mg*ml -1 für Tiere der 2. Laktation respektive 11,97 ± 3,10 mg*ml -1 für<br />
Tiere der > 2. Laktation).<br />
Diese Beobachtungen stehen im Gegensatz zum aktuellen<br />
wissenschaftlichen Stand. In einer Studie von SHEARER et al. (1992)<br />
wurden für Erstkalbende signifikant niedrigere Immunglobulingehalte<br />
ermittelt. Allerdings unterschieden sie nicht zwischen den unterschiedlichen<br />
Immunglobulin-Isotypen, sondern schätzten den gesamten<br />
Immunglobulingehalt ausschließlich anhand einer speziell entwickelten<br />
Skala am Kolostrometer, die auf dem Zusammenhang zwischen der<br />
spezifischen Schwerkraft des Kolostrums und seines<br />
Immunglobulingehaltes beruht (FLEENOR u. STOTT 1980). Auch andere<br />
Autoren postulierten bereits die These, dass die Konzentration an<br />
kolostralen Immunglobulinen in der ersten Laktation am niedrigsten ist und<br />
mit zunehmender Laktationsnummer steigt (KRUSE 1970 b; FOLEY u.<br />
OTTERBY 1978; DEVERY-POCUS u. LARSON 1983). In Studien von<br />
PRITCHETT et al. (1991) sowie MOORE et al. (2005) und KEHOE et al.<br />
(2011) wurde der Gehalt von Gesamt-IgG bzw. IgG1 im Kolostrum mittels<br />
sRID bestimmt. Auch hier wurde ein höherer Immunglobulingehalt bei<br />
Kühen in der dritten Laktation als bei Kühen der ersten oder zweiten<br />
Laktation nachgewiesen. Ein möglicher Grund für die Abweichung der<br />
Ergebnisse der vorliegenden Studie von ähnlichen Studien könnte in der<br />
gewählten Messtechnik liegen. Wie bereits erwähnt, kann es bei der sRID-<br />
64
V. Diskussion<br />
Methode zu nicht zu vernachlässigenden Messungenauigkeiten kommen.<br />
Des Weiteren wurden auch in dieser Studie bei der Bestimmung des<br />
Gesamt-IgG-Gehaltes im Kolostrum keine Unterschiede zwischen den<br />
einzelnen Laktationszahlen festgestellt. Erst bei der getrennten<br />
Untersuchung der einzelnen Isotypen wurden diese Unterschiede deutlich.<br />
KEHOE et al. (2011) konnten weiterhin in ihrer Studie zeigen, dass die IgG-<br />
Konzentration mit steigendem Volumen des Kolostrums abnimmt. Dieses<br />
widerspricht den in derselben Studie ermittelten Ergebnissen, dass das<br />
Kolostrum von Färsen geringere Immunglobulinkonzentrationen aufweist als<br />
das von multiparen Kühen. PRITCHETT et al. stellten bereits 1991 fest,<br />
dass die Immunglobulinkonzentrationen im Kolostrum mit steigender<br />
Erstgemelkmenge abnimmt. Gerade hoch leistende Milchkühe produzieren<br />
eine weitaus größere Menge an Kolostrum als Färsen. Bei steigender<br />
Milchmenge in höheren Laktationen kann auch ein Verdünnungseffekt nicht<br />
ausgeschlossen werden.<br />
Weiterhin zeigte sich, dass die gemessen kolostralen Werte der<br />
vorliegenden Studie mit den Ergebnissen von STENGEL (1998) und HERR<br />
et al. (2011) übereinstimmen (Tabelle 7).<br />
Tabelle 7: Vergleich zwischen Literaturdaten und eigenen Messungen der Immunglobulinspiegel im<br />
Kolostrum<br />
65
V. Diskussion<br />
5.6 Immunglobulinbestimmung im Plasma der Kälber<br />
Aufgrund der plazentären Verhältnisse ist beim Rind, im Gegensatz zu<br />
Nagetieren, Primaten und dem Menschen eine diaplazentare Übertragung<br />
maternaler Antikörper zur passiven Immunisierung des Fetus nicht möglich.<br />
Bei der Placenta epitheliochorialis cotyledonaria des Rindes kann der fetomaternale<br />
Stoffaustausch ausschließlich durch Endo- und Exozytose<br />
erfolgen (BOSTEDT 2004). Eine erleichterte Diffusion zum Transport<br />
höhermolekularer Substanzen ist nicht möglich (SAMUEL et al. 1976).<br />
Durch die Plazenta des Rindes können nur kleinere Moleküle aus dem<br />
Kreislauf der Mutter in den des Fetus übertreten (BJÖRCKMAN 1954).<br />
Immunglobuline können somit als Makromoleküle die Plazentarschranke<br />
des Rindes nicht penetrieren (SCHNORR 1996). Somit verfügen<br />
neugeborene Kälber zum Zeitpunkt der Geburt nicht über maternale<br />
Antikörper. In neueren Studien von STENGEL (1998), BENDER (2004) und<br />
LACK (2006) konnte jedoch gezeigt werden, dass Kälber bereits vor der<br />
ersten Kolostrumaufnahme geringe Mengen an IgG und IgM im Plasma<br />
aufweisen.<br />
Dieses konnte auch in vorliegender Studie bestätigt werden. Wahrscheinlich<br />
stammen diese Immunglobuline aus eigener Synthese. Dass Kälber bereits<br />
im letzten Trimester der Gravidität ein vollständig entwickeltes<br />
Immunsystem aufweisen und mit einer adaptiven Immunantwort auf<br />
entsprechende Stimuli reagieren können, konnten auch KELLING und<br />
TOPLIFF (2013) in ihrer Studie zeigen.<br />
66
VI. Zusammenfassung<br />
VI. ZUSAMMENFASSUNG<br />
Jana Horn<br />
Konzentrationen der Immunglobuline IgG1, IgG2 und IgM im peripartalen<br />
Zeitraum unter Berücksichtigung der Energiebilanz sowie der Fütterung mit<br />
konjugierten Linolsäuren<br />
Bei hochleistenden Milchkühen kommt es mit Einsetzen der Milchproduktion zu<br />
einem Ungleichgewicht zwischen Energieaufnahme und Energieabgabe, was zur<br />
Ausprägung einer negativen Energiebilanz führt. Gerade in diesem Zeitraum haben<br />
die Tiere eine erhöhte Anfälligkeit für so genannte „Produktionskrankheiten“ wie<br />
Labmagenverlagerung, Nachgeburtsverhaltung, Klauenerkrankungen, Ketose,<br />
Mastitis und andere fieberhafte Erkrankungen. Es ist bereits bekannt, dass die<br />
Supplementierung von konjugierten Linolsäuren (CLAs) positive Effekte auf die<br />
Gesundheit der Milchkühe haben kann. Weiterhin sind bereits negative Effekte eines<br />
Energiemangels auf einige Immunzellen wie neutrophile Granulozyten und T-<br />
Lymphozyten beschrieben worden. Ziel dieser Studie war es, den Verlauf und das<br />
Verhalten der Immunglobulin-Isotypen IgG1, IgG2 und IgM im peripartalen Zeitraum<br />
unter der Berücksichtigung einer CLA-Fütterung sowie der Energiebilanz zu<br />
untersuchen.<br />
21 Tage vor dem errechneten Geburtstermin wurden 63 hochtragende Milchkühe in<br />
vier Fütterungsgruppen eingeteilt (CLA bzw. Kontrollfett, hohe bzw. niedrigere<br />
Kraftfutterkonzentration). Über einen Versuchszeitraum von insgesamt 11 Wochen<br />
wurden den Tieren in regelmäßigen Abständen Blut- und Milchproben entnommen.<br />
Weiterhin wurden den Kälbern vor und nach ihrer ersten Kolostrumaufnahme sowie<br />
an Tag 42 ebenfalls Plasmaproben entnommen. Die Bestimmung der<br />
Immunglobuline IgG1, IgG2 und IgM in Plasma und Kolostrum erfolgte mittels eines<br />
enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) mit spezifischen Antikörpern.<br />
Sowohl IgG1 als auch IgM zeigten um den Geburtszeitpunkt einen signifikanten<br />
Abfall der Plasmakonzentrationen. Dieser war für IgM bereits kurz nach der Geburt<br />
wieder ausgeglichen, während die Plasmaspiegel von IgG1 langsamer ansteigen und<br />
etwa drei Wochen p.p. wieder Konzentrationen wie zu Versuchsbeginn zeigten. Die<br />
Plasmaspiegel von IgG2 blieben über die gesamte Versuchsperiode konstant. Der<br />
67
VI. Zusammenfassung<br />
Verlauf von IgG1 zeigte eine starke Abhängigkeit von der Laktationszahl. Färsen<br />
wiesen deutlich niedrigere Plasmaspiegel auf als ältere Kühe und zeigten um den<br />
Geburtszeitpunkt herum keinen deutlichen Abfall der Plasmakonzentrationen. Die<br />
Fütterung hatte keinen Einfluss auf die Höhe der Immunglobulinspiegel im Plasma.<br />
Auch die Energiebilanz korrelierte zu keinem Zeitpunkt mit den Plasma-<br />
Immunglobulinkonzentrationen. Sowohl IgG1 als auch IgG2 und IgM waren im<br />
Kolostrum nachweisbar, wobei das Verhältnis IgG1:IgG2:IgM etwa 4:2:1 betrug.<br />
Färsen hatten die höchsten IgG1- und die niedrigsten IgG2-Konzentrationen im<br />
Kolostrum. Dieser Befund steht im Gegensatz zu den Ergebnissen der einschlägigen<br />
Literatur. Dieses könnte einerseits an der in den meisten Studien verwendeten<br />
Methodik (sRid) liegen. Andererseits muss bei den älteren Tieren auch ein<br />
Verdünnungseffekt in Betracht gezogen werden, so dass die absoluten<br />
Immunglobulinkonzentrationen relativiert werden.<br />
Bei den Kälbern konnten bereits vor der ersten Kolostrumaufnahme geringe<br />
Plasmaspiegel aller drei untersuchten Immunglobulin-Isotypen nachgewiesen<br />
werden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass Kälber bereits ante partum in der<br />
Lage sind, geringe Mengen an Immunglobulinen selbst zu synthetisieren.<br />
Ziel weiterer Studien soll es sein, den Einfluss der Energiebilanz auf die zellulären<br />
Komponenten des Immunsystems zu untersuchen.<br />
68
VII. Summary<br />
VII. SUMMARY<br />
Jana Horn<br />
Concentrations of IgG1, IgG2 and IgM in plasma and colostrum of high yielding<br />
dairy cattle during the periparturient period with special reference to energy<br />
balance and conjugated linoleic acids as feed supplements.<br />
In early lactation, high yielding dairy cows are unable to meet their energy<br />
requirements for both maintenance and milk production. This leads to a high energy<br />
deficit. During this period, there is a higher risk for “production diseases” such as left<br />
abomasal displacement, retained placenta, lameness, ketosis, mastitis and other<br />
febrile diseases. It is recently known, that supplementation of conjugated linoleic<br />
acids could have positive effects on the health status of dairy cattle. Furthermore,<br />
high energy deficit leads to negative effects on several cell types of the immune<br />
system, such as neutrophils and T-cells.<br />
The study aimed to characterize the development of IgG1, IgG2 and IgM during the<br />
periparturient period in consideration of energy balance as well as supplementation<br />
with conjugated linoleic acids.<br />
Three weeks prior to calving, 63 pregnant German Holstein cows were assigned to<br />
one of four dietary treatments (CLA supplement respectively control fat, high<br />
respectively low concentrate diet). Plasma and milk samples were taken in regular<br />
intervals over a period of 11 weeks, respectively. Furthermore, plasma samples of<br />
their calves were taken prior and after their first Colostral uptake and on day 42.<br />
Bovine IgG1, IgG2 and IgM in plasma and colostrum were determined by an enzyme<br />
linked immunosorbent assay (ELISA) using isotype-specific coating and detection<br />
antibodies.<br />
In plasma, both IgG1 and IgM show a significant decrease around parturition. For<br />
IgM, the decline was equalized shortly after parturition, whereas IgG1 showed initial<br />
plasma values around 3 weeks p.p. Plasma levels of IgG2 remained unchanged<br />
during the entire experimental period. The developing of IgG1 revealed a strong<br />
dependency on the lactation number. Heifers had significantly lower plasma levels<br />
over the entire period and did not show such a distinct decrease around parturition.<br />
69
VII. Summary<br />
Dietary treatments had no effect on immunoglobulin plasma levels. IgG1, IgG2 and<br />
IgM were detectable in colostrum in which the ratio IgG1:IgG2:IgM was 4:2:1. Heifers<br />
showed the highest amounts of IgG1 and the lowest amounts of IgG2 in colostrum.<br />
These findings do not agree with the common literature, which could be due to the<br />
determination technique used in most of the studies (sRid). In addition, especially in<br />
older animals an effect of dilution cannot be excluded.<br />
In calves, low plasma levels of all examinated immunoglobulins could be detected<br />
even before their first colostral uptake. These results indicate, that calves are able to<br />
synthezise small amounts of immunoglobulins even ante partum.<br />
Further studies should be conducted to examine the influence of negative energy<br />
balance on cellular components of the immune system.<br />
70
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v
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Proceedings of the national academy of sciences U.S.A. 89, 9069-9073<br />
vi
IX. Anhang<br />
X. ANHANG<br />
Verwendete Chemikalien<br />
Dimethylsulfoxid (DMSO)<br />
Di-Natriumhydrogenphosphat (Na 2 HPO 4 )<br />
Natriumcarbonat (Na 2 CO 3 )<br />
Natriumchlorid (NaCl)<br />
Natrium-Dihydrogenphosphat (NaH 2 PO 4 )<br />
Natriumhydrogencarbonat (NaHCO 3 )<br />
Schwefelsäure (H 2 SO 4 ), 1N<br />
Tetramethylbenzidin (TMB)<br />
Tween 20<br />
Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 ), 30%<br />
Zitronensäure-Monohydrat (Citrat)<br />
Sigma-Aldrich, Steinheim<br />
Sigma-Aldrich, Steinheim<br />
Sigma-Aldrich, Steinheim<br />
Roth, Karlsruhe<br />
Roth, Karlsruhe<br />
Sigma-Aldrich, Steinheim<br />
Merck KG aA, Darmstadt<br />
Sigma-Aldrich, Steinheim<br />
Sigma-Aldrich, Karlsruhe<br />
Merck KG aA, Darmstadt<br />
Roth, Karlsruhe<br />
a
IX. Anhang<br />
Tabelle 8: Durchführung ELISA<br />
Arbeitsschritt Temperatur Menge in µl/Well Zeit<br />
Coaten der<br />
Mikrotiterplatte mit<br />
Sheep Anti-Bovine<br />
IgG1- bzw. IgG2-<br />
Antikörper und<br />
Coating-Puffer<br />
Waschen mit B-Puffer<br />
Inkubation mit<br />
Erstantikörper<br />
Waschen mit B-Puffer<br />
Inkubation mit<br />
Detektionsantikörper<br />
Waschen mit B-Puffer<br />
Inkubation mit<br />
Substratlösung<br />
Stoppen der<br />
Farbreaktion mit<br />
Stopplösung<br />
Messung der<br />
Extinktion bei 450 nm<br />
und 630 nm<br />
Raumtemperatur<br />
(RT) bzw. 4°C<br />
RT<br />
75 µl<br />
5 Waschgänge mit je<br />
300 µl B-Puffer/Well<br />
RT 75 µl<br />
RT<br />
5 Waschgänge mit je<br />
300 µl B-Puffer/Well<br />
RT 75 µl<br />
RT<br />
5 Waschgänge mit je<br />
300 µl B-Puffer/Well<br />
30 min auf dem<br />
Schüttler, dann über<br />
Nacht bei 4°C<br />
4 min<br />
1 h auf dem<br />
Schüttler<br />
4 min<br />
45 min auf dem<br />
Schüttler<br />
4 min<br />
RT 75 µl 15 – 20 min<br />
RT 50 µl<br />
b
IX. Anhang<br />
Tabelle 9: Verwendete Antikörper<br />
Name<br />
Sheep Anti-Bovine IgG1<br />
Sheep Anti-Bovine IgG2<br />
Sheep Anti-Bovine IgM<br />
HRP conjugated Sheep Anti-Bovine IgG1<br />
HRP conjugated Sheep Anti-Bovine IgG2<br />
HRP conjugated Sheep Anti-Bovine IgM<br />
Bovine Immunoglobulin Reference Serum<br />
A10-116A<br />
Bethyl Laboratories Inc., Montgomery,<br />
Texas, USA<br />
A10-117A<br />
Bethyl Laboratories Inc., Montgomery,<br />
Texas, USA<br />
A10-101A<br />
Bethyl Laboratories Inc., Montgomery,<br />
Texas, USA<br />
A10-116P<br />
Bethyl Laboratories Inc., Montgomery,<br />
Texas, USA<br />
A10-117P<br />
Bethyl Laboratories Inc., Montgomery,<br />
Texas, USA<br />
A10-101P<br />
Bethyl Laboratories Inc., Montgomery,<br />
Texas, USA<br />
RS10-103<br />
Bethyl Laboratories Inc., Montgomery,<br />
Texas, USA<br />
c
IX. Anhang<br />
Tabelle 10: Übersicht über verwendete Lösungen<br />
Name<br />
Zusammensetzung<br />
Coating-Puffer („A-Puffer“)<br />
Verdünnungspuffer („B-Puffer”)<br />
Substratpuffer („C-Puffer“)<br />
Substrat<br />
Substratlösung<br />
15 mM Na 2 CO 3<br />
35 mM NaHCO 3<br />
pH = 9,6<br />
2,5 mM NaH 2 PO 4<br />
7,5 mM Na 2 HPO 4<br />
145 mM NaCl<br />
0,1% Tween 20<br />
pH = 7,2<br />
33,3 mM Citrat<br />
66,7 mM Na 2 HPO 4<br />
pH = 5,0<br />
1,5 mg 3,3,‘5,5‘-Tetramethylbenzidine (TMB,<br />
Sigma) gelöst in 1,0 ml DMSO<br />
1 ml TMB<br />
10 ml Substratpuffer („C-Puffer“)<br />
40 µl H 2 O 2<br />
Stopplösung 1 N H 2 SO 4<br />
d
IX. Anhang<br />
Tabelle 11: Zusammensetzung der verwendeten Puffer<br />
Puffer A COATING pH 9,6<br />
Substanz Molar H 2 O MW g/L g/0,5 l<br />
1 a<br />
0x 105,99 1,590 0,795<br />
b<br />
1x 124,00 1,860 0,930<br />
Na 2 CO 3 0,015<br />
c<br />
10x 286, 14 4,292 2,146<br />
2 a NaHCO 3 0,035 0x 84,01 2,940 1,470<br />
Puffer B WASCHEN / VERDÜNNEN pH 7,2<br />
Substanz Molar H 2 O MW g/L g/5,0 l 1<br />
1 a<br />
0x 120,00 0,300 15,00<br />
b<br />
1x 137,99 0,345 17,25<br />
NaH 2 PO 4 0,0025<br />
c<br />
2x 156,01 0,390 19,50<br />
2 a<br />
b<br />
0x<br />
2x<br />
142,00<br />
177,99<br />
1,065<br />
1,335<br />
53,25<br />
66,75<br />
c<br />
0,0075 7x 268,07 2,010 100,53<br />
Na 2 HPO 4<br />
d<br />
12x 358,14 2,686 134,30<br />
3 a NaCl 0,1450 0x 58,44 8,474 423,69<br />
4 a Tween 20<br />
final<br />
vom Tween 20 aus der Flasche<br />
(0,1%)<br />
1 ml 50 ml<br />
Puffer C SUBSTRAT pH 5,0<br />
Substanz Molar H 2 O MW g/L g/5,0 l 2<br />
1 a<br />
0x 192,13 6,398 3,199<br />
Citrat 0,0333<br />
b<br />
1x 210,14 6,998 3,499<br />
2 a<br />
b<br />
0x<br />
2x<br />
142,00<br />
177,99<br />
9,467<br />
11,866<br />
4,733<br />
5,933<br />
c<br />
0,0667 7x 268,07 17,871 8,936<br />
Na 2 HPO 4<br />
d<br />
12x 358,14 23,867 11,938<br />
1 Konzentrat (auf 5,0 l): pH 6,8<br />
e
IX. Anhang<br />
Originaldaten<br />
Tabelle 12: Originaldaten IgG1 (Plasma)<br />
71
IX. Anhang<br />
Tabelle 13: Originaldaten IgG2 (Plasma)<br />
72
IX. Anhang<br />
Tabelle 14: Originaldaten IgM (Plasma)<br />
73
IX. Anhang<br />
Tabelle 15: Originaldaten IgG1 (Plasma) und EB (Tier 1 bis 36)<br />
74
IX. Anhang<br />
Tabelle 16: Originaldaten IgG1 (Plasma) und EB (Tier 37 bis 66)<br />
75
IX. Anhang<br />
Tabelle 17: Originaldaten IgG2 (Plasma) und EB (Tier 1 bis 39)<br />
76
IX. Anhang<br />
Tabelle 18: Originaldaten IgG2 (Plasma) und EB (Tier 40 bis 66)<br />
77
IX. Anhang<br />
Tabelle 19: Originaldaten IgM (Plasma) und EB<br />
78
IX. Anhang<br />
Tabelle 20: Originaldaten Kolostrum (Tier 1 bis 59)<br />
79
IX. Anhang<br />
Tabelle 21: Originaldaten Kolostrum (Tier 60 bis 66)<br />
Tabelle 22: Originaldaten Kälber IgG1 (Plasma)<br />
80
IX. Anhang<br />
Tabelle 23: Originaldaten Kälber IgG2 (Plasma)<br />
Tabelle 24: Originaldaten Plasma Kälber IgM (Plasma)<br />
81
X. Danksagung<br />
VIII. DANKSAGUNG<br />
Bereits Wilhelm Busch wusste Bescheid: Es ist ein lobenswerter Brauch: wer was<br />
Gutes bekommt, der bedankt sich auch. Und weil ich in den letzten 2 ½ Jahren so<br />
viel Gutes bekommen habe, möchte ich mich an dieser Stelle auch mal bedanken.<br />
An erster Stelle danke ich Herrn Prof. Dr. Gerhard Breves für die Überlassung des<br />
interessanten Themas und die freundliche Aufnahme in die Arbeitsgruppe. Ich habe<br />
in der Physiologie eine tolle Zeit verbracht, an die ich mich sicher immer gerne<br />
zurück erinnern werde.<br />
Vielen Dank Marion und Kerstin, für eure Geduld beim Bestellen und der<br />
Beantwortung aller meiner Fragen und - nicht zu vergessen - für eure Hilfe beim<br />
Abzentrifugieren und Umfüllen und vor allem Waschen dieser unendlich vielen<br />
Milchprobengefäße. Danke an Jens, Imke und Inga für das Proben nehmen und<br />
Micha für das Abholen der Proben aus Braunschweig („Es sind auch nur ein paar<br />
Kartons…“).<br />
Weiterhin möchte ich mich bei allen Mitarbeitern und Mitarbeiterinnen der<br />
Arbeitsgruppe Tierernährung des Friedrich-Löffler-Institutes in Braunschweig<br />
bedanken, allen voran bei Herrn Prof. Dr. Dr. Sven Dänicke und Herrn Dr. Ulrich<br />
Meyer für die Bereitstellung der Proben aus dem Tierversuch M48 und ganz<br />
besonders bei Maria Petzold für ihre unendliche Geduld im Fragen beantworten und<br />
für die Zeit, die sie sich für meine Statistik genommen hat.<br />
Vielen Dank allen Mitarbeitern und Mitarbeiterinnen der Arbeitsgemeinschaft<br />
Immunologie, besonders Herrn appl. Prof. Dr. Hans-Joachim Schuberth für die<br />
Bereitstellung des ELISA-Labors, aller Materialien, die ich für meinen ELISA benötigt<br />
habe und natürlich auch für die selbstverständliche Hilfe und das Wissen, auf das ich<br />
jederzeit zugreifen durfte. Außerdem möchte ich mich ganz besonders bei Silke, Udo<br />
und Jamal bedanken, weil sie immer da waren, wenn ich sie brauchte und natürlich<br />
auch, weil sie mir meinen ELISA beigebracht haben und mir bei allen großen und<br />
kleinen Katastrophen immer zur Seite standen. Danke auch an Anna, Mirja, Johanna<br />
und Nino, dafür dass ihr mich wie selbstverständlich aufgenommen habt und mir das<br />
71
X. Danksagung<br />
Gefühl gegeben habt, dazuzugehören – ich habe mich in der Immunologie<br />
euretwegen immer sehr wohl gefühlt und werde die gemeinsamen Frühstücks-<br />
Exzesse sehr vermissen.<br />
Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Hartwig Bostedt, für die<br />
selbstverständliche Beantwortung aller meiner Fragen und die Bereitstellung der<br />
Literatur für meine Diskussion.<br />
Vielen vielen Dank an meine tollen Kollegen, die mir die Zeit in der Physio so leicht<br />
gemacht haben: danke Steffi, dass du dir solche Arbeit mit meiner Arbeit gemacht<br />
hast und dass du so bist wie du bist. Ich werde dich schrecklich vermissen. Danke<br />
Mirja, für deine unermüdliche Hilfe mit meiner doofen Statistik – ohne dich wäre das<br />
alles nie was geworden.<br />
Danke Imke und Gigi, dafür, dass ihr mich mit zum Klettern genommen habt und<br />
dafür, dass ihr da ward, wenn ich Hilfe brauchte beim Doktorand-Sein. Ohne euch<br />
hätte ich mich am Anfang bestimmt nicht so gut zurechtgefunden und ich vermisse<br />
euch schon jetzt ungefähr immer. Danke Katrin, für die Runden auf der Bult und für<br />
die Männergespräche (und Lene, weil du meine Tasche getragen hast, als ich zwei<br />
Hände für Mila brauchte und natürlich Finja, weil du Mila verziehen hast, dass sie dir<br />
manchmal Kopfschmerzen bereitet hat). Danke Matthias und Martina, für die<br />
unermüdliche Arbeit an eurem Paper und dass ihr mir damit die Zeit so oft versüßt<br />
habt, danke Matthias für Gespräche, die ich bisher noch mit niemandem geführt habe<br />
und die auf eine besondere Art und Weise sicherlich meinen Horizont erweitert<br />
haben und dafür, dass du uns manchmal aus der Zeitung vorgelesen hast, das<br />
werde ich sehr vermissen, und ich nehme an, auch mein Überblick über das aktuelle<br />
Tagesgeschehen in Deutschland und der Welt wird darunter leiden, dass ich dich<br />
nicht mehr täglich sehe. Und danke dafür, dass du mir ganz zum Schluss – und<br />
wahrscheinlich ohne es zu wissen – den Weg zurück gezeigt hast. Danke Gesine<br />
und Kristin dafür, dass ihr für mich ungefähr perfekt seid: schön, schlau, sportlich und<br />
dann auch noch so nett, dass man noch nicht mal sauer auf euch ist, weil man<br />
beinahe platzt vor Neid. Schade, dass ihr zwei Jahre zu spät angefangen habt mit<br />
der Doktorarbeit, ich hätte so gern mehr von euch gehabt.<br />
Und: danke Johanna. Ohne dich weiß ich gar nicht, wie ich das alles überstanden<br />
hätte. Danke, dass du immer für mich (und für meine Statistik-, Literatur-, Format-<br />
72
X. Danksagung<br />
und Privatprobleme) da warst (ich hab dir prophezeit, dass ich anfange zu heulen,<br />
wenn ich das hier schreibe, schon ist es passiert). Ich bin so froh, dass wir uns<br />
getroffen haben. Ich vermisse dich jetzt schon so schrecklich, das kannst du dir gar<br />
nicht vorstellen. Du bist mein Ernie, ich bin dein Bert – und das wird für immer so<br />
bleiben.<br />
Vielen vielen Dank auch an alle, die schon viel länger für mich da sind: danke Judith<br />
und Fredi und Desi, dafür, dass ihr die besten Freunde seid, die man sich wünschen<br />
kann und extradanke nochmal an Desi, weil ohne dich der ganze Kram noch lange<br />
nicht fertig wäre. Danke Anna, Claudi, Jan und Fabian, dafür, dass ihr mich nie habt<br />
vergessen lassen, dass es auch noch andere Dinge als die Tiermedizin gibt und dass<br />
die auch wichtig und spannend sein können, danke Bine und Christian für das „Zu<br />
Hause-Gefühl“ und danke Katrin und Karl-Ludwig dafür, dass ihr mir immer wieder<br />
gezeigt habt, dass Tiere gesund machen ganz genau das ist, was ich schon immer<br />
machen wollte und was ich für immer machen will und natürlich dafür, dass ihr mich<br />
so aufgenommen habt, wie ihr mich aufgenommen habt und dass ich mich bei euch<br />
genau so wohl fühle wie zu Hause.<br />
Und ganz zum Schluss: danke an die Menschen, die mir am Allerwichtigsten sind:<br />
danke Mama und Papa, dafür, dass ihr immer für mich da seid, dafür, dass ihr immer<br />
hinter mir steht und an mich glaubt und dafür, dass ihr mich zu dem Menschen<br />
gemacht habt, der ich heute bin. Danke Insa, weil du die allerbeste Schwester bist,<br />
die man sich vorstellen kann, ich wüsste nicht, was ich ohne dich machen sollte.<br />
Ich habe euch sehr lieb.<br />
Und: vielen vielen Dank Justus, Peter und Bob. Ohne euch wäre einiges so viel<br />
schwerer zu ertragen.<br />
Mein größter Dank aber dem, der mich mit offenen Armen empfangen hat, als ich zu<br />
ihm zurückgekommen bin, der immer für mich da war und auch immer da sein wird.<br />
Ich bin gespannt auf den Plan, den Du für mich hast und freue mich darauf, meinen<br />
Weg gemeinsam mit Dir zu gehen.<br />
73