636 Originalarbeiten « Zucker- und Alkoholgehalten auf die Trennleistung der optimierten Bestimmungsmethode untersucht. Material und Methoden Chemikalien Die Standards Gallussäure, Protocatechusäure, Tyrosol, Protocatechualdehyd, (+)-Catechinhydrat, Vanillinsäure, Syringasäure, (–)-Epicatechin, Kaffeesäure, p-Cumarsäure, Syringaaldehyd, Ferulasäure und trans-Resveratrol wurden von Sigma Aldrich (Taufkirchen), (–)-Epicatechingallat von AppliChem (Darmstadt) und die Caftarsäure von Phyto- Plan (Heidelberg) erworben. Ethanol p. a. (Merck, Darmstadt) wurde zur Herstellung der Kalibrierlösungen verwendet. Acetonitril (HPLC-grade, Prolabo, Darmstadt) und Phosphorsäure (85 %, Merck, Darmstadt) wurden zur Fließmittelherstellung verwendet. Weine Zur Überprüfung der Eignung der Kinetex-PFP-Säule zur Bestimmung des Polyphenolgehaltes im Weißwein wurden folgende Weine unterschiedlicher Rebsorten und Alkoholgehalte herangezogen: Bernkasteler Badstube Riesling trocken (2010, 11,5 %Vol., 8,1 g/L Restzucker), Riesling feinherb (2010, 11 %Vol., 22,1 g/L Restzucker), Riesling Zeltinger Schlossberg fruchtsüß (2010, 11 %Vol., 69,7 g/L Restzucker), Rivaner QbA trocken (2011, 12 %Vol., 6,4 g/L Restzucker), Blanc de Noir QbA trocken (2011, 13 %Vol., 7,7 g/L Restzucker), Gewürztraminer QbA trocken (2011, 13,5 %Vol., 1,8 g/L Restzucker). Analytische Methode Die Chromatografie der Polyphenole erfolgte an einem Agilent Technologies System der Serie 1200 mit UV-Detektor. Zur Trennung der einzelnen Polyphenole wurde eine Kinetex-PFP-Säule (75 × 4,6 mm; 2,6 μm; TMS encapped) der Fa. Phenomenex verwendet. Als Fließmittel A wurde Wasser/Phosphorsäure (99,5/0,5 %; v/v; pH 1,6) und als Fließmittel B Acetonitril/Wasser/Phosphorsäure (50/49,5/0,5 %; v/v; pH 1,9) verwendet (Rechner et al., 1998; Bonerz et al., 2008). In Tabelle 1 ist das verwendete Stufen-Gradientensystem wiedergegeben. Die Flussrate betrug 1 mL/min; das Injektionsvolumen lag bei 20 μL. Die Chromatogramme wurden bei den Wellenlängen 280 und 320 nm aufgenommen. Tab. 1 Gradientenprogramm Time [min] % A % B 0 90 10 13 62 38 20 60 40 22 0 100 27 0 100 28 90 10 35 90 10 Probenvorbereitung Die Proben und Kalibrierstandards wurden membranfiltriert (Cellulose-Acetat-Membran; 0,45 μm; VWR, Darmstadt, Deutschland) und anschließend direkt injiziert. Validierungsparameter Die Kalibrierstandards wurden im Bereich von 0,1 bis 200 mg/L je Analyt in einer 10 %igen Ethanollösung p. a. angesetzt. Die Zuordnung der Polyphenole im Wein erfolgte anhand der Retentionszeiten der Peaks der entsprechenden Standards. Zur Untersuchung der Matrixeinflüsse des Weines wurde zusätzlich eine Weinprobe mit 10 mg/L der aufgeführten Polyphenole aufdotiert und die Retentionszeiten verglichen. Die Quantifizierung erfolgte mittels linearer Regression der Peakflächen der Kalibrierstandards und wurde als Konzentration in mg/L angegeben. Zur Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen wurde ein Signal/Rausch-Verhältnis von 3:1 bzw. 10:1 beim kleinsten Standard herangezogen (Kromidas, 1999). Zur Ermittlung der Wiederfindungsraten der verwendeten Polyphenole wurde der Kalibrierstandard der Konzentration 10 mg/L gemessen. Zur Ermittlung der Verfahrens-Standardabweichungen der Polyphenole wurde die mit 10 mg/L aufdotierte Weinprobe zehnfach gemessen. Ergebnisse und Diskussion Chromatografische Trennung Bei dieser Methode wird eine Säule mit einer Pentafluorphenyl-Phase (Abb. 1) eingesetzt, die aufgrund ihres Aufbaus mit den aromatischen und polaren Molekülbestandteilen der Polyphenole Wechselwirkungen ausbilden kann. Weiterhin zeichnet sich die verwendete Kinetex-Säule durch die kurze Trennlänge (75 μm) und die geringe Partikelgröße der stationären Phase (2,6 μm) aus, wodurch eine verkürzte Trenndauer der Polyphenole erreicht werden kann. Im Gegensatz zu vollporösen Partikeln bestehen die Partikel der verwendeten Kinetex-Säule aus einem festen Kern mit einer porösen Hülle. Dadurch wird eine reduzierte Diffusionsstrecke der Analyten erreicht, was zu einer verbesserten Auflösung und einer verkürzten Trenndauer führt (Phenomenex, Torrance, CA/USA). Bei den bisher in der Literatur beschriebenen Methoden wurden meist Säulen mit C18- bzw. Fluofix-Phasen (vollporöse Partikel, 5 μm Partikelgröße) mit einer Länge von 250 mm verwendet, bei denen die Trennung der Polyphenole pro Lauf zwischen 45 und 70 Minuten dauert. Durch die Verwendung der Kinetex-PFP-Säule konnte die Trenndauer der Polyphenole auf weniger als 20 Minuten verkürzt werden. Die anschließenden 15 Minuten des Gradientenprogramms dienen der Spülung der Säule. Die verwendeten Eluenten Wasser/Phosphorsäure (99,5/ 0,5 % v/v; pH 1,6) und Acetonitril/Wasser/Phosphorsäure (50/49,5/0,5 % v/v; pH 1,9; Rechner et al. 1998; Bonerz et al., 2008) haben sich im Gegensatz zu anderen in der Literatur beschriebenen Eluenten aus beispielsweise Wasser » 108. Jahrgang | Dezember 2012 | <strong>DLR</strong>
» Originalarbeiten 637 Absorption [mAU] 100 80 60 1 (a) 280 nm 4 9 40 2 7 14 20 3 6 10 0 2 4 6 8 10 12 Zeit [min] Absorption [mAU] 100 80 60 (b) 320 nm 5 8 11 12 13 40 20 0 15 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Zeit [min] Abb. 2 Polyphenol-Standardlösung 10 mg/L. (a) 1: Gallussäure, 2: Protocatechusäure, 3: Tyrosol, 4: Protocatechualdehyd, 6: (+)-Catechin, 7: Vanillinsäure, 9: Syringasäure, 10: (–)-Epicatechin, 14: (–)-Epicatechingallat; (b) 5: Caftarsäure, 8: Kaffeesäure, 11: p-Cumarsäure, 12: Syringaaldehyd, 13: Ferulasäure, 15: trans-Resveratrol Absorption [mAU] 200 175 150 125 100 75 50 25 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Zeit [min] 13 14 15 Abb. 3 Weinprobe (dunkelgrau) und mit 10 mg/L aufdotierte Weinprobe (hellgrau) und Methanol (Goldberg et al., 1996; Komes et al., 2007) für die Trennung der Polyphenole auf der Kinetex-PFP- Säule als geeignet herausgestellt. Abbildung 2 veranschaulicht die Trennung einer Polyphenol-Standardlösung der Konzentration 10 mg/L bei 280 nm (a) und 320 nm (b). <strong>DLR</strong> | Dezember 2012 | 108. Jahrgang « Die Absorptionsmaxima der einzelnen Polyphenole wurden mittels Wellenlängenscan im Bereich von 200 bis 450 nm fotometrisch ermittelt. Abbildung 3 zeigt eine mit 10 mg/L aufdotierte Weinprobe. Die ermittelten Retentionszeiten der Polyphenole der auf-