Dokument 1.pdf - RWTH Aachen University

Aus der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie
des Kindes- und Jugendalters, Lehr- und Forschungsgebiet
Translationale Hirnforschung in Psychiatrie und Neurologie
(Leitung: Prof. Dr. med. Florian Daniel Zepf,
Professor als Juniorprofessor)
Untersuchungen des Einflusses des Acute Tryptophan Depletion-Test
Moja-De auf den Tryptophan-Influx in das zentrale Nervensystem,
die Leptin-Achse und periphere Neuropeptid Y-Konzentrationen
Von der Medizinischen Fakultät
der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen
zur Erlangung des akademischen Grades
einer Doktorin der Medizin
genehmigte Dissertation
vorgelegt von
Vita Louisa Sophie Dingerkus
aus
Münster
Berichter:
Herr Professor als Juniorprofessor
Dr. med. Florian Zepf
Herr Universitätsprofessor
Dr. med. Dr. rer.nat. Klaus Mathiak
Tag der mündlichen Prüfung: 11. November 2013
Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek
online verfügbar.

Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Grundlegende Prinzipien des Acute Tryptophan Depletion-Test . . . 1
1.2 Verwendung und Verbreitung des Acute Tryptophan Depletion-Test . 3
1.3 Zusammenhang zwischen Serotonin und Leptin . . . . . . . . . . . . 4
1.4 Zusammenhang zwischen Serotonin und Neuropeptid Y . . . . . . . . 6
2 Ziele und Fragestellungen 8
3 Methoden 10
3.1 Studiendesign . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
3.2 Untersuchtes Studienkollektiv . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
3.3 Vergabe des Acute Tryptophan Depletion-Test Moja-De . . . . . . . . 11
3.4 Analyse der Blutproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
3.5 Datenauswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
3.5.1 Statistische Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
3.5.2 Berechnung des Tryptophan-Influxes und des freien Leptin-
Index . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
4 Resultate 17
4.1 Tryptophan-Influx über die Blut-Hirn-Schranke . . . . . . . . . . . . 17
4.2 Konzentrations-Zeit-Verläufe der Aminosäuren . . . . . . . . . . . . . 19
4.3 Untersuchung der Leptin-Achse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
4.4 Untersuchung peripherer Neuropeptid Y-Konzentrationen . . . . . . . 27
5 Diskussion 29
5.1 Influx von Tryptophan über die Blut-Hirn-Schranke . . . . . . . . . . 29
5.2 Verlaufskonzentrationen der Aminosäuren . . . . . . . . . . . . . . . 32
5.3 Einfluss des Acute Tryptophan Depletion-Test auf die Leptin-Achse . 34
5.4 Einfluss des Acute Tryptophan Depletion-Test auf Neuropeptid Y . . 40
6 Zusammenfassung 43
7 Summary 45
8 Literaturverzeichnis 47
A Anhang 62
A.1 Verzeichnis der Tabellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
A.2 Verzeichnis der Abbildungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
A.3 Erfolgte Veröffentlichung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
A.4 Danksagung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

Abkürzungsverzeichnis
125 I-NPY Jod-125-markiertes Neuropeptid Y
5-HIAA 5-Hydroxyindolessigsäure
5-HT Serotonin
5-HTP 5-Hydroxytryptophan
α-MSH Alpha-melanozytenstimulierendes Hormon
µmol Mikromol
AAAD Aromatische Aminosäuredecarboxylase
AgRP Agouti-related protein
AS Aminosäure(n)
ATD Acute Tryptophan Depletion
AN Anorexia nervosa
BAL Balanced Amino Acid Load
BDNF Brain-derived neurotrophic factor (Wachstumsfaktor)
BE Blutentnahme
BMI Body Mass Index
BN Bulimia nervosa
BSA Rinderserumalbumin
(engl.: bovine serum albumin)
C Plasmakonzentration
(engl.: concentration)
CAA Konkurrierende Aminosäuren
(engl.: competing amino acids)
cAMP Zyklisches Adenosinmonophosphat
(engl.: cylic adenosine monophosphate)
cAMP Zyklisches Guanosinmonophosphat
(engl.: cyclic guanosine monophosphate)
df Freiheitsgrad
(engl.: degree of freedom)
F F-Wert
FLI Freier Leptin-Index
fTRP Freies Tryptophan
g Gramm
g n Normfallbeschleunigung (9,80665 m s 2 )
HIS Histidin
HPLC Hochdruckflüssigkeitschromatographie
(engl.: high-pressure liquid chromatography)
Htr Serotonin-Rezeptor
ICD 10 International classification of diseases, 10 th revision
IgG Immunglobulin G

ILE Isoleucin
K d
Diffusionskonstante
HPA-Achse Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse
(engl.: hypothalamic-pituitary-adrenal axis)
kDa Kilodalton
kg Kilogramm
KG Körpergewicht
K m
l Liter
Affinitätskonstante (Michaeliskonstante)
LNAA Langkettige neutrale Aminosäuren
(engl.: large neutral amino acids)
LYS Lysin
LEU Leucin
M Mittelwert
m 2
Quadratmeter
MAO Monoaminooxidase
MC3R Melanocortin-3-Rezeptor
MC4R Melanocortin-4-Rezeptor
MET Methionin
min Minute(n)
mol Mol
NaOH Natriumhydroxid
nmol Nanomol
NO Stickstoffmonoxid
(engl. nitric oxide)
NOS Stickstoffmonoxidsynthase
(engl. nitric oxide synthase)
NPY Neuropeptid Y
ob/ob Homozygote Leptindefizienz
Ob-R Leptin-Rezeptor/-en
OPA Orthophthal-Aldehyd
p p-Wert (Signifikanzwert)
PBS Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
(engl.: phosphate buffered saline)
PCPA P-Chlorophenylalanin
PDE Phosphodiesterase
PET Positronen-Emissions-Tomographie
pg Pikogramm
PHE Phenylalanin
POMC Pro-Opiomelanocortin
PYY Peptid YY

RMANOVA Varianzanalysen mit Messwiederholung
(engl.: repeated-measures analyses of variance)
RTD Rapid Tryptophan Depletion
SD Standardabweichung
(engl.: standard deviation)
Sert-cre Serotonintransporter-Transgen
SKIDPIT Strukturiertes Klinisches Interview
(Screening für psychische Störungen)
sOB-R Lösliche, extrazelluläre Domäne des Leptin-Rezeptors
(engl.: soluble extracellular domain of the leptin receptor)
T Zeitpunkt
THR Threonin
TPH Tryptophanhydroxylase
TRP Tryptophan
TNF-α Tumor-Nekrose-Faktor alpha
TYR Tyrosin
VAL Valin
V max
Maximale Substratumwandlung
w/v Gewicht pro Volumen
(engl.: weight per volume)
ZNS Zentrales Nervensystem

1 Einleitung
In der vorliegenden Arbeit soll die Auswirkung der Einnahme des Acute Tryptophan
Depletion Test“ (ATD) Moja-De (Kewitz, 2002; Demisch et al., 2002) auf die
”
Hormone Leptin und Neuropeptid Y (NPY) untersucht werden. Ziel ist zum einen,
die Rolle von Serotonin (5-HT) im Energiemetabolismus besser verstehen zu können.
Zum anderen soll der Einfluss des ATD-Test in der Modifikation Moja-De auf den
Tryptophan-Influx über die Blut-Hirn-Schranke in das zentrale Nervensystem (ZNS)
untersucht werden.
Adipositas ist eines der großen Probleme im Bereich Gesundheit industrieller Staaten.
Studien zum Thema Hunger, Sättigung und Stoffwechsel sind daher von großer
Bedeutung. Aber auch für die Forschung zu Essstörungen wie Anorexia nervosa (AN)
und Bulimia nervosa (BN), deren Pathophysiologie noch immer nicht vollständig aufgeklärt
ist, ist das Verständnis der Hunger- und Sättigungsregulation des Körpers,
der Feedback-Mechanismen und Interaktionen von Botenstoffen und Neurotransmittern,
neurochemisch von Bedeutung. Insbesondere dem Proteohormon Leptin
kommt bei der Entwicklung und Prognose nach Behandlung von AN eine wichtige
Rolle zu (Casanueva et al., 1997; Ehrlich et al., 2008; Ehrlich et al., 2009).
In der Einleitung soll ein kurzer Einblick in die für diese Arbeit relevanten Regulationsvorgänge
des Fett- und Hungerstoffwechsels gegeben werden, speziell in Hinblick
auf die Hormone NPY und Leptin sowie deren pathophysiologische Bedeutung bei
Essstörungen. Der Schwerpunkt liegt dabei auf einem möglichen Zusammenhang
von NPY bzw. Leptin mit 5-HT, auf dessen zentralnervöse Verfügbarkeit durch den
ATD-Test im Sinne einer verringerten zentralnervösen Synthese von 5-HT maßgeblich
Einfluss genommen werden kann. Die Effektivität des ATD-Test Moja-De ist
in Tier- und Humanexperimenten bereits belegt worden. Sein Wirkprinzip und Zusammenhang
mit der Synthese von 5-HT sowie dessen Anwendung sollen in der
Einleitung zunächst vorgestellt werden. Danach wird auf die Wirkungen von Leptin
und NPY im Energiestoffwechsel und in der Hunger- und Sättigungsregulation sowie
auf mögliche Zusammenhänge mit 5-HT eingegangen.
1.1 Grundlegende Prinzipien des Acute Tryptophan Depletion-Test
Der ATD-Test Moja-De (bzw. in der Literatur auch bekannt als Rapid Tryptophan
”
Depletion-Test“, RTD-Test) ist eine vielfach angewandte Methode, um kurzfristig
die 5-HT-Synthese im zentralen Nervensystem zu vermindern. Durch die Einnahme
des ATD-Test, einem Aminosäuregemisch in wässriger Lösung, wird die Aufnahme
von Tryptophan (TRP), der physiologischen 5-HT-Präkusoraminosäure, über die
Blut-Hirn-Schranke – und somit auch die 5-HT-Synthese im Gehirn – vermindert.
5-HT ist ein monoaminerger Neurotransmitter, der im menschlichen Körper zum
1

größten Teil in den enterochromaffinen Zellen und in Thrombozyten vorkommt. Der
geringere neuronale Anteil des 5-HT ist peripher vor allem im Nervensystem des
Darms enthalten sowie zentral vor allem in den Raphe-Kernen der Formatio Reticularis.
Durch die Blut-Hirn-Schranke ist ein Übertreten von 5-HT von der Peripherie
in das ZNS nicht möglich. Demzufolge ist die Synthese von zentralem 5-HT abhängig
vom Influx von TRP über die Blut-Hirn-Schranke in das ZNS. Da lediglich ein Anteil
von ca. 10% des Influxes von TRP über die Blut-Hirn-Schranke mittels passiver
Diffusion erfolgt, ist die zentralnervöse 5-HT-Synthese auf Transportsysteme angewiesen,
welche die essenzielle Aminosäure (AS) TRP in das ZNS befördern. Der
sogenannte L1-Transporter des L-Systems ist ein natriumunabhängiger Transporter
für langkettige neutrale Aminosäuren (LNAA), der eine erleichterte Diffusion
zulässt. Die unidirektionale Aufnahme der LNAA mittels des L1-Transporters ist
unter physiologischen Bedingungen gesättigt. Transporter dieses Systems kommen
ubiquitär im Körper vor, im Unterschied zu den anderen Transportern weist der L1-
Transporter an der Blut-Hirn-Schranke jedoch eine 100-1000fach höhere Affinität
für die LNAA auf (Oldendorf & Szabo, 1976; Smith et al., 1987; Smith & Stoll,
1998; Hawkins et al., 2006). Hierbei konkurriert TRP mit den anderen ebenso aromatischen
AS Phenylalanin (PHE) und Tyrosin (TYR), den verzweigtkettigen AS
Leucin (LEU), Isoleucin (ILE) und Valin (VAL), sowie mit Methionin (MET), Histidin
(HIS) und Threonin (THR) um die Bindungsstelle des Transporters, der sich
an der luminalen sowie der abluminalen Seite der Kapillarendothelzellen der Blut-
Hirn-Schranke befindet.
Der TRP-Influx ist im Wesentlichen abhängig von der Plasma- bzw. Serumkonzentration
von TRP – hierbei wahrscheinlich vor allem von freiem TRP (fTRP), das im
Vergleich zu plasmaproteingebundenem TRP 5% der Gesamtplasmakonzentration
von TRP ausmacht – und von den Konzentrationen der anderen LNAA (Fernstrom
& Wurtman, 1972; Gessa et al., 1974 ; Tagliamonte et al., 1973). Die Influx-Rate
für die AS-Aufnahme aus dem Kreislauf in das ZNS über die Blut-Hirn-Schranke
kann mit Hilfe einer Michaelis-Menten-Kinetik mit kompetitiver Substrathemmung
berechnet werden (Oldendorf & Szabo, 1976; Pratt, 1979; Pardridge, 1983). Aus
dem in das ZNS gelangten TRP wird durch das Enzym Tryptophanhydroxylase 2
(TPH2) 5-Hydroxytryptophan (5-HTP) gebildet, aus welchem nachfolgend durch
enzymatische Carboxylierung 5-Hydroxytryptamin (5-HT) – Serotonin – entsteht,
siehe Abbildung 1 (S. 3). Das geschwindigkeitsbestimmende Enzym der zentralnervösen
5-HT-Synthese ist dabei die TPH2. Fehlt der TPH2 das Substrat (TRP),
so folgt daraus eine verminderte Synthese von 5-HT im ZNS. Auf diese Weise erfolgt
durch ein vermindertes Präkusorangebot für 5-HT (in Form von TRP) eine verringerte
zentralnervöse Synthese von 5-HT.
Durch den ATD-Test wird oral eine Mischung aus AS, nunmehr bezeichnet als konsumierte,
konkurrierende AS (engl.: competing amino acids, CAA), jedoch frei von
2

TRP, verabreicht. Dies erfolgt oft nach einem overnight fast“ bzw. einem overnight
” ”
protein fast“. Durch die fehlende TRP-Aufnahme einerseits und durch eine durch die
aufgenommenen AS stimulierte, gesteigerte Proteinsynthese in der Leber, die dem
Kreislauf weiterhin noch zirkulierendes TRP entzieht, andererseits, kommt es aufgrund
eines kompetitiven Antagonismus der CAA und TRP am L1-Transporter zu
einem verminderten TRP-Influx in das ZNS. Infolgedessen wird mittels ATD-Gabe
eine verminderte 5-HT-Syntheserate von etwa 90% erreicht (Young et al., 1999; Kewitz,
2002). In zahlreichen Studien von der Arbeitsgruppe um Gessa, Biggio, Moja
et. al sowie von Young und Mitarbeitern ist dieses Prinzip sowohl im Tiermodell als
auch beim Menschen belegt worden (Biggio et al., 1974; Gessa et al., 1974; Gessa
et al., 1975; Moja et al., 1988; Moja et al., 1989; Young et al., 1989).
Abbildung 1: Ablauf des zentralnervösen Serotonin-Metabolismus
Anmerkung zu Abbildung 1. Tryptophan (TRP) gelangt mittels L1-Transporter durch erleichterte
(unidirektionale) und zu einem geringen Anteil durch passive (bidirektionale) Diffusion über
die Blut-Hirn-Schranke in das ZNS. In serotonergen Neuronen wird TRP in 5-Hydroxytryptophan
(5-HTP) umgewandelt, katalysiert durch das Enzym Tryptophanhydroxylase 2 (TPH2). 5-HTP
wird durch die aromatische L-Aminosäuredecarboxylase (AAAD) in Serotonin (5-HT) umgewandelt.
Der Abbau erfolgt zunächst durch die mitochondrienmembranständige Monoaminooxidase
(MAO)-A oder MAO-B. Das dabei entstehende Zwischenprodukt 5-Hydroxyindolacetaldehyd wird
dann durch die Aldehyd-Dehydrogenase (AD) in 5-Hydroxyindolessigsäure (5-HIAA) umgewandelt,
die letztlich über die Nieren ausgeschieden wird. Darstellung in Anlehnung an Zepf (2012).
1.2 Verwendung und Verbreitung des Acute Tryptophan
Depletion-Test
Erste Veröffentlichungen zur Entwicklung der ATD-Methode erschienen Mitte der
70er Jahre des letzten Jahrhunderts (Gessa et al., 1974; Biggio et al., 1974; Gessa
et al., 1975). Später wurde das Verfahren in verschiedenen Studien geringfügig in
seiner Zusammensetzung und Galenik abgeändert (Young et al., 1985; Moja et al.,
1988; Delgado et al., 1990; Weltzin et al., 1994; Klaassen et al., 1999a; Kewitz, 2002).
In der Arbeit von Kewitz aus dem Jahr 2002 wurden die verschiedenen ATD-Tests,
genauer der ATD-Test nach Moja-De und der ATD-Test nach Young et al. mit 50,2g
3

AS, biochemisch, neurophysiologisch und neuropsychologisch untersucht und evaluiert
mit dem Ergebnis
“(...), dass nach Gabe der 33g Aminosäure-Mischung Moja-De die zentralnervöse
Serotoninsynthese stärker und schneller reduziert wird als
nach Gabe von RTD-Test Young-50“ (Zitat Kewitz, 2002).
Eigentlich in diese Untersuchungen mit einbezogen waren auch der ATD-Test nach
Young mit 100,4g sowie eine Kontrollbedingung mit ähnlicher Menge an AS, die jedoch
wegen Auftreten starker unerwünschter Nebenwirkungen wie Übelkeit und Erbrechen
im weiteren Verlauf der Studie ausgelassen (ATD-Bedingung) bzw. durch eine
Fruchtsaft-Wasser-Mischung ersetzt (Kontrollbedingung) wurden (Kewitz, 2002).
In der vorliegenden Arbeit wurde die durch Demisch et al. modifzierte Variante von
Moja, daher Moja-De genannt, angewandt, die sich durch eine besonders gute Verträglichkeit
auszeichnet (Demisch et al., 2002) und sich bereits in einigen Studien,
vor allem in der (neuro-) psychiatrischen Forschung bei Kindern und Jugendlichen
sowie auch bei Erwachsenen bewährt hat (z.B. Zimmermann et al., 2012; Kötting
et al., 2012).
Die Einsatzmöglichkeiten des ATD-Tests waren und sind immer noch vielseitig. Erste
Studien erfolgten auf dem Gebiet der Somnologie (z.B. Moja et al., 1979), auf
dem Gebiet der depressiven Störungen (z.B. Young et al., 1985; Delgado et al.,
1990; Delgado et al., 1991) oder zum Thema Angstregulation (z.B. Goddard et al.,
1995); weitere Einsatzgebiete folgten. Eine Zusammenfassung zur Verwendung des
ATD-Tests bei Erwachsenen bis zum Jahre 2000 geben Moore et al. (2000). Auch
bei Kindern und Jugendlichen wurde der ATD-Test Moja-De eingesetzt, so zum
Beispiel bei der Untersuchung der Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörung
(z.B. Zepf et al., 2008a). Weiterhin erfolgten Erhebungen bei Patienten/-innen mit
Essstörungen (z.B. Weltzin et al., 1995).
1.3 Zusammenhang zwischen Serotonin und Leptin
Leptin ist ein Hormon von zentraler Bedeutung in der (Feedback-) Regulation von
Hunger und Appetit. Von Adipozyten produziert und in das Blut abgegeben, reflektiert
es den Fettgehalt des Körpers, indem es im Gehirn über zytokintypische
Rezeptoren im Hypothalamus wirkt und durch spezifische Mechanismen den Appetit
hemmt. Dabei korreliert die Leptinkonzentration im Blut positiv mit dem Körpergewicht
und der Fettmenge im Körper (Benoit et al., 2004). Die Leptinsekretion
zeigt einen zirkadianen Rhythmus: Um die Mittagszeit sind die Plasmaspiegel relativ
gering und steigen dann nachmittags an, um nachts ihre Maximalwerte zu
erreichen (der Anstieg geht dabei dem morgendlichen Kortikotropin-Anstieg voraus)
(Jéquier, 2002). Über die Blut-Hirn-Schranke und die Blut-Liquor-Schranke gelangt
Leptin über noch nicht eindeutig identifizierte Transporter in das ZNS (Ziylan
et al., 2009). Leptin-Rezeptoren (Ob-R) sind in vielen Teilen des ZNS verbreitet.
4

Die in diesem Zusammenhang wichtigste Lokalisation ist der Hypothalamus. Dort,
genauer im Nucleus arcuatus, aktiviert Leptin Pro-Opiomelanocortin (POMC) synthetisierende
Neurone, welche wiederum in den Nucleus paraventricularis inserieren
und dort mittels ihres Spaltproduktes Alpha-melanozytenstimulierendes Hormon (α-
MSH) Melanocortin-3- und Melanocortin-4-Rezeptoren (MC3R und MR4R) aktivieren
(Benoit et al., 2004; Gautron & Elmquist, 2011). Von dort aus ziehen die Neurone
weiter in den Kortex, wo das Essverhalten gesteuert wird, und in das Stammhirn, von
wo aus das autonome Nervensystem beeinflusst werden kann. Ferner inhibiert Leptin
im Nucleus arcuatus Neurone, welche NPY und Agouti-related protein (AgRP)
synthetisieren und im Vergleich zu den POMC-Neuronen entgegengesetzt wirken.
Als Konsequenz dieser Wirkungen kommt es zu katabolen Stoffwechselbedingungen
(Rosenbaum et al., 2005).
Auch der Neurotransmitter 5-HT spielt in der Regulation des Energiehaushalts eine
wichtige Rolle (Nonogaki et al., 1998; Tecott et al., 1995). 5-HT-haltige Nervenendigungen
ziehen in den Nucleus arcuatus und wirken einerseits ähnlich wie Leptin
aktivierend auf POMC- und inhibierend auf NPY/AgRP-Neurone über die 5-HT-
Rezeptoren Htr1b bzw. Htr2c (Kiss et al., 1984; Heisler et al., 2002; Zhou et al.,
2005; Heisler et al., 2006). Andererseits wirkt hier 5-HT über Htr2b und Htr1a appetitsteigernd
(Yadav et al., 2009; Yadav et al., 2011; Oury & Karsenty, 2011).
Leptin wiederum nimmt auf die serotonerge Neurotransmission Einfluss, indem
durch Leptin im dorsalen Raphe-Kern die 5-HT-Synthese gehemmt wird (Yadav
et al., 2009). Ein direkter Einfluss von Leptin auf serotonerge Neurone gilt nicht
als eindeutig gesichert. Allerdings wird zumindest eine indirekte Beeinflussung der
beiden Systeme in Form von Synapsen zwischen zwei unterschiedlichen Nervenzellpopulationen
vermutet, auch im dorsalen Raphe-Kern, wo einerseits die TPH2 exprimiert
wird (Yadav et al., 2011) und andererseits auch eine relativ hohe Expression
von Ob-R beobachtet wurde (Lam et al., 2011; Gautron & Elmquist, 2011).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass 5-HT über verschiedene Rezeptorsysteme
unterschiedliche Wirkungen auf den Energiehaushalt hat: Über die 5-HT-Rezeptoren
Htr1a und Htr2b steigert 5-HT den Appetit, und über Htr1b and Htr2c kann der
Appetit gehemmt werden (Heisler et al., 2006 Oury & Karsenty, 2011), wobei 5-HT
im Gegensatz zu Leptin eher kurzfristig das Hungergefühl hemmt, während Leptin
eher auf lange Sicht den Zustand der Energiereserven reflektiert (Halford & Blundell,
2000).
Beide Botenstoffe sind relevant für Patienten/-innen mit Essstörungen wie AN oder
BN. Allein schon aufgrund einer verminderten Nahrungsaufnahme kann von Patienten/-innen
mit Essstörungen weniger 5-HT gebildet werden, jedoch auch darüber
hinaus gibt es Hinweise dafür, dass die Funktion dieses Neurotransmitters im Rahmen
von AN und BN gestört ist (Frank et al., 2002; Barbarich et al., 2003; Bailer
et al., 2004; Kaye et al., 2005; Bailer et al., 2007; Kaye et al., 2009).
5

Als gesichert gilt der Zusammenhang zwischen Essstörungen und einem gestörten
Leptin-Metabolismus. Patienten/-innen mit AN weisen neben einem niedrigen Body
Mass Index (BMI) und Merkmalen der Malnutrition niedrige Leptinkonzentrationen
auf. Während der Gewichtszunahme unter eingeleiteter Therapie beginnen
diese – wenn auch nicht linear zum BMI – wieder anzusteigen (Casanueva et al.,
1997; Ehrlich et al., 2008; Ehrlich et al., 2009). Follow-Up-Studien ergaben, dass
hohe Leptinkonzentrationen wiederum mit einem erhöhten Risiko für ein schlechteres
Ein-Jahres-Outcome nach Therapie verbunden sind, was ebenfalls klinische
Relevanz hat in Hinblick auf das Krankheits- bzw. Therapiemanagement (Holtkamp
et al., 2004).
In der Zusammenschau der bisherigen Befunde erscheint ein Zusammenhang zwischen
Leptin und veränderten zentralnervösen serotonergen Funktionen beim Menschen
möglich, wobei bisher vornehmlich tierexpermintelle Daten vorliegen (z.B.
Yadav et al., 2009; Lam et al., 2011). Daten an Menschen zur Untersuchung dieses
Zusammenhangs liegen kaum vor (Kauffman et al., 2005).
1.4 Zusammenhang zwischen Serotonin und Neuropeptid Y
Das Neuropeptid Y (NPY), ein 36 AS langes, C- terminal amidiertes Peptid, ist
ebenfalls ein wichtiger Regulator im Hunger- und Sättigungsgleichgewicht. Auch
hier spielt der Nucleus arcuatus eine entscheidende Rolle. NPY ist hier das meist
exprimierte Hormon, es kommt aber auch peripher sowie in weiteren Hirnregionen
vor (Nguyen et al., 2011). Diesbezüglich sind im Wesentlichen der Neokortex, der Locus
coeruleus und der Hippocampus zu nennen, wo NPY ferner Funktionen bei der
Regulation von Stressbewältigung oder Reproduktionsverhalten übernimmt (Lundberg,
1996; Carrasco & Van de Kar, 2003; Zhou et al., 2008).
NPY und AgRP, exprimiert durch die im obigen Abschnitt bereits erwähnten Neurone
im Nucleus arcuatus, wirken synergistisch: Während AgRP als Antagonist an
den ebenfalls bereits genannten MC3R und MC4R wirkt (hier also entgegengesetzt
zur Wirkung von Leptin), stimuliert NPY im lateralen Hypothalamus dortige
Neurone über die NPY Rezeptoren Y1 und Y5 (Morton & Schwartz, 2001). Diese
Neurone im Hypothalamus sind verschieden und enthalten je nach Art Orexin
oder Melanin-konzentrierendes Hormon. Durch Verbindungen zum viszerosensorischen
Nucleus tractus solitarii und zum Nucleus dorsalis nervi vagi, welcher eine
allgemein-viszeromotorische Funktion inne hat, wird die Nahrungsaufnahme angeregt
(de Rijke et al., 2005). Die NPY/AgRP-Neurone werden durch Insulin und Leptin
auf lange Sicht gehemmt; auf kurze Sicht werden sie durch Botenstoffe aus dem
Darm beeinflusst, z.B. inhibiert durch das Pepitd YY (PYY) und aktiviert durch
Ghrelin (Batterham & Bloom, 2003; Wren & Bloom, 2007). Der appetitfördernde
Effekt von NPY wird auch durch das Kortikotropin-freisetzende Hormon, das bei untergewichtigen
Patienten/-innen mit AN erhöht ist, gehemmt (Bailer & Kaye, 2003).
6

Auch bei NPY erscheint ein Zusammenhang mit Essstörungen wahrscheinlich. Untergewichtige
Patienten/-innen mit AN zeigten erhöhte NPY-Konzentrationen im
Liquor (Kaye et al., 1990; Baranowska et al., 2001). Dieser Befund erscheint widersprüchlich,
da Patienten/-innen mit AN trotz appetitfördernden Effekts von NPY oft
dauerhaft ein restriktives Essverhalten zeigen. Somit sind diesbezüglich weitere Untersuchungen
notwendig. Bei Patienten/-innen mit BN wiederum scheinen Liquorkonzentrationen
von NPY (und PYY) normal zu sein und erst nach einmonatiger
Abwesenheit bulimischer Symptome (Ess- und Brechanfälle) anzusteigen (Gendall
et al., 1999). Im Plasma von Patienten/-innen mit AN hat man verringerte NPY-
Konzentrationen gefunden; hingegen fand man im Plasma von Patienten/-innen mit
BN erhöhte Werte (Baranowska et al., 2001).
Über eine mögliche Interaktion zwischen 5-HT und NPY gibt es wenig eindeutige
Erkenntnisse. Lundberg beschrieb eine erhöhte NPY-Plasmakonzentration durch
eine NPY-Freisetzung von sympathischen perivaskulären Nervenendigungen (Lundberg,
1996). Daraus schließend sollte eine akute zentrale serotonerge Dysfunktion
wiederum einen Einfluss auf die NPY-Konzentration nehmen können, vor allem da
serotonerge Funktionen die Sympathikusaktivität modulieren (Ramage, 2001; Czermak
et al., 2008).
Bislang ist unbekannt, inwieweit Plasma- bzw. Serum-NPY-Konzentrationen im Zusammenhang
mit zentralen NPY-Konzentrationen stehen. Einige Veröffentlichungen
weisen darauf hin, dass Veränderungen zentraler NPY-Konzentrationen mit peripheren
Konzentrationen korrelieren, und dass NPY im Plasma auch zentral über
Y5-Rezeptoren in Arealen des Hirnstamms wirken kann, die Blut-Hirn-Schrankenfrei
sind (Larsen & Kristensen, 1997; Morgan et al., 2002; Czermak et al., 2008).
Inwiefern diese Systeme aneinander gekoppelt sind und sich dies im menschlichen
Körper auswirkt, ist gegenwärtig noch nicht ausreichend untersucht.
7

2 Ziele und Fragestellungen
Verschiedene ATD- (bzw. RTD-) Tests sind in Studien bereits evaluiert worden.
Jedoch fehlte es bislang an ATD-Studien, in denen neben ihrem eigentlichen Forschungsgegenstand
auch der TRP-Influx über die Blut-Hirn-Schranke errechnet und
berücksichtigt wurde. Der TRP-Influx dient als Abschätzung für das Ausmaß der
nach Einnahme des ATD-Test reduzierten 5-HT-Synthese bzw. der verminderten
Substratverfügbarkeit für die TPH2. In der vorliegenden Arbeit wird die Wirkung
der angewandten ATD-Methode, Moja-De, auf die Plasmakonzentrationen relevanter
AS und den TRP-Influx untersucht. Anhand der Berechnung des Influxes von
TRP über die Blut-Hirn-Schranke soll die ATD-Methode Moja-De im Hinblick
auf dessen Wirkung auf die zentrale 5-HT-Synthese untersucht werden. Aufgrund
zahlreicher tier- und humanexperimentell gewonnener Belege für bzw. Hinweise
auf die Wirkung von ATD auf eine verminderte TRP-Plasmakonzentration, folglich
auf eine verminderte Verfügbarkeit des Substrats für die 5-HT-Synthese im
ZNS, wird hier ein eindeutiges Ergebnis erwartet im Sinne von verringerten TRP-
Plasmakonzentrationen und einem verminderten TRP-Influx über die Blut-Hirn-
Schranke sowohl bei weiblichen als auch bei männlichen Studienteilnehmern/-innen.
Für einen verminderten Influx von TRP nach Einnahme des ATD-Test sind im
Vergleich zur TRP-Plasmakonzentration erhöhte CAA-Konzentrationen Voraussetzung.
Diese sind ebenfalls geschlechtsunabhängig zu erwarten, da sie durch die Aminosäuremischung
Moja-De in ausreichender Menge aufgenommen werden.
Zu den Zusammenhängen zwischen 5-HT und Leptin finden sich in aktuellen Veröffentlichungen
noch teilweise uneinheitliche Sichtweisen. Einerseits wird postuliert,
die Leptinwirkung sei serotonerg moduliert (Yadav et al., 2009; Oury & Karsenty,
2011). Andererseits wird dieser Behauptung widersprochen (Lam et al., 2011). Ein
Großteil der zu diesem Thema veröffentlichten Studien basieren auf tierexperimentellen
Untersuchungen. In dieser Arbeit wird in einer explorativen Vorgehensweise die
Auswirkung einer verminderten 5-HT-Synthese im ZNS mittels ATD Moja-De auf
Serumkonzentrationen von Leptin und dem löslichen Leptinrezeptor sOB-R (engl.:
soluble extracellular domain of the leptin receptor) untersucht.
In Hinblick auf die Auswirkung einer verminderten 5-HT-Synthese, hevorgerufen
durch ATD-Einnahme, auf periphere NPY-Konzentrationen liegt bereits eine Untersuchung
vor, die diesbezüglich keine signifikanten Veränderungen feststellen konnte
(Czermak et al., 2008). Der Aufbau jener Studie unterscheidet sich jedoch stark von
der vorliegenden Erhebung, sodass davon abweichende Ergebnisse möglich erscheinen.
Außerdem ist in der genannten Studie ein ATD-Verfahren genutzt worden, das
sich in seiner Zusammensetzung von dem hier verwendeten Verfahren Moja-De unterscheidet.
Auf die Unterschiede der Methodik wird in der Diskussion ausführlicher
eingegangen. In Bezug auf diesen Aspekt ist die Vorgehensweise explorativen Charakters,
da hierzu weitere Untersuchungen bei Menschen bisher fehlen.
8

Es stehen also bezüglich der Zusammenhänge von 5-HT und Leptin bzw. NPY folgende
Fragen offen, auf Grundlage derer die jeweiligen Hypothesen untersucht werden
sollen:
1. Wie verhält sich die Leptinkonzentration bzw. wie verhalten sich die Parameter
der Leptinachse im Serum unter Depletionsbedingungen?
Zu erwarten wäre nach dem Verständnis des bisherigen Forschungsstandes eine Verminderung
der Leptin-Konzentration unter ATD-Bedingungen im Vergleich zu einer
TRP-balancierten Kontrollbedingung (bzw. balanced amino acid load, BAL). Dies
setzt voraus, dass der untersuchte Zeitraum lang genug ist, um diese Entwicklung
beobachten zu können, da Leptin eher eine Rolle in langfristigen Regulationsmechanismen
von Sättigungs- und Hungerprozessen spielt. Die Leptinkonzentration
könnte sich möglicherweise auf längere Sicht auch kompensatorisch erhöhen. Hier
gibt es bislag keine Vorbefunde unter Verwendung des ATD-Test.
2. Welche Wirkung hat ATD Moja-De auf die NPY-Konzentration im Serum?
Hierbei könnte es wegen der serotonergen Auswirkung auf die Sympathikusaktivität
unter Depletion zu einer peripheren Reduktion der NPY-Freisetzung aus Nervenendigungen
kommen (Ramage, 2001; Czermak et al., 2008). Dies kann aufgrund einer
Studie von Lundberg et al. vermutet werden, wonach die NPY-Plasmakonzentration
durch die Freisetzung aus perivaskukären, sympathischen Nervenfasern erhöht sein
kann (Lundberg, 1996).
3. Gibt es Unterschiede zwischen männlichen und weiblichen Studienteilnehmern/-
innen, was die genannten Fragestellungen anbetrifft?
Frauen haben im Vergleich zu Männern unabhängig vom Körperfettanteil höhere
Leptinkonzentrationen. Es wird angenommen, dass Frauen resistenter“ gegenüber
”
den Wirkungen von Leptin sind (Thomas et al., 2000; Guerra et al., 2008). Auch
während der Pubertät zeigen sich geschlechtsspezifische Unterschiede (Ankarberg-
Lindgren et al., 2001). Das Geschlecht hat auch Einfluss auf den 5-HT-Stoffwechsel,
so erhöht Estradiol z.B. die Expression der 5-HT-Transporter im dorsalen und medianen
Raphe-Kern (Rivera et al., 2009; Brown & Clegg, 2010). Da ein Polymorphismus
des 5-HT-Rezeptor-Promotors mit AN, einer mehr Frauen als Männer betreffenden
Störung, assoziiert ist, hat diese Estradiol-Serotonin-Interaktion auch klinische
Bedeutung (Heils et al., 1996; Fumeron et al., 2001; Brown & Clegg, 2010).
Bezüglich des Einflusses des ATD-Tests wird bei Frauen aufgrund einer im Vergleich
zu Männern geringeren zentralnervösen 5HT-Synthese eine erhöhte Sensibilität angenommen
(Nishizawa et al., 1997). Ebenfalls wird die NPY-Neurotransmission durch
Estradiol beeinflusst. So stiegen beispielsweise NPY-Konzentrationen vorübergehend
im Nucleus paraventricularis bei gleichzeitig bestehender Leptinsensibiltät in ovarektomisierten
Mäusen an (Ainslie et al., 2001; Brown & Clegg, 2010).
Resümierend sind geschlechtsspezifisch unterschiedliche Ergebnisse bezüglich der Interaktionen
der verschiedenen Systeme von Leptin, NPY und 5-HT zu erwarten.
9

3 Methoden
3.1 Studiendesign
Bei der hier vorliegenden Pilotstudie handelt es sich um eine humanexperimentelle,
randomisierte, Doppelblindstudie im Crossover-Design bei gesunden, erwachsenen
Studienteilnehmern/-innen. Innersubjektive Messwiederholungsfaktoren waren
dabei die Vergabe des ATD-Test in der Modifikation Moja-De bzw. einer BAL-
Aminosäuremischung als Kontrollbedingung an zwei verschiedenen Untersuchungstagen.
Abhängige Variablen wurden zu vier verschiedenen Zeitpunkten erhoben.
Mit jeweils mindestens siebentägigem Abstand erhielten die Untersuchungsteilnehmer/-innen
nach einer proteinfreien Diät seit dem Vorabend (engl.: overnight protein
fast) des Untersuchungstages zu Beginn der Untersuchung eine Aminosäuremischung.
An einem Untersuchungstag wurde die ATD-Aminosäuremischung, an einem
weiteren Untersuchungstag die BAL-Aminosäuremischung verabreicht. Die Vergabe
erfolgte doppelblind über zahlenkodierte ATD- und BAL-Paare in optisch nicht
unterscheidbaren braunen Weithalsflaschen mit den entsprechenden Aminosäuremischungen.
Ein Untersuchungstag begann zwischen 8 und 9 Uhr morgens und dauerte ab Einnahme
der Aminosäuremischung ca. 4,5 Stunden. Vor jedem Untersuchungsbeginn
wurden eine Blutentnahme (BE) unter Basalbedingungen (= Baseline, Zeitpunkt
0 bzw. T0), ein Drogentest und bei Frauen ein Schwangerschaftstest durchgeführt.
Zum Zeitpunkt T1, 90 Minuten nach Einnahme von ATD/BAL, erfolgte die zweite
BE, nach 180 Minuten (T2) die dritte und nach 270 Minuten (T3) die vierte und
letzte BE des jeweiligen Untersuchungstages.
3.2 Untersuchtes Studienkollektiv
In die Studie wurden 24 gesunde, erwachsene Teilnehmer/-innen eingeschlossen. Das
untersuchte Studienkollektiv umfasste 12 Männer und 12 Frauen im Alter von 21-30
Jahren (das mittlere Alter lag bei 25,3 Jahren). Die Tabelle 1 stellt die Charakteristika
des Studienkollektivs dar (siehe S. 11).
Einschlusskriterien bzw. Voraussetzung für eine Teilnahme an der Studie waren
körperliche und psychische Gesundheit, was mittels der Kurzfassung des Strukturierten
Klinischen Interviews (SKIDPIT light Interview als Screening für psychische
Störungen, Wittchen et al., 1997) sowie durch ein Anamnesegespräch (auch bezüglich
körperlicher Erkrankungen) durch einen Arzt erfasst wurde. Frauen sollten sich, sofern
sie nicht hormonelle Kontrazeptiva einnahmen, in der präovulatorischen Phase
des Menstruationszyklus befinden. Termine wurden dementsprechend zyklusterminiert
vereinbart.
Ausschlusskriterien für eine Teilnahme an der Studie waren ein IQ unter 85, jegliche
Entwicklungsstörungen (im Sinne des Kapitels F80 des ICD-10 wie Sprach-
10

und Sprechstörungen, motorische Behinderungen, Störungen schulischer Fertigkeiten),
jegliche psychische Erkrankungen wie schizophrene und affektive Psychosen,
psychoorganische Syndrome, aktueller schädlicher Substanzmissbrauch, gravierende
körperliche Erkrankungen, mangelhafte Kenntnis der deutschen Sprache, regelmäßige
Medikamenteneinnahme (abgesehen von hormoneller Kontrazeption) und
Schwangerschaft.
Die Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der RWTH Aachen votierte das
Studienvorhaben positiv. Die Studie wurde im Einklang mit der Helsinki Deklaration
des Weltärztebundes in der letzten Revision (Seoul, 2008) durchgeführt.
Vor Studieneinschluss erfolgte eine schriftliche und mündliche Aufklärung der Studienteilnehmer/-innen
durch einen Arzt, bevor sie eine Einverständniserklärung unterschrieben.
Nach Untersuchungsabschluss erhielt jede Teilnehmerin/jeder Teilnehmer
eine Aufwandsentschädigung für die Studienteilnahme.
Tabelle 1: Charakteristika des Studienkollektivs mit Mittelwerten ± Standardabweichungen
Alter (Jahre) Gewicht (kg) BMI ( kg
m 2 )
Gesamt 25,34 ± 2,09 70,54 ±11,86 23,04 ± 1,86
Frauen 25,30 ± 1,69 61,00 ± 7,70 22,07 ± 1,63
Männer 25,39 ± 2,43 80,08 ± 6,30 24,01 ± 1,55
Anmerkung zu Tabelle 1. Mittelwerte ± Standardabweichungen der Charakteristika des Studienkollektivs:
Alter in Jahren, Gewicht in Kilogramm (kg) und Body Mass Index (BMI), berechnet
durch den Quotienten aus Körpergewicht in kg und dem Quadrat der Körpergröße in Metern (m).
3.3 Vergabe des Acute Tryptophan Depletion-Test
Moja-De
Die Vergabe des ATD-Test Moja-De erfolgte körpergewichtsadaptiert. Grundlage für
den hier gewählten Ansatz waren Vorbefunde, die zeigten, dass diese Modifikation
des ATD-Test eine individuell angepasste Aminosäurenvergabe möglich macht. Im
Vergleich zu anderen Modifkationen des ATD-Test wird somit trotz hoher Reduktion
des TRP-Influxes die Einnahme der Aminosäuren allgemein sehr gut toleriert,
sodass eine Anwendung auch bei Kindern und Jugendlichen möglich ist (Zepf et al.,
2008a; Zepf et al., 2008b; Kewitz, 2002).
Das Gewicht der Studienteilnehmer/-innen wurde erfasst und dementsprechend die
gewichtsadaptierte Menge der Aminosäuren für die ATD/BAL Aminosäuremischungen
in der Apotheke des Universitätsklinikums Aachen zusammengestellt. Die Dosierungen
(je 10kg Körpergewicht) der Aminosäuren für ATD/BAL sind in Tabelle
2 dargestellt.
11

Tabelle 2: Zusammensetzung der Aminosäuremischungen ATD/BAL in der Modifikation
Moja-De
AS L-ILE L-LEU L-LYS L-PHE L-THR L-VAL L-MET
Menge
g
(
10kg KG )
L-TRP
(nur BAL)
0,84 1,32 0,96 1,32 0,6 0,96 0,5 0,7
Anmerkung zu Tabelle 2. Mengenangaben der Aminosäuren, die im Acute Tryptophan
Depletion-Test bzw. der Kontroll-Aminosäuremischung Balanced Amino Acid Load (BAL) Moja-
De, enthalten sind: L-Isoleucin (ILE), L-Leucin (LYS), L-Lysin (LYS), L-Phenylalanin (PHE),
L-Threonin (THR), L-Valin (VAL), L-Methionin (MET); L-Tryptophan (TRP) war nur im TRP-
Balanced Amino Acid Load (BAL) enthalten. Angaben in Gramm (g) bezogen auf 10 Kilogramm
(kg) Körpergewicht (KG).
Die Aminosäuremischungen wurden in einem Kühlschrank paarweise (ATD/BAL)
verblindet bei +5 ◦ C gelagert. Die Zugehörigkeit zu einem/einer bestimmten Studienteilnehmer/-in
wurde durch die Angabe des Gewichts auf den Etiketten kenntlich gemacht
und das jeweilige Gewicht vor jedem ersten Untersuchungstag kontrolliert. Vor
der Teilnahme wurden die Teilnehmer/-innen instruiert, ab dem Abend vor den jeweiligen
Untersuchungstagen (20 Uhr) kein Eiweiß mehr zu sich zu nehmen. Weiterhin
wurde ein standardisiertes Frühstück mit geringem TRP-Gehalt (Brot/Brötchen
mit Marmelade ohne Butter bzw. mit Margarine ohne TRP-Gehalt) empfohlen. Die
Studienteilnehmer/-innen bestätigten am jeweiligen Untersuchungstag, diesen Anweisungen
Folge geleistet zu haben.
Die Vergabe der Aminosäuremischungen erfolgte in Form eines Getränkes, in dem
die Aminosäuren (ATD/BAL) in ca. 200 ml Wasser mittels eines Handquirls suspendiert
und verabreicht wurden. Weiterhin wurde der Suspension Kakao-Getränkepulver
hinzugefügt, zum einen als Emulgator, zum anderen als Geschmacksgeber,
da das Aminosäuregemisch vor allem durch den Anteil des schwefelhaltigen Methionins
unangenehm schmeckt. Die Teilnehmer/-innen wurden gebeten, den Trunk
möglichst zügig zu sich zu nehmen. Dabei wurde besonders darauf geachtet, dass
der Becher komplett leer getrunken wurde. Wegen des unangenehmen Geschmacks
konnten die Teilnehmer/-innen im Anschluss Apfelschorle und Fruchtbonbons zu
sich nehmen. Um eine Vitaminunterversorgung von Niacin zu vermeiden, wurde allen
Teilnehmern/-innen im Laufe eines jeden Untersuchungsstages eine kommerzielle
Vitamintablette mit Vitamin B6 angeboten. Nach Abschluss der Untersuchungen
erfolgte eine Entblindung bezüglich der ATD-/BAL-Aminosäuremischungen. Neun
Untersuchungsteilnehmer/-innen erhielten die ATD-Aminosäuremischung an ihrem
ersten Tag der Teilnahme (37,5%, darunter sechs Frauen und drei Männer), fünfzehn
Teilnehmer/-innen erhielten die ATD-Aminosäuremischung an ihrem zweiten
Untersuchungsstag (62,5%, darunter sechs Frauen und neun Männer).
12

3.4 Analyse der Blutproben
Pro Untersuchungstag wurden vier Blutentnahmen (BE) durchgeführt mit jeweils
zwei Röhrchen, einem mit Heparin für Plasma und einem nicht heparinisierten Röhrchen
für Serum. Aus dem gewonnenen Plasma sollten die Aminosäuren bestimmt
werden, aus den Serumproben alle weiteren Laborparameter. Nach jeder BE wurden
die Proben für 30 Minuten bei Raumtemperatur gelagert und dann bei 3500 g n für
die Dauer von 10 Minuten zentrifugiert. Anschließend wurden die Überstände in Eppendorf
Reaktionsgefäße pipettiert und diese bei -80 ◦ C gelagert, bis sie vom Transportservice
des analysierenden Labors (MLM Medical Labs, Mönchengladbach) abgeholt
wurden.
Nach einer Vorsäulen-Derivatisierung mittels Orthophthal-Aldehyd (OPA) wurden
die Aminosäurekonzentrationen durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (engl.:
high-pressure liquid chromatography, HPLC) bestimmt. An Albumin gebundenes
TRP wurde von fTRP mit Hilfe eines Amicon Ultra-0,5 Zentrifugalfilters (Merck-
Millipore, Darmstadt) für über 10 kDa große Komponenten bei 14000 g n für 30
Minuten getrennt.
Die Konzentrationen von NPY wurden durch kompetitiven Radio-Immunoassay
(IBL International GmbH, Hamburg) bestimmt. Dabei wurde ein Antiserum mit
Antikörpern gegen synthetisch hergestelltes NPY an den Träger Rinderthyroglobulin
konjugiert. Das NPY der Proben- und Kontrollseren konkurrierte dann mit
125 I-NPY um die Bindung mit den genannten Antikörpern. Durch umgekehrt proportionale
125 I-NPY-Bindung zu der NPY-Konzentration der Probe- bzw. Kontrollseren
konnte auf die NPY-Konzentrationen geschlossen werden.
Die Auswertung der hier präsentierten Daten von Leptin und sOB-R erfolgte durch
das Institut für Laboratoriumsmedizin, Klinische Chemie und Molekulare Diagnostik
des Universitätsklinikums Leipzig unter der Leitung von Prof. Dr. J. Kratzsch.
Dort wurde Leptin mittels eines hauseigenen Radioimmunoassay gemessen. Ein Zellkulturmedium
wurde in Krebs-Ringer-Puffer mit 0,5% (w/v) Rinderserumalbumin
(engl.: bovine serum albumin, BSA) 30 Minuten lang bei 37 ◦ C und 5% CO 2 inkubiert.
Dann wurde Leptin Tracer (Mediagnost, Reutlingen) hinzugefügt und für
60 Minuten inkubiert. Nachfolgend wurde zweifach mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung
(engl.: phosphate buffered saline, PBS) / 0,5% (w/v) BSA gewaschen.
Nach Lyse in 0,1 g
mol
NaOH-Lösung wurden die Aktivität der Zellaufbereitung mit
einem Gammazähler (Berthold LB2111, Berthold Technologies, Bad Wildbad) gemessen,
und die Leptinkonzentrationen durch Subtraktion der Radioaktivität in
Anwesenheit von unspezifisch gebundenem Leptin in der Probe von der Radioaktivität
in Anwesenheit eines Kontrollserums bestimmt (Kratzsch et al., 2002a; Schaab
et al., 2012).
Mit Anti-sOB-R IgG, welches in Kaninchen gegen rekombinanten sOB-R gezüchtet
wurde (R&D Systems, Wiesbaden), beschichtete Kavitäten von Mikrotitierplatten,
13

wurden mit PBS, 1% BSA inkubiert, sodass nach 60 Minuten bei Raumtemperatur
unspezifische Bindungsstellen geblockt wurden. Die Kavitäten wurden dann über
Nacht entweder mit Probe- oder Kontrollseren und einem Überschuss an biotinyliertem
Leptin in Assay Puffer (1% Kaninchen γ-Globulin, 0,1% BSA und 0,05%
Tween 20 in PBS) bei 4 ◦ C inkubiert. Mit Hilfe einer Standardkurve für rekombinanten
sOB-R, welcher von Liu et al. erstmals hergestellt wurde, konnte die Bestimmung
erfolgen (Liu et al., 1997; Kratzsch et al., 2002b). Der Komplex aus sOB-R
und biotinyliertem Leptin wurde durch Europium-gebundenes Stretavidin (Perkin-
Elmer, Freiburg) ermittelt. Jedem Schritt des Assays folgte ein Wasch-Vorgang mit
PBS, 0,05% Tween 20. Das Fluoreszenzsignal von Europium wurde mit dem Victor-
System von PerkinElmer (Rodgau) gemessen (Kratzsch et al., 2002b).
3.5 Datenauswertung
3.5.1 Statistische Analyse
Die statistische Auswertung der erhobenen Daten erfolgte mit SPSS (IBM Software
Group, Armonk, USA) sowie mit dem Programm Graph Pad Prism (GraphPad,
La Jolla, USA). Variablen wie der freie Leptin-Index (engl.: free leptin index, FLI)
und TRP-Influx wurden mit Hilfe von Excel-Anwendungen (Microsoft Corp., USA)
berechnet.
Die NPY-Daten eines Untersuchungsteilnehmers mussten für die NPY-Auswertung
ausgeschlossen werden (Ausreißer bei erhöhten NPY-Werten). Dem Teilnehmer wurde
nahegelegt, sich diesbezüglich ärztlich untersuchen zu lassen, da hohes NPY bei
Vorliegen eines Phäochromozytoms, Neuroblastoms oder einer B-Zell-Leukämie auftreten
kann (Adrian et al., 1983; Kogner et al., 1992; Kogner et al., 1993).
Das Signifikanzniveau wurde bei p < 0,05 festgelegt. Auf eine alpha-Adjustierung
wurde aufgrund des explorativen Charakters der Studie verzichtet. Die Variablen
wurden mittels Kolmogorow-Smirnow Goodness-of-Fit-Test auf Normalverteilung
überprüft, sowohl in der gesamten Kohorte als auch für weibliche und männliche
Studienteilnehmer/-innen getrennt. Bis auf THR und Leptin waren in der Gesamtkohorte
alle Variablen normalverteilt. Bei geschlechtsgetrennter Betrachtung waren
nur unter den Teilnehmerinnen VAL Konzentrationen nicht normalverteilt.
Getrennte Varianzanalysen mit Messwiederholung (engl.: repeated-measures analyses
of variance, RMANOVAs) wurden durchgeführt, um den Effekt von ATD auf
TRP- und fTRP-Konzentrationen, auf das Verhältnis TRP/CAA und den TRP-
Influx zu überprüfen. Die jeweilige neurochemische Challenge-Bedingung (ATD/
BAL) und der Zeitverlauf (Zeitpunkt nach Einnahme, T1-T3) des jeweiligen Aminosäurengetränks
waren Innersubjektfaktoren, der Faktor Geschlecht wurde als Zwischensubjektfaktor
in das Auswertungsmodell implementiert. Die gleichen Innerund
Zwischensubjektfaktoren wurden für weitere RMANOVAs genutzt, um die Aus-
14

wirkungen von ATD auf andere Aminosäuren, die mit TRP um den Influx in das
ZNS am L1-Aminosäuretransporter konkurrieren (hier ILE, LEU, LYS, MET, PHE,
THR, TYR und VAL), auf NPY-, Leptin- und sOB-R-Konzentrationen zu untersuchen.
Bei dimensionalen Auswertungsansätzen (Korrelationen) wurde für normalverteilte
Variablen der Korrelationskoeffizient nach Pearson berechnet, für nicht
normalverteilte Parameter wurde der Rangkorrelationskoeffizient nach Spearmans
Rho verwendet. Verbundene t-Tests für gepaarte Stichproben oder Wilcoxon-Tests
(bei nicht normalverteilten Daten) wurden für statistische Einzelvergleiche (posthoc)
innerhalb einer Gruppe zu zwei verschiedenen Zeitpunkten oder zum Vergleich
von unterschiedlichen Challenge-Bedingungen (ATD/BAL) verwendet. Unverbundene
t-Tests wurden bei geschlechtsbezogenen Einzelvergleichen bei sonst gleichen
Bedingungen bezüglich der Kontrolle des Zeitverlaufs und der jeweiligen Challenge-
Bedingung eingesetzt.
3.5.2 Berechnung des Tryptophan-Influxes und des freien Leptin-Index
Der TRP-Influx über die Blut-Hirn-Schranke hängt in erster Linie von den Konzentrationen
von TRP und der konkurrierenden LNAA ab sowie von deren Affinität zum
L1-Transporter, welcher der wichtigste Transporter für die Aufnahme der LNAA in
das ZNS ist (Oldendorf & Szabo, 1976; Pardridge, 1983; Smith & Stoll, 1998). Der
Influx von TRP kann nach Kewitz (2002) mit der folgenden modifizierten Formel
nach einer Michaelis-Menten-Kinetik mit einer Korrektur für multiple Substrathemmung
errechnet werden:
T RP − Influx =
V max · C
(K m [1 + Σ( C i
K i
)] + C) + K d · C
Hierbei bedeuten die Abkürzungen:
V max maximale Substratumwandlung von TRP
C TRP-Plasmakonzentration
K m Affinitätskonstante von TRP (Michaeliskonstante)
C i Plasmakonzentrationen der CAA
K i Affinitätskonstanten der CAA
K d Diffusionskonstante
Die Transportkonstanten für die verschiedenen Aminosäuren wurden übernommen
aus den Publikationen von Smith et al., 1987 und Smith & Stoll, 1998. Die einbezogenen
CAA waren in Anlehnung an Kewitz (2002) ILE, LEU, PHE, TYR und VAL,
um eine Vergleichbarkeit der Daten zu erlauben. Zusätzlich wurde durch den Einbezug
der TRP-Konzentration für die durch den TRP-Influx in Anspruch genommene
Influxkapazität am L-1 Transporter korrigiert.
15

Der FLI wurde durch das Verhältnis zwischen der Leptin- und der sOB-R-Konzentration
angegeben (Kratzsch et al., 2002b). Der sOB-R hat eine hohe Affinität zu
Leptin. Das nicht gebundene Leptin kann sehr leicht über die Blut-Hirn-Schranke
in das ZNS gelangen und kommt ferner in dieser Form im Liquor vor (Landt et al.,
2000). Die Arbeitsgruppe um Prof. Dr. Kratzsch konnte zeigen, dass der FLI ein geeignetes
Maß für die Untersuchung der Leptin-Achse während des Wachstums und
der sexuellen Entwicklung ist (Kratzsch et al., 2002b).
16

4 Resultate
Im folgenden werden die vornehmlich durch RMANOVAs ermittelten Auswirkungen
des ATD-Test jeweils auf den TRP-Influx, die verschiedenen AS-Plasmakonzentrationen,
auf die Leptin-Achse und die NPY-Serumkonzentration dargestellt.
Zur Verträglichkeit des ATD-Test ist zu berichten, dass die Teilnehmer/-innen nach
der Einnahme von ATD/BAL zu Kopfschmerzen, Übelkeit und Völlegefühl befragt
wurden. Drei von ihnen berichteten im Verlauf eines Untersuchungstages nach Einnahme
des ATD-Test von Kopfschmerzen, davon stufte eine Teilnehmerin diese
als stark ein. Sie brach die Untersuchung jedoch nicht ab und zeigte beim zweiten
Untersuchungstag keine weiteren Symptome. Nach Einnahme von BAL wurden
ebenfalls von drei Teilnehmer/-innen Kopfschmerzen angegeben. Insgesamt gaben
sieben Studienteilnehmer/-innen leichte Übelkeit nach Einnahme des ATD-
Test an, acht Teilnehmer/-innen berichteten über ähnliche Symptome nach BAL-
Einnahme; Erbrechen trat in keinem Fall auf. Völlegefühl wurde in fünf Fällen nach
ATD-Einnahme sowie in fünf Fällen nach BAL-Einnahme berichtet. Keine/-r der
Studienteilnehmer/-innen brach die Untersuchung ab.
4.1 Tryptophan-Influx über die Blut-Hirn-Schranke
Der TRP-Influx spiegelt partiell das Verhältnis der TRP- bzw. fTRP-Konzentrationen
zu den anderen CAA-Konzentrationen wider. Sowohl die verabreichte Aminosäuremischung
(neurochemische Challenge-Bedingung) und der Zeitverlauf als
auch die Interaktion dieser beiden Innersubjektfaktoren ergaben signifikante Effekte
bei der RMANOVA. Dies galt für den fTRP-Influx (neurochemische Challenge-
Bedingung: F (1, 92) = 285,477; p

nach ATD-Einnahme verglichen mit dem Influx bei T3 nach BAL-Einnahme bzw.
eine Reduktion von 91,31% des fTRP-Influxes bei T3 nach ATD-Einnahme verglichen
mit dem Influx bei T3 nach BAL-Einnahme.
Ebenso signifikant waren die Auswertungen zum Verlauf des TRP/CAA-Quotienten,
sowohl des mit gesamtem TRP berechneten Quotienten (neurochemische Challenge-
Bedingung: F (1, 92) = 764,177; p

4.2 Konzentrations-Zeit-Verläufe der Aminosäuren
Bis auf TYR, die einzige gemessene AS, die nicht in der ATD- oder BAL-Aminosäuremischung
enthalten war, zeigten sich bei allen AS signifikante Auswirkungen auf deren
Plasmakonzentrationen sowohl durch die neurochemische Challenge-Bedingung
als auch durch den Zeitverlauf. Die mittlere (sowohl gesamte als auch freie) TRP-
Plasmakonzentration sank verglichen zum Ausgangswert nach ATD-Einnahme ab
T2 signifikant ab, während sie nach Einnahme von BAL ab T1 im Vergleich zum
Ausgangswert signifikant erhöht war, bei T2 ihr Maximum erreichte und bei T3 wieder
eine Abnahme aufwies. Abbildung 4 und Abbildung 5 zeigen die über den Zeitverlauf
jeweilige Ausprägung der (gesamten und freien) TRP-Plasmakonzentration.
Abbildung 4: Plasmakonzentrationen des gesamten Tryptophans über den Zeitverlauf
nach ATD-/BAL-Einnahme
Abbildung 5: Plasmakonzentrationen des freien Tryptophans über den Zeitverlauf
nach ATD-/BAL-Einnahme
Anmerkung zu den Abbildungen 4 und 5. Plasmakonzentrationen ( µmol
l
) des gesamten
(TRP) bzw. freien Tryptophans (fTRP) zu den Zeitpunkten T0 (Baseline), T1 (90 min), T2 (180
min) und T3 (270 min) nach Einnahme des Acute Tryptophan Depletion-Test (ATD) Moja-De
bzw. eines Balanced Amino Acid Load (BAL, Kontrollbedingung). Abgebildet sind jeweils die
Mittelwerte ± Standardabweichungen.
19

Nach ATD-Einnahme stiegen außer den TYR- und TRP-Plasmakonzentrationen alle
anderen AS-Plasmakonzentrationen signifikant an. Außer der Konzentration von
TYR stiegen nach BAL-Einnahme ebenfalls alle AS-Plasmakonzentrationen, einschließlich
der von TRP, an. In Tabelle 3 finden sich die p-Werte, Freiheitsgrade
und F -Werte für die innersubjektiven Messwiederholungsfaktoren (neurochemische
Challenge-) Bedingung, Zeit sowie für eine Bedingung-Zeit-Interaktion.
Tabelle 3: Statistische Kennwerte der RMANOVAs für die im ATD-Test bzw. in der
BAL-Aminosäuremischung enthaltenen Aminosäuren
AS Innersubjektfaktor df F -Wert p-Wert
ILE Bedingung 1, 92 8,947 0,007*
Zeit 2, 46 14,980

Tabelle 4: Mittelwerte (M ) ± Standardabweichungen (SD) der im ATD-Test bzw.
in der BAL-Aminosäuremischung enthaltenen Aminosäuren
ATD
AS Geschlecht M T0 SD T0 M T1 SD T1 M T2 SD T2 M T3 SD T3
ILE Männer 67,6 12,1 337,0 95,0 346,6 69,2 166,4 56,9
Frauen 63,5 14,4 273,3 96,8 303,1 118,0 212,6 89,1
Gesamt 65,6 13,2 305,2 99,3 324,8 97,1 189,5 76,8
LEU Männer 131,0 22,0 582,9 121,4 560,2 119,1 295,4 93,6
Frauen 113,0 26,2 534,1 136,4 535,0 203,0 310,1 114,0
Gesamt 122,0 25,4 558,5 128,7 547,6 163,3 302,7 102,3
LYS Männer 155,0 32,0 536,1 86,0 434,7 84,8 275,9 53,0
Frauen 139,2 44,7 563,9 135,5 418,5 135,9 258,7 65,5
Gesamt 147,1 38,9 550,0 111,8 426,6 111,1 267,3 58,9
MET Männer 28,5 6,8 209,5 49,4 239,7 58,4 167,3 44,0
Frauen 24,1 6,1 214,9 47,1 252,1 57,4 200,9 46,5
Gesamt 26,3 6,7 212,2 47,3 245,9 57,0 184,1 47,5
PHE Männer 61,3 7,5 404,4 76,3 461,8 98,3 288,5 88,8
Frauen 53,6 8,0 444,6 87,2 542,9 146,9 379,2 114,2
Gesamt 57,5 8,5 424,5 82,7 502,3 129,1 333,9 110,2
THR Männer 125,7 16,9 277,7 62,5 279,8 48,4 229,0 38,6
Frauen 146,5 43,8 309,5 69,2 306,3 59,1 272,3 75,3
Gesamt 136,1 34,1 293,6 66,5 293,0 54,5 250,7 62,6
TYR Männer 62,8 14,5 109,2 19,6 113,1 27,5 95,9 25,2
Frauen 53,3 13,4 88,1 16,9 94,0 17,9 89,5 13,3
Gesamt 58,0 14,5 98,6 20,9 103,5 24,7 92,7 20,0
VAL Männer 219,8 40,0 912,3 150,1 931,7 156,1 609,0 157,5
Frauen 197,3 42,6 932,9 168,1 948,9 226,8 657,4 140,5
Gesamt 208,6 42,0 922,6 156,2 940,3 190,6 633,2 148,0
TRP Männer 55,3 11,0 49,8 16,8 37,7 21,5 29,0 16,4
Frauen 54,4 7,9 53,8 20,9 39,9 25,7 28,4 18,0
Gesamt 54,8 9,4 51,8 18,6 38,8 23,2 28,7 16,8
fTRP Männer 11,3 3,1 10,8 4,8 8,0 4,4 5,9 3,6
Frauen 10,9 3,0 11,4 4,9 8,0 5,4 5,9 3,8
Gesamt 11,1 3,0 11,1 4,8 8,0 4,8 5,9 3,6
BAL
AS Geschlecht M T0 SD T0 M T1 SD T1 M T2 SD T2 M T3 SD T3
ILE Männer 66,9 16,8 254,4 61,5 293,0 77,4 189,8 68,8
Frauen 60,5 14,3 256,7 85,9 292,9 106,2 221,8 127,3
Gesamt 63,7 15,6 255,6 73,1 293,0 90,9 205,8 101,4
LEU Männer 130,4 31,2 501,8 96,3 506,1 102,2 298,7 107,2
Frauen 110,5 27,7 495,2 102,3 497,8 149,6 321,5 161,9
Fortsetzung der Tabelle 4 auf der nächsten Seite
21

Tabelle 4 – Fortsetzung
AS Geschlecht M T0 SD T0 M T1 SD T1 M T2 SD T2 M T3 SD T3
Gesamt 120,5 30,6 498,5 97,3 502,0 125,3 310,1 134,8
LYS Männer 150,4 30,7 471,4 97,4 351,8 43,7 235,3 61,5
Frauen 137,2 29,7 490,0 102,9 350,9 85,3 220,9 61,8
Gesamt 143,8 30,3 480,7 98,5 351,3 66,3 228,1 60,7
MET Männer 25,8 5,8 183,2 39,4 198,9 35,5 150,3 41,3
Frauen 25,7 5,3 209,2 44,0 231,1 58,3 190,2 58,4
Gesamt 25,7 5,5 196,2 43,0 215,0 50,0 170,3 53,5
PHE Männer 63,5 9,9 354,8 67,4 393,4 87,1 270,3 67,5
Frauen 57,5 10,0 443,4 116,3 490,7 134,8 356,9 73,4
Gesamt 60,5 10,2 399,1 103,4 442,1 121,6 313,6 81,9
THR Männer 126,1 26,1 243,9 45,5 222,2 21,1 185,6 35,9
Frauen 146,0 43,6 269,6 57,3 259,8 63,2 232,1 78,2
Gesamt 136,0 36,6 256,8 52,3 241,0 49,9 208,8 64,1
TYR Männer 59,3 11,8 103,4 28,4 96,8 27,9 81,9 22,5
Frauen 54,6 15,7 90,7 29,1 95,1 41,2 90,7 39,6
Gesamt 57,0 13,8 97,0 28,9 95,9 34,4 86,3 31,8
VAL Männer 218,9 44,2 818,7 126,1 808,8 105,8 572,1 131,3
Frauen 197,9 42,4 911,0 114,4 891,4 201,3 666,0 200,6
Gesamt 208,4 43,7 864,8 126,8 850,1 162,8 619,0 172,6
TRP Männer 56,0 11,6 336,5 53,4 368,5 66,2 283,8 71,8
Frauen 56,1 9,9 355,2 48,9 395,2 85,1 318,2 81,4
Gesamt 56,0 10,5 345,9 51,0 381,8 75,8 301,0 77,1
fTRP Männer 11,4 3,9 105,1 28,5 132,1 36,3 79,6 37,8
Frauen 12,1 3,9 126,0 41,0 153,5 46,4 100,0 37,8
Gesamt 11,7 3,8 115,5 36,1 142,8 42,2 89,8 38,4
Anmerkung zu Tabelle 4. Mittelwerte (M ) ± Standardabweichungen (SD) für die Aminosäuren
Isoleucin (ILE), Leucin (LEU), Lysin (LYS), Methionin (MET), Phenylalanin (PHE), Threonin
(THR), Tyrosin (TYR), Valin (VAL), gesamtes (TRP) und freies Tryptophan (fTRP)) zu den
Zeitpunkten T0 (Baseline), T1 (90 min), T2 (180 min) und T3 (270 min) nach Einnahme des
Acute Tryptophan Depletion-Test (ATD) Moja-De bzw. eines Balanced Amino Acid Load (BAL,
Kontrollbedingung). Konzentrationen sind in ( µmol
ml
) angegeben.
Eine Interaktion zwischen dem Faktor Bedingung und dem Zwischensubjektfaktor
Geschlecht zeigte nur für ILE einen signifikanten Effekt (p = 0,040). Bei den anderen
AS lag der p-Wert zwischen 0,107 und 0,904. Ebenso wies nur eine AS, TYR, bei der
Interaktion zwischen dem Faktor Zeit und dem Zwischensubjektfaktor Geschlecht
eine signifikante Veränderung (p = 0,004) auf. Alle anderen AS zeigten hierbei keine
signifikanten Veränderungen, der jeweilige p-Wert lag zwischen 0,210 und 0,995.
Keinen signifikanten Effekt auf alle AS hatte die Interaktion zwischen den Innersubjektfaktoren
Bedingung und Zeit und dem Zwischensubjektfaktor Geschlecht mit
22

p-Werten zwischen 0,329 und 0,996. Zusammenfassend entsprechen diese Ergebnisse
den in Kapitel 2 beschriebenen Erwartungen. Eine Übersicht über die Mittelwerte
aller AS gibt Tabelle 4 (siehe S. 21-22). Abbildung 6 und Abbildung 7 zeigen die
Verläufe der LNAA unter ATD- bzw. BAL-Bedingungen.
Abbildung 6: Konzentrationsverläufe der langkettigen, neutralen Aminosäuren nach
ATD-Einnahme
Abbildung 7: Konzentrationsverläufe der langkettigen, neutralen Aminosäuren nach
BAL-Einnahme
Anmerkung zu den Abbildungen 6 und 7. Plasmakonzentrationsverläufe der langkettigen,
neutralen Aminosäuren (LNAA) ( µmol
l
) Isoleucin (ILE), Leucin (LEU), Phenylalanin (PHE), Tyrosin
(TYR), Valin (VAL) und Tryptophan (TRP) zu den Zeitpunkten T0 (Baseline), T1 (90
min), T2 (180 min) und T3 (270 min) nach Einnahme des Acute Tryptophan Depletion-Test
(ATD) Moja-De bzw. eines Balanced Amino Acid Load (BAL, Kontrollbedingung). Abgebildet
sind jeweils die Mittelwerte ± Standardabweichungen.
23

4.3 Untersuchung der Leptin-Achse
Die Untersuchungen der Leptin-Achse schlossen drei zu untersuchende Parameter
mit ein: Die Leptin- und sOB-R-Serumkonzentrationen und den FLI. Hierbei gab es
keine signifikant unterschiedlichen Werte zwischen den Tagen der ATD- bzw. BAL-
Bedingungen zum Zeitpunkt T0 (Leptin: t(23) = 0,746; p = 0,463; FLI: t(23) =
0,116; p = 0.909; sOB-R: t(23) = 0,488; p = 0,630). Dies galt auch isoliert für die
weiblichen (Leptin: t(11) = 0,863; p = 0,407; FLI: t(11) = 0,204; p = 0,842; sOB-
R: t(11) = 0,025; p = 0,981) und männlichen Teilnehmer/-innen (Leptin: t(11) =
0,472; p = 0,646; FLI: t(11) = 0,370; p = 0,719; sOB-R:t(11) = 0,615; p = 0,551).
Die RMANOVAs für Leptin und FLI zeigten in der gesamten Stichprobe keine signifikanten
Unterschiede bezüglich der verabreichten Aminosäuremischung (Leptin:
F [1, 92] = 0,479; p = 0,496; FLI: F [1, 92] = 0,548; p = 0,467). Der Faktor Zeit
hatte einen signifikanten Effekt auf Leptin und dessen Index (Leptin: F [2, 46] =
10,490; p

Abbildung 8: Plasmakonzentrationen des sOB-R nach ATD-Einnahme von Frauen
und Männern im Vergleich
Abbildung 9: Plasmakonzentrationen des sOB-R nach BAL-Einnahme von Frauen
und Männern im Vergleich
Anmerkung zu den Abbildungen 8 und 9. Plasmakonzentrationen ( ng
ml
) des löslichen Leptinrezeptors
(sOB-R) zu den Zeitpunkten T0 (Baseline), T1 (90 min), T2 (180 min) und T3 (270
min) nach Einnahme des Acute Tryptophan Depletion-Test (ATD) Moja-De bzw. eines Balanced
Amino Acid Load (BAL, Kontrollbedingung). Abgebildet sind jeweils die Mittelwerte ± Standardabweichungen.
Mit einem unverbundenen t-Test wurden die Ausgangswerte von sOB-R zur Baseline-
Bedingung (T0) überprüft: Die weiblichen Teilnehmerinnen hatten hier bereits einen
höheren Ausgangswert als die männlichen Teilnehmer (t(46) = 2,679; p = 0,010).
Wilcoxon-Tests wurden weiterhin für jeden einzelnen Zeitpunkt für die Gruppe der
weiblichen Teilnehmerinnen bezüglich der Leptin-Achse durchgeführt, um die gefundenen
Effekte post-hoc differenzierter untersuchen zu können bzw. ein ”
verfälschtes“
Ergebnis der RMANOVA wegen unterschiedlicher Ausgangswerte vor ATD-
25

zw. BAL-Einnahme auszuschließen. Hier zeigten sich für T2 und T3 bezüglich
sOB-R signifikante Unterschiede zwischen den Bedingungen ATD und BAL (T2: p
= 0,015; T3: p = 0,028). Für Leptin und FLI zeigten sich auch hier keine signifikanten
Unterschiede für alle Zeitpunkte. Weiterhin wurden die sOB-R-Daten für
jeden Zeitpunkt getrennt nach Geschlecht auf Korrelationen mit dem TRP-Influx
überprüft. Es fanden sich keinerlei signifikante Korrelationen. Einen Vergleich der
sOB-R-Serumkonzentrationen der männlichen und weiblichen Teilnehmerinnen stellen
die Abbildung 8 (ATD) und die Abbildung 9 (BAL) (siehe S. 25) dar.
Diese Befunde stehen im Gegensatz zu der in Kapitel 2 genannten 1. Hypothese.
Vermutet wurde hier eine Verminderung der Leptin-Konzentration nach Einnahme
des ATD-Test mit eventuell darauf folgender kompensatorischer Erhöhung. Eine
(von Leptin) isolierte Veränderung der sOB-R-Konzentration wurde nicht erwartet.
Diese Fragestellung wurde explorativ zur Hypothesengenerierung mituntersucht. Die
Ergebnisse werden im Kapitel 5.3 ausführlich erörtert.
Tabelle 5: Mittelwerte (M ) ± Standardabweichungen (SD) der Parameter der
Leptin-Achse
Challenge- Geschlecht Zeit- Leptin sOB-R FLI
Bedingung punkt (M ) (SD) (M ) (SD) (M ) (SD)
ATD Gesamt 0 7363,18 7810,14 29,40 7,21 0,28 0,34
1 6889,70 7548,84 26,83 8,02 0,29 0,35
2 6427,07 6706,27 26,85 7,37 0,27 0,32
3 7988,67 8485,36 27,59 6,95 0,32 0,36
Männer 0 2712,23 3393,24 26,87 5,28 0,12 0,18
1 2440,15 3001,21 25,18 8,21 0,12 0,19
2 2400,52 2854,58 25,31 6,95 0,12 0,19
3 2662,31 3219,48 26,19 7,06 0,14 0,22
Frauen 0 12014,13 8296,53 31,93 8,18 0,44 0,39
1 11339,26 8182,07 28,49 7,82 0,46 0,40
2 10453,63 7107,31 28,40 7,75 0,43 0,35
3 13315,03 8847,87 28,99 6,84 0,51 0,38
BAL Gesamt 0 8076,75 8346,74 28,98 7,93 0,28 0,28
1 7295,99 7147,31 27,14 7,83 0,27 0,25
2 7145,18 7226,31 28,37 8,19 0,25 0,24
3 8264,10 8509,83 28,33 7,48 0,29 0,29
Männer 0 2522,22 2505,18 26,06 7,95 0,11 0,12
1 2345,50 2377,67 23,69 8,11 0,12 0,14
2 2185,41 2097,55 25,39 8,23 0,10 0,12
3 2360,32 2227,23 24,98 6,80 0,11 0,14
Frauen 0 13631,28 8489,90 31,90 7,04 0,45 0,30
1 12246,48 6905,66 30,60 6,03 0,42 0,25
2 12104,95 7149,51 31,35 7,30 0,41 0,23
3 14167,88 8391,11 31,67 6,80 0,47 0,29
Anmerkung zu Tabelle 5. Mittelwerte (M ) ± Standardabweichungen (SD) für die Parameter
Leptin ( pg
ng
ml
), lösliche, extrazelluläre Domäne des Leptinrezeptors (sOB-R,
ml
) und freier Leptin-
C
Index (FLI,
Leptin
C sOB−R
) zu den Zeitpunkten T0 (Baseline), T1 (90 min), T2 (180 min) und T3 (270
min) nach Einnahme des Acute Tryptophan Depletion-Test (ATD) bzw. eines Balanced Amino
Acid Load (BAL, Kontrollbedingung).
26

Die in Kapitel 2 aufgeführte dritte Hypothese bezieht sich auf geschlechtsspezifische
Unterschiede bezüglich der Interaktion des Leptin-Systems und 5-HT: Es wurden
unterschiedliche, jedoch aufgrund des explorativen bzw. hypothesengenerierenden
Ansatzes dieser Untersuchung nicht genau definierte Ergebnisse zwischen Männern
und Frauen erwartet. Dieser Annahme kann nur zum Teil zugestimmt werden in
Hinblick auf sOBR. Bezüglich Leptin kann sie abgelehnt werden. Allerdings gehört
sOB-R als Teil der Leptin-Achse mit zum Leptin-System“. Hier fanden sich nach
”
Einnahme des ATD-Test bei den weiblichen Teilnehmerinnen signifikant niedrigere
Konzentrationen verglichen mit den Werten nach Einnahme der BAL-Aminosäuremischung.
Eine Übersicht über die Mittelwerte der Serumkonzentrationen von Leptin, sOB-R
und FLI gibt Tabelle 5 (siehe S. 26).
4.4 Untersuchung peripherer Neuropeptid Y-Konzentrationen
Der Zeitverlauf hatte einen hoch signifikanten Effekt auf die peripheren NPY-Konzentrationen
(F [2, 44] = 11,671; p

Tabelle 6: Mittelwerte M ± Standardabweichungen (SD) von NPY
Challenge-Bedingung Geschlecht Zeitpunkt NPY
(ATD/BAL) (T) (M ) (SD)
ATD Gesamt 0 80,06 20,23
1 75,51 19,89
2 70,58 17,40
3 67,26 16,67
Männer 0 78,89 25,70
1 74,82 21,80
2 71,25 20,47
3 68,58 17,97
Frauen 0 81,13 14,68
1 76,14 18,93
2 69,98 14,96
3 66,05 16,08
BAL Gesamt 0 71,69 14,67
1 70,86 17,74
2 65,10 15,26
3 64,17 15,42
Männer 0 71,41 18,27
1 71,19 20,53
2 63,85 18,98
3 66,67 17,07
Frauen 0 71,95 11,26
1 70,55 15,69
2 66,24 11,64
3 61,88 14,08
Anmerkung zu Tabelle 6. Mittelwerte (M ) ± Standardabweichungen (SD) für die Serumkonzentrationen
von Neuropeptid Y (NPY) ( pg
l
) zu den Zeitpunkten T0 (Baseline), T1 (90 min), T2
(180 min) und T3 (270 min) nach Einnahme des Acute Tryptophan Depletion-Test (ATD) bzw.
einer Balanced Amino Acid Load (BAL, Kontrollbedingung).
28

5 Diskussion
Die vorliegende Studie hatte zum Ziel, zum einen die Effekte des ATD-Test Moja-De
bezüglich eines verminderten TRP-Influxes über die Blut-Hirn-Schranke zu untersuchen.
Zum anderen sollten in einer explorativen Herangehensweise die Auswirkungen
des ATD-Test auf die Leptinachse (Leptin-, sOB-R-Konzentrationen und FLI) und
auf die periphere NPY-Konzentration untersucht werden.
Anhand der Plasmakonzentrationen der LNAA konnte unter Einsatz einer modifizierten
Formel in Ahnlehnung an eine Michaelis-Menten-Kinetik ein durch den ATD-
Test Moja-De induzierter, verminderter TRP-Influx über den L1-Transporter der
Blut-Hirn-Schranke in das ZNS berechnet werden. Nach ATD-Einnahme nahm die
TRP-Plasmakonzentration signifikant ab, während die anderen AS-Konzentrationen
(bis auf TYR) anstiegen, sodass der TRP/CAA-Quotient ebenfalls stark absank. In
der Untersuchung konnte kein Zusammenhang zwischen einer kurzzeitig verminderten
5-HT-Synthese und Veränderungen der peripheren NPY- und Leptin-Serumkonzentrationen
gezeigt werden. Auch wurden keine signifikanten Effekte des
ATD-Test bezüglich FLI festgestellt, jedoch fanden sich Effekte auf die sOB-R-
Serumkonzentration bei Frauen. Diese Resultate werden im Folgenden diskutiert.
5.1 Influx von Tryptophan über die Blut-Hirn-Schranke
Durch die Gabe des ATD-Test Moja-De konnte eine signifikante Reduktion der TRP-
Plasmakonzentrationen hervorgerufen werden, sowohl der gesamten als auch der freien
TRP-Konzentration. Dies ist im Einklang mit den Ergebnissen von Kewitz (2002).
Hierbei ist zu erwähnen, dass nach aktuellem wissenschaftlichen Kenntnisstand noch
keine Klarheit darüber besteht, ob das freie oder das gesamte Plasma-TRP den besseren
prädiktiven Wert für die Influxrate und somit für die zentralnervöse 5-HT-
Synthese bzw. die Substratverfügbarkeit für die TPH2 widerspiegelt.
Einerseits haben Daten, die anhand von Studien mit Ratten gewonnen wurden, eine
positive Korrelation zwischen freiem und gesamtem TRP im Gehirn vorgewiesen
(Biggio et al., 1974; Oldendorf & Szabo, 1976). Außerdem wurde gezeigt, dass eine
Dissoziation des albumingebundenen TRP zu einer höheren Influxrate von TRP ins
ZNS führt (Tagliamonte et al., 1973; Gessa & Tagliamonte, 1974; van Donkelaar
et al., 2011). Dies spricht für die Annahme, dass vor allem die Konzentration des
fTRP zur Berechnung der Influxrate herangezogen werden sollte.
Andererseits gibt es aber auch Hinweise dafür, dass das gesamte TRP ein besserer
Indikator für einen verminderten Influx nach Anwendung des ATD-Test ist, da
TRP nur vergleichsweise schwach an Albumin gebunden ist. Albumin, das selbst
nicht in der Lage ist, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden, ist für die Eigenschaft
bekannt, signifikante Konformationsänderungen zu vollziehen (Reed & Burrington,
1989). Dadurch wird eine Dissoziation des TRP von Albumin erleichtert, die
29

während seines Transportes durch die zerebralen Blutgefäße von hämodynamischen
Prozessen abhängig ist (Pardridge & Fierer, 1990; van Donkelaar et al., 2009a; van
Donkelaar et al., 2009b; van Donkelaar et al., 2011). Ein niedriger Blutfluss führt zu
einer gesteigerten Wechselwirkung zwischen TRP und der Glykokalyx an der Blut-
Hirn-Schranke und dadurch zu einer höheren Dissoziationsrate (Smith et al., 1987;
Pardridge & Fierer, 1990; van Donkelaar et al., 2011).
Die in dieser Arbeit gewonnenen Daten machen deutlich, dass sowohl die Konzentration
des gesamten als auch die des freien TRP unter Einfluss von ATD Moja-De
absinken. Dies spricht dafür, dass die Messung der fTRP-Konzentration ausreichen
sollte, um den TRP-Influx in das ZNS abzubilden, was auch in Bezug auf die anfallenden
Kosten für eine zusätzliche Bestimmung von gesamtem TRP relevant ist.
Die berechneten Influx-Werte ergaben ebenfalls signifikant verminderte Werte nach
Einnahme des ATD-Test verglichen mit der BAL-Aminosäuremischung. Allerdings
ist hier anzumerken, dass die Berechnung der Influxrate als indirekte Methode zur
Beschreibung einer veränderten zentralnervösen Verfügbarkeit von TRP und damit
einer verminderten 5-HT-Synthese im ZNS eine Limitation der vorliegenden Arbeit
darstellt, auch wenn sich in der Michaelis-Menten-Kinetik ein reliables mathematisches
Modell findet, um die zentrale 5-HT-Synthese in Abhängigkeit vom TRP-Influx
abzuschätzen. Weitere Limitationen bezüglich dieser Thematik werden im Zusammenhang
mit den Ausführungen in Kapitel 5.2 benannt.
Der Zusammenhang zwischen ATD-Gabe und verminderter zentralnervöser 5-HT-
Synthese gilt jedoch als gesichert, was zahlreiche tierexperimentelle Studien belegen.
So wurden z.B. bei Studien an Ratten und Mäusen eine zentrale Verminderung von
5-HT und 5-HIAA festgestellt (Ardis et al., 2009; Biskup et al., 2012) oder auch
verminderte 5-HIAA-Konzentrationen im Liquor von Meerkatzen beobachtet (Young
et al., 1989). Um in humanexperimentellen Studien den Effekt des ATD-Test weniger
invasiv zu untersuchen als es in tierexperimentellen Studien möglich ist, bietet die
Berechnung des Influxes eine recht zuverlässige, wenn auch indirekte Alternative. Eine
direkte Alternative wäre hier der Einsatz von Positronen-Emissions-Tomographie
(PET): Sie ermöglicht es auch, die serotonerge Neurotransmission mit dem zentralen
Bindungspotenzial der 5-HT-Rezeptoren in Bezug zu setzen und anhand dessen
zuverlässige Daten (neben Hinweisen auf betroffene Hirnareale) zum Einfluss des
ATD-Test Moja-De zu gewinnen. Solche Studien könnten Gegenstand weiterer Forschungsbemühungen
sein.
In dieser Studie wurde nicht auf den potenziell ausgelösten, oxidativen bzw. metabolischen
Stress nach Einnahme des ATD-Test Moja-De eingegangen, was in der
Fokussierung auf die Auswirkungen des ATD-Test auf die Leptin-Achse und die
NPY-Serumkonzentration begründet liegt. Im Rahmen weiterer ATD-Studien, insbesondere
bei Anwendung einer prolongierten Depletion über mehrere Tage, sollte
der möglicherweise induzierte oxidative Stress Berücksichtigung finden.
30

Die Wirksamkeit des ATD-Test allgemein ist von van Donkelaar et al. zuletzt in Frage
gestellt worden (van Donkelaar et al., 2011). Da die Angaben in ihrer Veröffentlichung
den zugrunde liegenden Theorien dieser Arbeit teilweise widersprechen, soll
hier genauer auf diese eingegangen werden.
Die Autoren schließen die verminderte 5-HT-Synthese als eine Wirkung des ATD-
Test zwar nicht aus, argumentieren aber, dass der ATD-Test nicht-serotonerge Mechanismen
mitumfasst. Vielmehr seien Effekte, die durch den ATD-Test hervorgerufen
werden, über Stress, metabolische und zerebrovaskuläre Veränderungen, insbesondere
durch eine Veränderung des zerebralen Blutflusses, zu erklären.
Van Donkelaar et al. gehen in einem ihrer Erklärungsansätze auf die Wirkung von
Stickstoffmonoxid (engl. nitric oxide, NO) bzw. dessen Synthese mit Hilfe der NO-
Synthase (NOS) ein. Demnach kann eine verminderte NOS-Aktivität und somit
eine verminderte NO-Synthese nach ATD-Aufnahme eine Einschränkung des Objektgedächtnisses
bedingen, welche in Studien mit Ratten mehrfach demonstriert
werden konnte, da eine hippokampale Hemmung von NOS eine Verschlechterung
der Objektgedächtnisleistung in Ratten hervorrufen kann (Prickaerts et al., 2002a;
Blokland et al., 1998; van Donkelaar et al., 2011).
Auf die Inhibition der NOS durch den ATD-Test wird von einer verminderten zentralen
Zitrullinkonzentration im Hippokampus geschlossen, die bei Ratten nach ATD-
Gabe gefunden wurde (Lieben et al., 2004; van Donkelaar et al., 2009a). Da eine
verminderte Zitrullinkonzentration mit einer verringertern NO-Synthese einhergeht,
könnte dies die ATD-induzierte Beeinträchtigung des Objektgedächtnisses erklären,
die bei Nagetieren festgestellt wurde (Dawson & Dawson, 1996; Olivier et al., 2008;
Jans et al., 2010; van Donkelaar et al., 2011).
Ferner gibt es einen komplexen Zusammenhang zwischen NO und 5-HT: Ein moderater
Anstieg von NO-Konzentrationen führt zu verminderter 5-HT-Freisetzung,
während ein nur leichter Anstieg von NO-Konzentrationen zu einer ansteigenden
5-HT-Freisetzung führt (Kaehler et al., 1999; van Donkelaar et al., 2011).
Durch Inhibitoren der Phosphodiesterase (PDE) ist wiederum eine Verbesserung
des durch den ATD-Test eingeschränkten Objektgedächtnisses hervorrufbar, welche
ebenso wie der ATD-Test den zerebralen Blutfluss, das Gedächtnis sowie kognitive
Prozesse beeinflussen können (Prickaerts et al., 2002a; Prickaerts et al., 2002b).
PDE5- und PDE2-Inhibitoren erhöhen einerseits die NOS-Aktivität im Hippocampus
und fördern andererseits die zentralen Second Messenger-Konzentrationen wie
die von zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP) und zyklischem Adenosinmonophosphat
(cAMP), welche beide ebenfalls Einfluss auf Gedächtnis und Lernvorgänge
haben (Murad et al., 1978; Domek-Lopacinska & Strosznajder, 2008; van
Donkelaar et al., 2011).
Als weitere Hypothese formulieren Donkelaar et al., dass ein nach Einnahme des
ATD-Test verminderter Blutfluss in Hirnarealen, in denen der Wachstumsfaktor
31

BDNF (engl.: Brain-derived neurotrophic factor) normalerweise in großen Mengen
verfügbar ist, oder auch erhöhte Konzentrationen des peripheren Abbauprodukts
von TRP, Kynurenin, und dessen Metabolite zu Verschlechterungen der Gedächtnisleistung
nach ATD-Einnahme beitragen können (Stone, 2001; Blokland, A. et al.,
2004; van Donkelaar et al., 2009a; van Donkelaar et al., 2009b; van Donkelaar et al.,
2011).
BDNF wird außerdem durch Stress beeinflusst, wobei dies die Grundlage einer weiteren
Hypothese von van Donkelaar et al. darstellt: Durch die Anwendung des ATD-
Test entstehe eine akute Stresssituation. Diese führe zu Lipolyse, wodurch wiederum
Fettsäuren freigesetzt werden, welche TRP von seiner Bindungsstelle an Albumin
verdrängen, sodass TRP leichter über die Blut-Hirn-Schranke aufgenommen werden
kann (McMenamy, 1965; van Donkelaar et al., 2011).
Zudem stimuliert Stress eine Freisetzung von Kortikosteron, dem wichtigsten Kortikoid
bei Nagetieren, welches hingegen die Rezeptorbindung von 5-HT und dem
bereits erwähnten BDNF vermindert, wodurch es ebenfalls zu einem herabgesetzten
Objektgedächtnis kommt (Laaris et al., 1995; van Donkelaar et al., 2011).
Die Argumentation von van Donkelaar et al. erscheint grundsätzlich nachvollziehbar,
weist jedoch einige ungeklärte Fakten auf. Die Autoren formulieren Wirkprozesse,
die in einem eindeutigen Zusammenhang nicht experimentell bewiesen sind, sondern
ausschließlich auf theoretischen Schlussfolgerungen in Bezug auf verschiedene
Experimente basieren. Ferner gibt es, wie durch Crockett et al. ausgeführt, ausreichend
Belege dafür, dass der ATD-Test eindeutig die zentralnervöse 5-HT-Synthese
vermindert (Crockett et al., 2012). Dies wird durch neuere tierexperimentelle Daten
bezüglich des hier verwendeten ATD-Test Moja-De bestätigt (Biskup et al.,
2012). Dennoch sollten weitere, wie jene durch van Donkelaar et al. beschriebenen,
sekundären Mechanismen bezüglich des ATD-Test in zukünftigen Studien berücksichtigt
werden.
Den Argumenten von Crockett et al. (2012), Biskup et al. (2012) sowie den Befunden
von vielen weiteren Forschungsgruppen folgend kann auf Basis der durch
die vorliegende Arbeit gewonnenen Daten zugestimmt werden, dass die Gabe des
ATD-Test, hier Moja-De im Speziellen, eine wirksame, verlässliche und nebenwirkungsarme
Methode ist, um kurzzeitig die 5-HT-Synthese im ZNS zu verringern. Die
vergleichsweise geringen Nebenwirkungen sind zum einen auf die Zusammensetzung
der verschiedenen AS zurückzuführen und zum anderen darauf, dass die Zuführung
von Moja-De gewichtsadaptiert erfolgt.
5.2 Verlaufskonzentrationen der Aminosäuren
Die Aminosäuren ILE, LEU, LYS, PHE, THR, VAL und MET stiegen signifikant
an, sowohl nach ATD- als auch nach BAL-Einnahme. Diese Ergebnisse waren zu erwarten,
da der ATD-Test und die BAL-Aminosäuremischung beträchtliche Mengen
32

dieser Aminosäuren enthalten. TYR, die einzige nicht in der Mischung enthaltene
AS, deren Konzentration bestimmt wurde, zeigte keine signifikanten Konzentrationsänderungen.
Die TRP-Bestimmung allein hätte nicht genügt, um die verminderte zentralnervöse
TRP-Verfügbarkeit und die dadurch verminderte 5-HT-Synthese im ZNS einschätzen
zu können. Bereits Gessa et al. nahmen in den Siebziger Jahren an, dass ein Drittel
der Reduktion der zentralen TRP-Konzentration durch die Anwesenheit von LNAA
bestimmt wird (Gessa et al., 1974; Weltzin et al., 1994). Mit Hilfe der Konzentrationen
der LNAA, die verzweigtkettigen AS LEU, ILE und VAL und die aromatischen
AS PHE, TYR und TRP, lässt sich der Quotient TRP/CAA berechnen (Badawy
et al., 2010; Fernstrom & Wurtman, 1972). Dieser lässt eine Schätzung der Wirksamkeit
des ATD-Test zu. Ein hoher Quotient bedeutet, dass mehr TRP mit Hilfe
des L1-Transporters die Blut-Hirn-Schranke überwinden kann.
In der vorliegenden Arbeit führte der ATD-Test sowohl im Vergleich zur Baseline
als auch im Vergleich zur BAL-Aminosäuremischung zu stark verminderten
TRP/CAA-Quotienten. Eine maximale Reduktion ergab der Quotient – berechnet
mit der gesamten TRP-Konzentration – zum Zeitpunkt T2 auf 15,8% bzw. mit der
fTRP-Konzentration berechnet auf 14,6% des Ausgangswertes. Bei Einnahme der
BAL-Aminosäuremischung erhöhte sich der Quotient, sodass zum Zeitpunkt T3 –
ausgehend von der gesamten TRP-Plasmakonzentration – die Konzentration auf
167,7% bzw. von fTRP ausgehend zum Zeitpunkt T2 auf 285,0% des Ausgangswertes
bei T0 anstieg.
Bemerkenswert ist in diesem Zusammenhang, dass in früheren Arbeiten, die sich
mit der ATD-Methode, jedoch nicht in der Modifikation Moja-De, beschäftigten,
dieser Quotient nach Aufnahme einer (anders als in dieser Studie zusammengstellten)
Kontroll-Aminosäuremischung (welche auch TRP enthält) ebenso wie bei ATD-
Einnahme zu reduzierten TRP/CAA Quotienten im Plasma führte (Young et al.,
1988; Weltzin et al., 1994). Im Gegensatz dazu fand sich in der vorliegenden Studie,
dass die ATD-Methode Moja-De gerade auch im Vergleich mit der BAL-Aminosäuremischung
robust die zentralnervöse Tryptophanverfügbarkeit senkt bzw. den TRP-
Influx über die Blut-Hirn-Schranke vermindert. Weiterhin zeigten neue tierexperimentelle
Daten, dass die hier verwendete BAL-Aminosäuremischung die zentralnervöse
Verfügbarkeit von 5-HT nicht erhöhte, was ihre Bedeutung als Kontrollbedingung
in verschiedenen experimentellen Settings unterstreicht (Biskup et al.,
2012).
Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag nicht auf dem TRP/CAA-Quotienten,
da mit der Influx-Berechnung ein präziseres Werkzeug zur Schätzung der zentralnervösen
TRP-Verfügbarkeit angewandt werden konnte. Zwar korreliert in Tiermodellen
auch der Quotient TRP/CAA mit dem zentralen TRP-Gehalt (mit einem r
= 0,95) und mit zentralen Konzentrationen von 5-HT und 5-HIAA (mit einem r
33

= 0,89) (Fernstrom & Wurtman, 1972). Durch Berücksichtigung der unterschiedlichen
Affinitäten der Aminosäuren zum L1-Transporter kann jedoch gerade bei den
verzweigtkettigen Aminosäuren LEU, ILE und VAL eine zuverlässigere Schätzung
der Aminosäurenkonzentrationen im Gehirn vorgenommen werden (Tackman et al.,
1990). So besetzen beispielsweise unter normalen Plasma-Bedingungen allein PHE
und LEU durch ihre hohe Affinität, ausgedrückt durch einen niedrigen K m -Wert,
über 50% der Bindungsstellen des Transporters (Smith et al., 1987).
Dieser Schätzung sind jedoch auch limitierende Faktoren zuzuschreiben: Die Konstanten,
die für die Berechnung des Influxes aus den Untersuchungen von Smith et al.
herangezogen wurden, sind aus Untersuchungen an Ratten ermittelt worden (Smith
et al., 1987; Smith & Stoll, 1998). Weiterhin gibt es zwar ausgeprägte Analogien
zwischen dem menschlichen L1-Transporter und dem von Smith et al. untersuchten
zerebrovaskulären NAA-Carrier. Dennoch konnten Smith und Kollegen bei der
Veröffentlichung ihrer Daten nur vermuten, dass diese einander entsprechen.
Ferner wurde für die Influx-Berechnungen sowohl mit gesamtem als auch mit freiem
TRP der gleiche K m -Wert genutzt, da Smith nur einen K m -Wert ermittelt hatte –
unter der Annahme, dass albumingebundenes TRP kaum zum TRP-Influx beitragen
würde (Smith et al., 1987). Allerdings verändere laut Smith et al. die Wahl zwischen
freiem und gesamtem TRP für ihre Berechnungen die K m -Werte der anderen AS nur
minimal“ (Smith et al., 1987).
”
5.3 Einfluss des Acute Tryptophan Depletion-Test auf die
Leptin-Achse
Leptin, dem in der Regulation des Energiemetabolismus eine entscheidende Rolle
zukommt, zeigte in dieser Studie keine signifikanten Veränderungen nach ATD-
Einnahme im Vergleich zur BAL-Einnahme. Auch die Werte der Serumkonzentrationen
des sOB-R und des FLI zeigten über die gesamte Gruppe der Studienteilnehmer/-innen
keine signifikanten Veränderungen nach Einnahme des ATD-Test Moja-
De verglichen zur BAL-Einnahme. Allerdings ergab die Auswertung bei geschlechtsgetrennter
Betrachtung, dass bei den weiblichen Teilnehmerinnen nach ATD-Gabe
die sOB-R-Serumkonzentration im Vergleich zur BAL-Gabe signifikant abnahm.
Dies stellt eine signifikante Neuerung zur bisherigen Forschung dar, wobei bisherige
Studien vor allem tierexperimentelle Ansätze zur Untersuchung möglicher Interaktionen
von zentralnervösem 5-HT und Leptin verwendeten. Dieser Effekt könnte
hierbei als Korrelat eines veränderten Leptin-Transports über die Blut-Hirn-
Schranke interpretiert werden. Weiterhin erscheint eine direkte Regulation der sOB-
R-Verfügbarkeit bei weiblichen Studienteilnehmerinnen denkbar, möglicherweise über
das autonome Nervensystem oder immunologisch gesteuerte Mechanismen, beispielsweise
durch Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF-α) (Gan et al., 2012). Hierzu sind
weiterführende Untersuchungen notwendig.
34

Möglicherweise besteht eine Ursache für die vorliegenden Ergebnisse bezüglich Leptin
und FLI darin, dass die Messung auf 4,5 Stunden begrenzt war. Nahrungsaufnahmen
zeigten im Rahmen von anderen Studien keinen kurzfristigen Anstieg der
Leptin-Plasmakonzentration (Jéquier, 2002; Considine et al., 1996).
Es liegt jedoch eine Studie vor, in der neben langfristigen auch kurzfristige Veränderungen
des Leptinspiegels als Reaktion auf übermäßige Nahrungsaufnahme von
Probanden/-innen beobachtet wurden (Kolaczynski et al., 1996). Hier trat jedoch
der kurzfristige, starke Anstieg der Leptinkonzentration nach fünf Stunden auf, was
immer noch über den Zeitrahmen der vorliegenden Studie hinausgeht (Kolaczynski
et al., 1996). Ferner erscheinen die Veränderungen der sOB-R-Konzentrationen in
der vorliegenden Arbeit vergleichsweise gering, sodass sich diese nicht signifikant auf
den FLI auswirken.
Es sollte außerdem berücksichtigt werden, dass die vorliegende Arbeit auf zentralnervöse
Vorgänge ausgerichtet war und von zentralen Wechselwirkungen zwischen
einer verminderten 5-HT-Synthese und Leptinspiegeln ausging. Gemessen wurde allerdings
mit der Serumkonzentration ein peripherer Wert des Leptins, sodass man
nicht sicher davon ausgehen kann, dass dies eventuelle Veränderungen im ZNS bzw.
deren Richtung wiedergibt. Zwar wurde in vielen Studien Serum oder Plasma verwendet,
um Leptin-Veränderungen zu erfassen, jedoch fanden auch diese Messungen
über längere Zeiträume statt als in der vorliegenden Arbeit. Des Weiteren wurden
viele Erkenntnisse über die Wirkung von Leptin in tierexperimentellen Studien gewonnen.
Eine wechselseitige Beziehung zwischen dem 5-HT- und dem Leptin-System im Menschen
gilt als wahrscheinlich. Untersuchungen von Karsenty et al. zum Zusammenhang
zwischen dem Energiemetabolismus und Knochenstoffwechsel haben ergeben,
dass Leptin über eine Hemmung der 5-HT-Synthese und -Freisetzung im Hirnstamm
die Einspeicherung von Knochenmasse inhibiert (Yadav et al., 2009; Karsenty, 2006).
Den Autoren nach greift das für seine Funktion in kognitiven Vorgängen bekannte,
zentral synthetisierte 5-HT in das Knochen-Remodelling (kontinuierliche Erneuerung
von Knochensubstanz), die Appetitregulation und den Energiehaushalt ein
(Yadav et al., 2009). 5-HT wirkt zentral zugunsten einer Zunahme an Knochenmasse,
indem es über die Bindung an Htr2c in ventromedialen Nuclei des Hypothalamus
eindämmend auf die Aktivität des sympathischen Nervensystems einwirkt (Yadav
et al., 2009). Indem 5-HT an Htr1a und Htr2b des Nucleus arcuatus bindet, wirkt es
appetitsteigernd und energiesparend (Yadav et al., 2009; Oury & Karsenty, 2011).
Diese Wirkungen scheinen durch Leptin gehemmt werden zu können. So haben Karsenty
et al. durch Doppelimmunohistochemie die lange Form des Leptinrezeptors
in Neuronen gefunden, die TPH2 exprimieren, was also auf 5-HT synthetisierende
Neurone hinweist (Yadav et al., 2009). Zudem führte eine intrazerebroventrikuläre
Injektion von Leptin zu einer dosisabhängigen Reduktion der 5-HT-Synthese wie
35

auch -Freisetzung durch Hirnstammneurone, und gegensätzlich erhöhte sich in ob/ob
(leptindefizienten) Mäusen die 5-HT-Konzentration im Hypothalamus (Yadav et al.,
2009). Ferner führte ein höherer 5-HT-Gehalt in diesen ob/ob Mäusen zu normalisierter
Knochensubstanzeinspeicherung und auch zu normalisiertem Appetit (Yadav
et al., 2009).
Zu diesen Befunden passt auch die Tatsache, dass Serotoninwiederaufnahmehemmer
als Nebenwirkung eine Gewichtszunahme zeigen können und 5-HT-defiziente Mäuse
eine Anorexie-ähnliche Symptomatik entwickeln (Kaye et al., 1998; Srinivasan et al.,
2008; Oury & Karsenty, 2011). Ebenfalls kann die Feststellung, dass eine Inaktivierung
des Leptinrezeptors in serotonergen Neuronen zu einer Wiederherstellung des
Appetits und des ursprünglichen Körpergewichtes in ob/ob Mäusen führen konnte,
als weiterer Beleg für diese Hypothese gewertet werden (Yadav et al., 2009; Oury &
Karsenty, 2011).
Den Ergebnissen von Yadav et al. bzw. den darauf aufbauenden theoretischen Erklärungsansätzen
hat jedoch eine Veröffentlichung von Lam et al. (2011) in Teilen widersprochen.
Die Autoren stimmen zwar zu, dass sowohl 5-HT als auch Leptin wichtige
Rollen im Energiehaushalt zukommen, aber die gewonnenen Daten erklärten vor
allem, dass es keine direkte Wirkung von Leptin auf serotonerge Neurone gebe (Lam
et al., 2011). Lam et al. konnten keine Neurone ausfindig machen, die, wie von Yadav
et al. vermutet, sowohl TPH2 als auch OB-R exprimieren, auch wenn OB-R-tragende
Neurone und 5-HT-Neurone im dorsalen Raphe-Kern dicht beieinander liegen (Lam
et al., 2011). Leptin führe laut Lam et al. zwar zu Hyperpolarisation von nichtserotonergen
Neuronen im dorsalen Raphe-Kern, bewirke dort aber keine veränderte Aktivität
von 5-HT-Neuronen (Lam et al., 2011). Außerdem änderte eine 5-HT-Depletion
(mittels des Tryptophanydroxylase-Inhibitors P-Chlorophenylalanin, PCPA) nicht
den anorektischen Effekt von Leptin (Lam et al., 2011). Hierbei ist jedoch in Bezug
auf die genannte Studie und die verwendete Depletionsmethode anzunehmen, dass
eine zentralnervöse Depletion von 5-HT durch PCPA zu einer wesentlich stärkeren
Verminderung der 5-HT-Synthese führt und aufgrund des nahezu vollständigen
Aussetzens der 5-HT-Synthese nur im tierexperimentellen Setting angewendet wird.
Nach Ergebnissen der Studie von Yadav et al. führen cre-Serotonintransporter (Sertcre)
exprimierende Neurone bei fehlendem Leptinrezeptor in Mäusen zu Hyperphagie
und Adipositas (Yadav et al., 2009). Dies konnte durch Lam et al. nicht bestätigt
werden. Hingegen fand sich bei Lam et al., dass Sert-cre im dorsalen Raphe-Kern
nicht aktiv ist und eine Sert-cre-vermittelte, neuronenspezifische Inaktivierung des
Leptinrezeptors keinen Einfluss auf das Körpergewicht hat bzw. nicht zu Adipositas
führt (Lam et al., 2011).
In der Zusammenschau ihrer Resultate postulierten die Autoren, dass 5-HT-Neurone
nicht direkt von Leptin beeinflusst würden, dass der Weg über 5-HT nicht essenziell
notwendig sei für die anorektische Wirkung von Leptin, und dass die eigentliche
36

Population der OB-R tragenden zentralen Neurone noch identifziert werden müsse
(Lam et al., 2011). Möglicherweise würde eine weitere Aufklärung dieser Diskrepanzen
zwischen den Modellen beider Forschungsgruppen auf diesem Gebiet zusätzliche
Informationen dazu liefern, weswegen in der vorliegenden Studie kein Effekt einer
verminderten 5-HT-Synthese im ZNS mittels des ATD-Test Moja-De auf Leptin-Serumkonzentrationen
gefunden werden konnte.
Auch ein Miteinbezug des sOB-R, auf den beide Forschungsgruppen in ihren Veröffentlichungen
nicht eingingen, könnte hierbei von Nutzen sein. Der derzeitige Wissensstand
der Forschung bezüglich der Funktion des peripher zirkulierenden sOB-R,
der Leptin im Blut hochaffin bindet, ist noch relativ begrenzt. Ebenso wie Leptin liefert
sOB-R Informationen über den Körperfettanteil. So korreliert der Körperfettanteil
negativ mit der sOB-R-Konzentration im menschlichen Körper (Yannakoulia
et al., 2003). Durch Gastric Banding und folglich Gewichtsabnahme übergewichtiger
Menschen erhöhte sich deren sOB-R-Gehalt im Blut (Laimer et al., 2002). Überdies
hemmt sOB-R den Transport von Leptin über die Blut-Hirn-Schranke durch eine
reduzierte Bindungs- und Endozytoseaktivität und wirkt somit als Antagonist von
membranverankerten OB-R (Tu et al., 2008).
Kratzsch et al. zeigten eine negative Korrelation der sOB-R-Serumkonzentration mit
dem Alter und dem Stadium der Pubertätsentwicklung (Kratzsch et al., 2002b). Außerdem
wiesen sie in Untersuchungen an Patientinnen mit AN einen Abfall des sOB-
R bei gleichzeitigem Anstieg des Leptins unter Gewichtszunahme nach. Dies fand
durch andere Veröffentlichungen Bestätigung, auch bezüglich der Tatsache, dass bei
fehlender Gewichtszunahme sOB-R-Werte signifikant höher waren (Kratzsch et al.,
2002b; Misra et al., 2004). Vermutet wurde hier, dass im Rahmen von Essstörungen
(vor allem AN) diese Hochregulierung des löslichen Leptinrezeptors den Körper vor
weiterer Gewichtsreduktion bewahrt, indem es den Organismus vor einer Wirkung
des freien Leptins schützt, sodass der Energieverbrauch gesenkt wird.
Ein Erklärungsansatz für die bei weiblichen Teilnehmerinnen gefundene Assoziation
einer verminderten sOB-R-Konzentration mit einer verminderten 5-HT-Synthese
(hervorgerufen durch den ATD-Test) ist, dass die verminderte sOB-R-Konzentration
einhergeht mit einer reduzierten Hemmung des Transports von Leptin über die Blut-
Hirn-Schranke. Diese Annahme liegt in der Veröffentlichung von Tu et al (2008)
begründet. Die dabei involvierten Bindungs- und Endozytoseaktivitäten könnten
einer serotonergen Modulation unterliegen. Bisherige Forschungsergebnisse weisen
auf eine Beteiligung von Htr1a bei der Aktivierung von Mitogen-aktivierten Proteinkinasen
bzw. extrazellulären signalregulierten Kinasen im Rahmen von Kalzium-
/Calmodulin-abhängigen Rezeptor-Endozytoseprozessen hin (Della Rocca et al.,
1999). Auch andere serotonerge Regulationsmechanismen könnten hierbei eine Rolle
spielen. Ob in umgekehrter Weise eine vermehrte zentralnervöse Verfügbarkeit von
5-HT bei gesunden jungen Erwachsenen, zum Beispiel pharmakologisch durch Ver-
37

abreichung von Serotonin-Wiederaufnahme-Hemmern, mit einer Hochregulation von
sOB-R einhergeht mit der möglichen Konsequenz von einer verminderten Wirkung
des freien Leptins (siehe Kratzsch et al., 2002b, Misra et al., 2004, Tu et al., 2008),
ist ebenfalls unklar. Hierzu sind weiterführende Studien notwendig.
Die verminderte Synthese von 5-HT durch den ATD-Test könnte auch als sättigungsassoziiert
bzw. sättigungsinduzierend verstanden werden, einerseits über die
verabreichten Aminosäuren, welche physiologischerweise Bestandteil der menschlichen
Nahrung sind, und andererseits über eine verminderte Synthese von 5-HT.
Dieser Effekt dürfte bei Frauen ausgeprägter sein als bei Männern, da bei Frauen
die 5-HT-Synthese geringer ist, sodass der ATD-Test bei ihnen in dieser Hinsicht
schneller und stärker Effekte zeigen könnte (Nishizawa et al., 1997).
Eine verminderte sOB-R-Konzentration führt allerdings ebenfalls zu einer erhöhten
Elimination von Leptin aus der Zirkulation, sodass später eine erneute Nahrungsaufnahme
angeregt werden kann (Zastrow et al., 2003). Dies könnte neben den geringen
Effekten des ATD-Test auf die sOB-R-Verfügbarkeit auch die relativ konstanten
Werte des FLI, die in dieser Studie gemessen wurden, mitbegründen. Der dabei
geschlechtsspezifische Zusammenhang hat insofern Relevanz, als aus evolutionärer
Sicht bei Frauen dadurch ein zusätzlicher Sicherungsmechanismus greifen könnte,
um im Fall von reduziertem zentralnervösem 5-HT eine erneute, spätere Nahrungsaufnahme
längerfristig zu gewährleisten. Im ZNS könnte 5-HT zum Beispiel dann
vermindert sein, wenn nicht genügend TRP, welches in vielen Nahrungsmitteln enthalten
ist, aufgenommen wurde. Der Weg zur erneuten Nahrungsaufnahme würde
in diesem Fall über die im Verlauf folgende Elimination von Leptin begünstigt. Jedoch
ist ein potenzieller Mechanismus, durch welchen eine verringerte zentralnervöse
Synthese von 5-HT die sOB-R-Konzentration, im Speziellen bei Frauen, beeinflussen
könnte, unklar. Hier scheint eine Regulation über das autonome Nervensystem oder
über immunologisch vermittelte Prozesse denkbar.
Möglich wäre, dass aufgrund der nach Verabreichung des ATD-Test relativ schnell
eingetretenen Verminderungen der sOB-R-Konzentrationen bei den weiblichen Teilnehmerinnen
immunologisch vermittelte Prozesse, beispielsweise durch den TNF-α
oder Interleukine moduliert, die sOB-R-Konzentration beeinflussen. Neue Resultate
gaben Hinweise dafür, dass TNF-α die Empfindlichkeit des Körpers für Leptin hochreguliert,
wobei ein Anstieg des sOB-R oft auch als Beiprodukt im Rahmen eines
Anstiegs des Ob-R verstanden wird (Gan et al., 2012). Übertragen auf die Befunde
der vorliegenden Studie könnte dies bedeuten, dass eine verminderte zentralnervöse
Synthese von 5-HT (vor allem bei Frauen wegen einer geringeren Synthese von zentralem
5-HT im Vergleich zu Männern) zu einer Verminderung des Ob-R führt,
vermittelt über immunologische Prozesse bzw. TNF-α. TNF-α führt unter anderem
zu einer Aktivierung der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse
(HPA-Achse), aktiviert neuronale 5-HT-Transporter und führt zu einer Stimulation
38

der Indoleamin 2,3-Dioxygenase, was in der Folge auch eine TRP-Depletion bewirken
kann. Während einer depressiven Episode führt jedoch eine erhöhte Aktivität
der HPA-Achse zu einer Verminderung von TNF-α bei Normalisierung von TNF-α
nach Remission der depressiven Symptomatik (siehe Berthold-Losleben & Himmerich,
2008). Die Vergabe des ATD-Test wird auf neurochemischer Ebene im Sinne
eines zentralnervösen serotonergen Defizits als Challenge-Test für eine depressive
Symptomatik vor allem bei Patientinnen mit bestimmten genetischen Risikofaktoren
angesehen (Walderhaug et al., 2007). Von diesem Modell ausgehend kann überlegt
werden, ob bei weiblichen Teilnehmerinnen (mit verminderter zentralnervöser
5-HT-Synthese im Vergleich zu Männern) der ATD-Test zu einer signifikanten Verminderung
der 5-HT-Synthese führt, und im Nachgang dieses Defizits eine durch
TNF-α modulierte Herabsetzung der Empfindlichkeit des Körpers gegenüber Leptin
(ausgedrückt durch Herabregulation von Ob-R mit begleitender Verminderung
des sOB-R als Surrogat dieses Mechanismus) einsetzt. Auf biologischer Ebene macht
ein solcher Mechanismus Sinn, vor allem da bei depressiver Symptomatik die Nahrungsaufnahme
aufrecht erhalten werden muss, auch um eine genügende Zufuhr von
TRP, der physiologischen Vorläuferaminosäure von 5-HT, zu gewährleisten.
Die gefundene Assoziation zwischen einer verminderten Konzentration von sOB-R
und einer verringerten zentralnervösen Synthese von 5-HT ist auch für die häufige
Komorbidität von Essstörungen und depressiven Erkankungen von Bedeutung,
welche ebenfalls mit verminderten zentralnervösen 5-HT-Konzentrationen assoziiert
sind.
Wenn man die Mechanismen aus der Perspektive, dass 5-HT vornehmlich über
NPY/AgRP- und POMC-Neurone leptinähnliche Effekte hat (Heisler et al., 2006),
beschaut, so würde sich ein anderes Bild ergeben: Eine verminderte 5-HT-Konzentration
müsste hier zu erhöhtem Hungergefühl führen (wobei im Fall der vorliegenden
Studie durch die Vergabe der AS als Nahrungsbestandteile und eine damit eventuell
assoziierte Sättigung diesem Effekt entgegengewirkt haben könnten). Diesem Ansatz
folgend würde eine Verminderung der sOB-R-Konzentration insofern Sinn ergeben,
als hierdurch eine erhöhte Leptin-Wirkung den wegfallenden Sättigungseffekt von
verminderter 5-HT-Konzentration ggf. kompensieren oder zumindest abschwächen
könnte.
Es ist von klinischem Interesse, diese Bereiche weiter zu erforschen, auch weil sie
in Zukunft eine klinisch relevante Bedeutung für die nicht vollständig aufgeklärte
Pathophysiologie von Essstörungen oder von Adipositas haben könnten. Zur Auswirkung
einer verminderten 5-HT-Synthese im ZNS auf die sOB-R-Konzentration gibt
es bislang keine humanexperimentellen Daten. In der vorliegenden Studie konnten
diesbezüglich geschlechtsspezifische Unterschiede festgestellt werden. Mögliche Erklärungsansätze
hierfür, eventuell auf der Grundlage einer durch den ATD-Test und
der damit verbundenen verminderten zentralnervösen 5-HT-Synthese induzierten
39

Verminderung von sOB-R sowie eines dadurch veränderten Transports von Leptin
über die Blut-Hirn-Schranke, wurden diskutiert. Jedoch sind weiterführende Studien,
speziell unter Berücksichtigung geschlechtsspezifischer Aspekte, notwendig.
5.4 Einfluss des Acute Tryptophan Depletion-Test auf Neuropeptid
Y
In der vorliegenden Untersuchung konnte kein signifikanter Zusammenhang zwischen
dem ATD-Test Moja-De und NPY-Konzentrationen gefunden werden. Ursachen
hierfür könnten die relativ kleine Untersuchungsgruppe, der Anteil nicht-zentraler
NPY-Produktion und das gewonnene Untersuchungmaterial (Serumproben) sein.
Zum Anteil nicht-zentraler NPY-Produktion ist zu beachten, dass die periphere
NPY-Konzentration wahrscheinlich nicht exakt widerspiegelt, inwiefern NPY im
ZNS verfügbar ist. NPY wird nicht nur im ZNS exprimiert, sondern auch in der Peripherie
des menschlichen Körpers. So wird NPY zusammen mit Noradrenalin und
ATP im sympathischen Nervensystem freigesetzt sowie in zentralen wie peripheren
cholinergen und nicht cholinergen Neuronen, und wirkt antikonvulsiv, antidepressiv
und antinozizeptiv (Lundberg et al., 1982; Lundberg et al., 1983; Pedrazzini
et al., 1998; Cox, 2007). Im enterischen Nervensystem ist NPY vor allem in noncholinergen
und nonadrenergen Neuronen vertreten und wird zusammen mit anderen
Neurotransmittern co-exprimiert (Furness et al., 1983; Cox, 2007). Ebenso kommt
es im Intestinum von Säugetieren, speziell in myenterischen und subkutanen Neuronen,
die die glatte Muskulatur und die Mukosa innervieren, vor (Cox, 2007). Des
Weiteren ist NPY auch nicht nur in Neuronen, sondern im subkutanen abdominalen
Fettgewebe zu finden (Kuo et al., 2007; Kos et al., 2007; Yang et al., 2008).
Diese Aufzählung macht deutlich, wieso NPY zahlreiche verschiedene Funktionen
inne hat, was im Übrigen auch gesondert für seine Vertretung im ZNS gilt. So ist
z.B. auch in Gliazellen und in olfaktorische Zellen umhüllenden Zellen (Schwannzellvorläufern)
mit möglicherweise trophischer Wirkung NPY gefunden worden (Hansel
et al., 2001; Ubink et al., 2003). NPY spielt neben seiner Funktion im zentral gesteuerten
Energiemetabolismus als orexigener Faktor unter anderem ebenfalls eine
Rolle bei der Regulation des Blutdrucks (indem es die Kontraktion von Blutgefäßen
reguliert), bei der Angiogenese, bei der Wundheilung, ferner bei der Regulation von
Schmerzen und von Angst sowie bei der Reaktion auf Stress der kortikotropen Achse
(Pedrazzini et al., 1998; Pedrazzini et al., 2003; Kuo & Zukowska, 2007; Maniam &
Morris, 2012).
Durch das epidemiologische Problem der Adipositas ist die Erforschung der Wirkung
von NPY im Energiemetabolismus von großer Relevanz. Auch in der vorliegenden
Arbeit lag der Fokus auf der Funktion des Neuropeptids im Energiehaushalt. Im
Bereich der psychiatrischen Medizin sind auch die Ursachen anderer Essstörungen
wie der AN oder der BN in den Fokus zu nehmen und die diesbezüglichen Zusam-
40

menhänge weiter zu hinterfragen, da die zugrunde liegende Pathophysiologie der
genannten Störungsbilder nach wie vor nur unvollständig geklärt ist. Die Berücksichtigung
der anderen Funktionen von NPY und dadurch weiterer einflussnehmenden
Faktoren sollte Gegenstand zukünftiger Untersuchungen sein, damit ein deutlicheres
Bild der Ursachen von Essstörungen gezeichnet werden kann.
Weiterhin könnte ein möglicher Erklärungsansatz für die vorliegenden Untersuchungsergebnisse
die Tatsache sein, dass NPY im Serum bestimmt wurde, während
die Mehrheit der zitierten Veröffentlichungen bezüglich einer Interaktion zwischen
dem 5-HT- und NPY-System auf tierexperimentell gewonnene Daten zurückgreifen.
Andere humanexperimentelle Untersuchungen bezogen sich auf Liquoruntersuchungen
und den aus ihnen gewonnenen Daten – mit Ausnahme einer veröffentlichten
Studie, die NPY-Plasmakonzentrationen bei Menschen untersuchte, hierunter gesunde
und medikationsfreie Patienten/-innen mit remittierter Depression, unter ATDund
BAL-Bedingungen (Czermak et al., 2008). Es wurden dabei keine signifikanten
Unterschiede zwischen gesunden Kontrollpersonen und Patienten/-innen nach ATDbzw.
BAL-Einnahme gefunden. Jedoch hatte die Studie einige nennenswerte Limitationen.
Die NPY-Proben wurden zu T0 und dann erst wieder nach 5, 7 und 24
Stunden nach ATD- bzw. BAL-Einnahme gewonnen, was insofern von Bedeutung
ist, als eine maximale Reduktion der TRP-Plasmakonzentration nach 3-5 Stunden
zu erwarten ist (Delgado et al., 1990; Young et al., 1985). Diese Resultate bezüglich
des Zeitverlaufs (Delgado et al., 1990; Young et al., 1985) sind mit den Ergebnissen
der vorliegenden Studie im Einklang, da eine maximale Reduktion des TRP-Influxes
bereits bei T2 (3 Stunden nach ATD-Einnahme) erreicht wurde und sich der TRP-
Influx bei T3 (4,5 Stunden nach ATD-Einnahme) geringfügig erhöhte. Daher wären
ggf. frühere BE sinnvoller gewesen, während die späteren, wie durch Czermak et al.
durchgeführt, keine signifikanten Effekte des ATD-Test ergaben, da eine Repletion
bereits wieder eingesetzt haben könnte.
Weiterhin kann eine prolongierte Depletion, wie sie in jener Studie angewandt wurde,
metabolische Konsequenzen nach sich ziehen, welche die erhobenen Daten beeinflusst
haben könnten (Klaassen et al., 1999b). Zum Beispiel fehlen diesbezüglich
Daten zur Auslösung oxidativen Stresses, möglicherweise hervorgerufen durch eine
prolongierte Depletion.
Abschließend sind in der Veröffentlichung keine Angaben zur Zusammensetzung der
dort verwendeten ATD-Methode zu finden bezüglich der Art und Mengenangaben
der verschiedenen AS und ebenso wenig darüber, wie die prolongierte Depletion
praktisch umgesetzt wurde. Außerdem wurden auch keine Informationen darüber angegeben,
ob mögliche unerwünschte Nebenwirkungen bei oder nach ATD-Einnahme
bei den Untersuchungsteilnehmern/-innen eingetreten waren. Dies ist wichtig, da
z.B. Erbrechen ebenfalls den metabolischen Status beeinflussen kann und somit in
Hunger- und Sättigungsprozesse eingreift. Ferner war das Geschlechterverhältnis mit
41

jeweils um die 70% in der Patienten- und der gesunden Kontrollgruppe zugunsten
der weiblichen Teilnehmerzahl nicht ausgeglichen.
NPY-Serumkonzentrationen bilden möglicherweise nicht exakt ab, wie es sich mit
der zentralnervösen Verfügbarkeit dieses Neuropeptides verhält, welche wegen des
Schwerpunktes auf zentrale, den Energiehaushalt betreffende Vorgänge, im Interesse
der vorliegenden Studie stand. Dass das zentrale NPY von 5-HT beeinflusst wird,
gilt als wahrscheinlich. Eine Verabreichung serotonerger Agonisten vermindert über
eine Hyperpolarisation der AgRP/NPY-Neurone über den G i -gekoppelten Rezeptor
Htr1b die Exprimierung von NPY mRNA, wodurch 5-HT neben seiner Wirkung auf
die Leptin-Achse in die Regulation von Hunger eingreift (Choi et al., 2006; Heisler
et al., 2006; Garfield & Heisler, 2009).
Zuletzt ist auch in diesem Teil der Untersuchung die relativ kleine Untersuchungsgruppe
limitierend, die durch den Ausschluss eines weiteren Untersuchungsteilnehmers
in Bezug auf NPY noch verkleinert wurde. Zukünftige Studien mit größeren
Stichproben werden benötigt, um die zugrundliegenden Mechanismen von 5-HT- und
NPY-Interaktionen bei Menschen weiter zu erforschen. Die vorliegende Studie liefert
diesbezüglich erste, wenn auch vorläufig negative Ergebnisse, wobei die gewonnenen
Daten auch zur Fallzahlabschätzung größerer randomisierter Studien herangezogen
werden können.
42

6 Zusammenfassung
Die Gabe des ATD-Test Moja-De ist eine physiologische bzw. neurodiätetische Methode,
um kurzfristig die zentralnervöse 5-HT-Synthese bei Erwachsenen und Kindern
sowie Jugendlichen zu senken. Es handelt sich dabei um eine tryptophanfreie
Aminosäuremischung, die in einer wässrigen Suspension verabreicht wird. TRP ist
eine essenzielle AS, die als physiologische Vorstufe für die Synthese von 5-HT im
ZNS dient. Hierfür muss TRP mit Hilfe des L1-Transporters die Blut-Hirn-Schranke
überwinden und konkurriert dabei mit anderen LNAA.
Im Gegensatz zu anderen ATD-Zusammensetzungen ist die des ATD-Test Moja-De
gewichtsadaptiert und auch die Quantitäten der AS sind im Vergleich zu anderen
Zusammensetzungen mäßig verändert (Kewitz, 2002; Demisch et al., 2002). Dadurch
führt Moja-De zu insgesamt weniger unerwünschten Nebenwirkungen wie z.B. Übelkeit
und Erbrechen und kann auch bei Kindern und Jugendlichen angewandt werden.
In dieser Dissertation sollte zum einen die ATD-Methode Moja-De mit Hilfe von
TRP- und anderen LNAA-Plasmakonzentrationen und dem errechneten Influx von
TRP über die Blut-Hirn-Schranke untersucht werden. Zum anderen sollten die Auswirkungen
des ATD-Test Moja-De auf die Leptin-Achse, dem aus Leptin und sOB-R
errechneten Quotienten, dem FLI, und auf periphere NPY-Konzentrationen untersucht
werden.
Es wurden 24 junge, gesunde Erwachsene, 12 Frauen und 12 Männer, im Alter zwischen
21 und 30 Jahren für das Forschungsvorhaben rekrutiert und die Daten pro
Untersuchungsteilnehmer/-in an zwei separaten Tagen gewonnen. An jedem Untersuchungstag
nahmen die Teilnehmer/-innen zu Beginn eine Aminosäuremischung
ein, entweder den ATD-Test oder eine Kontroll-Aminosäuremischung (BAL). Die
Vergabe erfolgte doppelblind randomisiert in einem innersubjektiven Crossover Design
mit Messwiederholung. Kurz vor Einnahme von ATD/BAL und an drei Zeitpunkten
danach (90, 180 und 270 Minuten nach ATD-/BAL-Einnahme) wurde den
Teilnehmern/-innen Blut entnommen, um die Plasmakonzentrationen der relevanten
AS, die mit TRP an dem gleichen Transportsystem an der Blut-Hirn-Schranke
um die Aufnahme in das ZNS konkurrieren, sowie die Serumkonzentrationen von
Leptin, sOB-R und NPY zu bestimmen.
Der TRP-Influx über die Blut-Hirn-Schranke wurde mit Hilfe einer Michaelis-Menten-
Kinetik mit einer Korrektur für multiple Substrathemmung berechnet. Hiermit wurde
ein signifikant reduzierter TRP-Influx in das ZNS unter Moja-De ermittelt, was
zusammen mit bisherigen Studienergebnissen für eine verminderte zentrale Verfügbarkeit
der 5-HT-Vorläuferaminosäure TRP und somit für eine Verminderung der
zentralnervösen 5-HT-Synthese spricht, vor allem im Sinne einer verminderten Substratverfügbarkeit
für die TPH2, das geschwindigkeitsbestimmende Enzym der Synthese
von 5-HT im ZNS.
43

Die Aminosäuremischungen wurden von allen Studienteilnehmer/-innen insgesamt
betrachtet gut vertragen. Die ATD-Methode kann als sicher und effektiv bezüglich
einer Verminderung des TRP-Influxes bewertet werden, was aufgrund der körpergewichtsadaptierten
Zusammenstellung der AS für die Anwendbarkeit nicht nur bei
Erwachsenen, sondern auch bei Kindern und Jugendlichen spricht.
Eine Auswirkung des ATD-Test Moja-De auf die Leptin-Achse konnte in Hinblick
auf die Gruppe der weiblichen Teilnehmerinnen und dem Parameter sOB-R gefunden
werden. Dies stellt eine deutliche Neuerung zu bisher publizierten Resultaten
dar, wobei bisherige Veröffentlichungen zur Interaktion von zentralnervösem 5-HT
und der Leptin-Achse vor allem auf tierexperimentellen Befunden basierten. Die bei
den weiblichen Teilnehmerinnen beobachtete verringerte sOB-R-Konzentration nach
Gabe des ATD-Test könnte zum einen als Korrelat eines verringerten Transports
von Leptin über die Blut-Hirn-Schranke verstanden werden. Zum anderen kann sie
auf einen alternativen Regulationsmechanismus für die periphere Verfügbarkeit von
Leptin hinweisen, so zum Beispiel über immunologisch vermittelte Mechanismen mit
Wirkung auf OB-R und sOB-R. Unter Berücksichtigung der bei Frauen im Vergleich
zu Männern geringeren zentralnervösen 5-HT-Synthese (Nishizawa et al., 1997) sind
diese geschlechtsspezifischen Effekte der 5-HT-Interaktion mit der Leptin-Achse für
die nach wie vor nicht vollständig aufgeklärte Pathophysiologie von Essstörungen
von Bedeutung. Keine signifikanten Ergebnisse brachten die Untersuchungen der
Auswirkung des ATD-Test auf Leptin, den FLI und NPY.
In zukünftigen Untersuchungen sollten mit größeren Stichproben sekundäre, kompensatorische
Effekte, die durch den ATD-Test hervorgerufen werden, weiter untersucht
werden. Diese sollten Untersuchungsteilnehmer/-innen mit neuropsychiatrischen
Störungen, die im Zusammenhang mit veränderten zentralnervösen 5-HT-
Funktionen stehen, einschließen. Die Gabe des ATD-Test Moja-De ist eine physiologische
Methode, die das Einbinden dieser Gruppen aufgrund hoher Sicherheit seiner
neurochemischen Eigenschaften und seiner guten Verträglichkeit erlaubt.
44

7 Summary
Acute tryptophan depletion (ATD) Moja-De is a physiological method of reducing
central nervous serotonin (5-HT) synthesis in children, adolescents, and adults. It involves
the administration of amino acids (AA) within an aqueous suspension lacking
in tryptophan (TRP). TRP is an essential AA serving as the physiological precursor
of 5-HT. ATD occurs because all relevant AA in the beverage use the same active
large neutral amino acid (LNAA) transport system (L1) in the capillary cell plasma
membrane to pass the blood-brain barrier.
However, to date the use of conventional ATD protocols in children and adolescents
was limited due to frequently observed side effects (e.g., vomiting and nausea). In
contrast, Moja-De is a weight-adapted protocol that takes a positive correlation
between body weight and plasma TRP into account (Kewitz, 2002; Demisch et al.,
2002), therefore allowing its use in children and adolescents with fewer side effects.
This study’s aim was to investigate the ATD procedure Moja-De by looking at
plasma concentrations of TRP and competing LNAA and TRP influx across the
blood-brain barrier into the brain on the one hand. On the other hand, the effects
of ATD Moja-De on the leptin axis as indexed by Leptin and sOB-R concentrations
as well as the free leptin index (FLI, the quotient of leptin and its soluble receptor
sOB-R) and on peripheral neuropeptide Y (NPY) concentrations were investigated.
The sample consisted of 24 healthy, young participants aged 21 to 30 years (12 males
and 12 females). Data were obtained on two different study days for each participant.
The participants received an AA beverage at the beginning of each study day, either
ATD or a TRP-balanced amino acid load (BAL), using a randomized double-blind
within-subject repeated measures crossover design.
Participants’ blood samples were taken at baseline before and at 90, 180, and 270
minutes after ATD/BAL intake to assess plasma concentrations of the relevant AA
that compete with TRP on the same transport system as well as serum concentrations
of Leptin, sOB-R, and NPY.
TRP influx across the blood–brain barrier was calculated using Michaelis–Menten
kinetics with a correction for multiple substrate competition, indicating a significant
decrease in TRP influx into the central nervous system after intake of ATD
Moja-De. The decreased TRP influx into the brain suggests a diminished central
nervous system availability of the 5-HT precursor TRP and thus, a reduced central
nervous 5-HT synthesis, particularly in terms of a decreased substrate availability
for Tryptophan hydroxylase 2 (TPH2), the enzyme that limits the 5-HT synthesis
rate in the CNS.
Overall, the AA beverages were well tolerated amongst all study participants. ATD
Moja-De can be considered as a safe and effective method of reducing TRP influx
into the brain. It can not only be used in adults, but also in children and adolescents
because of its fewer side effects and a body weight adapted dosing regimen.
45

Concerning the ATD Moja-De induced alterations of the leptin axis, there were
effects on sOB-R serum concentrations in female participants observed as indexed
by reduced sOB-R concentrations in female participants after administration of the
ATD-test. This relationship has not been demonstrated before, and previous research
on interactions between brain 5-HT and the leptin axis mainly relied on animal
models. This effect might indicate a reduced transport of leptin across the bloodbrian-barrier.
Furthermore, it may suggest an alternative regulatory mechanism of
peripheral leptin availability, possibly via immunological mechanisms affecting OB-
R- and sOB-R-concentrations. Taking into account that females in general show a
lower central nervous synthesis of 5-HT when compared to males (Nishizawa et al.,
1997), these gender-related effects with respect to an interaction between the leptin
axis and 5-HT are relevant for the understanding of the pathophysiology of eating
disorders. The present results do not support an association between ATD administration
and the plasma concentrations of leptin, FLI, and NPY in healthy adults.
Future research with larger samples including healthy populations and patients with
neuropsychiatric disorders which are associated with changes in central nervous 5-
HT function as well as simultaneous consideration of other secondary compensatory
effects induced by ATD is needed. Administration of the ATD-test Moja-De as a
physiological method to lower central nervous 5-HT synthesis allows the involvement
of such vulnerable groups because of its safe neurochemical properties and
good tolerability.
46

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Ueckermann, J., Kraemer, M., Wiltfang, J., Kis, B., & Zepf, F. D. (2012). The effects
of acute tryptophan depletion on reactive aggression in adults with attentiondeficit/hyperactivity
disorder (ADHD) and healthy controls. PLOS One, 7(3),
e32023.
Ziylan, Y. Z., Baltaci, A. K., & Mogulkoc, R. (2009). Leptin transport in the central
nervous system. Cell Biochemistry and Function, 27(2), 63–70.
61

A
Anhang
A.1 Verzeichnis der Tabellen
1 Charakteristika des Studienkollektivs mit Mittelwerten ± Standardabweichungen
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2 Zusammensetzung der Aminosäuremischungen ATD/BAL in der Modifikation
Moja-De . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
3 Statistische Kennwerte der RMANOVAs für die im ATD-Test bzw.
in der BAL-Aminosäuremischung enthaltenen Aminosäuren . . . . . . 20
4 Mittelwerte (M ) ± Standardabweichungen (SD) der im ATD-Test
bzw. in der BAL-Aminosäuremischung enthaltenen Aminosäuren . . . 21
5 Mittelwerte (M ) ± Standardabweichungen (SD) der Parameter der
Leptin-Achse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
6 Mittelwerte M ± Standardabweichungen (SD) von NPY . . . . . . . 28
62

A.2 Verzeichnis der Abbildungen
1 Ablauf des zentralnervösen Serotonin-Metabolismus . . . . . . . . . . 3
2 Tryptophan (TRP)-Influx (berechnet mit gesamtem TRP) . . . . . . 18
3 Tryptophan (TRP)-Influx (berechnet mit freiem TRP) . . . . . . . . 18
4 Plasmakonzentrationen des gesamten Tryptophans über den Zeitverlauf
nach ATD-/BAL-Einnahme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
5 Plasmakonzentrationen des freien Tryptophans über den Zeitverlauf
nach ATD-/BAL-Einnahme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
6 Konzentrationsverläufe der langkettigen, neutralen Aminosäuren nach
ATD-Einnahme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
7 Konzentrationsverläufe der langkettigen, neutralen Aminosäuren nach
BAL-Einnahme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
8 Plasmakonzentrationen des sOB-R nach ATD-Einnahme von Frauen
und Männern im Vergleich . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
9 Plasmakonzentrationen des sOB-R nach BAL-Einnahme von Frauen
und Männern im Vergleich . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
63

A.3 Erfolgte Veröffentlichung
Dingerkus V.L.S., Gaber T.J., Helmbold K., Bubenzer S., Eisert A., Sánchez C.L.,
Zepf F.D. (2012). Acute tryptophan depletion in accordance with body weight: Influx
of amino acids across the blood-brain barrier. Journal of Neural Transmission,
119(9), 1037-45
64

A.4 Danksagung
Zunächst möchte ich allen Untersuchungsteilnehmern und -teilnehmerinnen herzlich
danken für die Zeit, die sie sich für die Durchführung des experimentellen Teils der
Studie genommen haben.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. med. Florian Zepf, Juniorprofessor
für Translationale Hirnforschung in Psychiatrie und Neurologie, für die freundliche
Überlassung des Themas dieser Dissertation und die zuverlässige Unterstützung.
Für ihr besonderes Engagement, insbesondere für ihre geduldigen Erklärungen bei
der statistischen Auswertung und die angenehme Arbeitsatmosphäre danke ich Herrn
Dipl.-Psych. Tilman Gaber und seinen Kolleginnen Frau M. Sc. Sarah Bubenzer,
Frau Dipl.-Psych. Katrin Helmbold, Frau M. Sc. Eva-Lotte Knospe und Frau Dr.
Cristina L. Sánchez López sowie Herrn M. Sc. David Baurmann.
Zu erwähnen ist zudem Herr PD Dr. med. Lars Wöckel, der die Aufklärung der
Teilnehmer/-innen übernahm, wenn Herr Prof. Dr. med. Florian Zepf hierfür aus
zeitlichen Gründen nicht zur Verfügung stehen konnte.
Weiterhin danke ich Herrn PD Dr. rer. nat. Stephan Wnendt, welcher einen Teil
der Laboranalysen übernahm und darüber hinaus auch für die Beantwortung von
Fragen zur Methodik der Laboranalytik zur Verfügung stand.
Bedanken möchte ich mich darüber hinaus bei Herrn Prof. Dr. rer. nat. Jürgen
Kratzsch und seinem Team für die Duchführung der Laboranalysen bezüglich Leptin
und des sOB-R und der fachlichen Erläuterung bezüglich der hierfür angewandten
Methodik.
Herrn Dr. rer. nat. Albrecht Eisert, Chefapotheker des Universitätsklinikums Aachen,
und seinem Team möchte ich danken für die Bereitstellung der Aminosäurenmischungen.
Zuletzt sind noch jene Personen zu nennen, die mir nicht nur bei inhaltlichen und
formalen Fragen, sondern auch persönlich mit besonderer Unterstützung zur Seite
standen: Andreas Peters, Johanna Schmalbrock, Lisa Giesekus, Kiera Berry, Sina
Koch und - allen voran - Gerlinde, Manuel und Mark Dingerkus.
65

Erklärung § 5 Abs. 1 zur Datenaufbewahrung
Hiermit erkläre ich, dass die dieser Dissertation zu Grunde liegenden Originaldaten
bei meinem Betreuer, Prof. Dr. med. Florian Daniel Zepf, Professor als Juniorprofessor,
Lehr- und Forschungsgebiet Translationale Hirnforschung in Psychiatrie und
Neurologie an der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des
Kindes- und Jugendalters des Universitätsklinikums Aachen, hinterlegt sind.
—————————————
Vita Louisa Sophie Dingerkus

Eidesstattliche Erklärung gemäß § 5 Abs. (1) und
§ 10 Abs. (3) 12. der Promotionsordnung
Hiermit erkläre ich, Frau Vita Louisa Sophie Dingerkus an Eides statt, dass ich
folgende in der von mir selbstständig erstellten Dissertation Untersuchungen des
”
Einflusses des Acute Tryptophan Depletion-Test Moja-De auf den Tryptophan-
Influx in das zentrale Nervensystem, die Leptin-Achse und periphere Neuropeptid
Y-Konzentrationen“ dargestellten Ergebnisse erhoben habe: Durchführung sämtlicher
dargestellter Experimente sowie deren statistische Auswertung, Interpretation
der Daten und Erstellung des wesentlichen Anteils des Manuskripts der erfolgten
Veröffentlichung. Bei der Durchführung der Arbeit hatte ich folgende Hilfestellungen,
die in der Danksagung angegeben sind:
1. Prof. Dr. med. Florian Zepf, Professor als Juniorprofessor: Studiendesign und
–überwachung, Korrektur der Dissertation und Aufklärungen der Studienteilnehmer/-innen,
Hilfestellung bei der Erstellung des Manuskripts der erfolgten
Veröffentlichung und deren Korrektur.
2. Herr Dipl.-Psych. Tilman Gaber, Frau M. Sc. Sarah Bubenzer, Frau Dipl.-
Psych. Katrin Helmbold und Frau M. Sc. Eva-Lotte Knospe, Frau Dr. Cristina
Sánchez López, Herr M. Sc. David Baurmann: Hilfestellung bei der statistischen
Auswertung
3. PD Dr. med. Lars Wöckel: Teilweise Duchführung der Aufklärung der Teilnehmer/-innen
4. PD Dr. rer. nat. Stephan Wnendt: Duchführung eines Teils der Laboranalysen
und Hilfestellung zum Kapitel Analyse der Blutproben“
”
5. Prof. Dr. rer. nat. Jürgen Kratzsch: Duchführung des Teils der Laboranalysen
bezüglich Leptin und des sOB-R und Hilfestellung zum Kapitel Analyse der
”
Blutproben“
6. Herr Dr. rer. nat. Albrecht Eisert: Bereitstellung der Aminosäurenmischungen
—————————————
Vita Louisa Sophie Dingerkus
Als Betreuer der oben genannten Dissertation bestätige ich die Angaben von Frau
Vita Louisa Sophie Dingerkus
—————————————
Prof. Dr. med. Florian Zepf,
Professor als Juniorprofessor