Mikrobiologische Übung FI, Teil 2b - Mikrobiologie und Weinforschung

enötigte Substanzen:
- 0,1% SDS aus 10% Stammlösung
- Chloroform (Abzug!)
- ONPG-Lösung (4 mg/ml in H 2 0, am Versuchstag frisch ansetzen)
- 1M Na 2 CO 3
Vorgehensweise:
Der Test wird in kurzen Reagenzgläsern durchgeführt, pro Kultur 4
Parallelbestimmungen (3 x mit Kultur, 1 x mit Medium für den Blindwert). Für alle
Testansätze kann der -Gal-Puffer (Reaktionspuffer mit 2-Mercaptoethanol), SDS
und Chloroform in die kurzen Reagenzgläser vorgelegt werden (siehe Durchführung).
Achtung: noch keine Bakterienkultur hinzugeben!!
WICHTIG:
Der Enzymtest wird zunächst nur mit der Lactosekultur durchgeführt! Erst wenn die
Lactose-Messreihe abgeschlossen ist, wird der Test mit der Glucose- und der
Glucose-/Lactosekultur parallel begonnen.
Durchführung:
- 0,8 ml -Gal-Puffer (im Abzug vorlegen)
- + 3 Tropfen Chloroform (mit Pasteurpipette im Abzug pipettieren!)
- + 2 Tropfen 0,1% SDS (Pasteurpipette)
bis hier für alle Ansätze vorbereiten
Dann den -Galactosidase-Test starten (erst mit Lactosekultur):
- + 0,2 ml Kultur (wichtig: unverdünnt aus vorbereitetem Eppi entnehmen!!!) bzw.
0,2 ml M9-Medium (Blindwert)
- 10 Sekunden mischen (vortexen)!!!!
- 5 min bei Raumtemperatur inkubieren
- Start der Reaktion durch Zugabe von 0,2 ml ONPG, gleichzeitig Zeitnahme
starten, Ansatz kurz vortexen
- die nächsten Proben im Abstand von 15 sec starten, Reihenfolge beachten!!!
- Inkubation bei RT bis eine deutlich sichtbare gelbe Farbe zu sehen ist.
- Stopp durch Zugabe von 0,5 ml Na 2 CO 3 (wieder 15 sec Abstand und Reihenfolge
einhalten! Zeit notieren!)
- kurz vortexen, ins Eisbad stellen
- in Eppendorfcups kippen und 5 min zentrifugieren
- den Überstand in eine Glasküvette pipettieren (ca. 0,8 ml, nicht kippen) und die
Extinktion der Proben (Testansatz mit Kultur bzw. Testansatz mit Medium =
Blindprobe) bei 420nm messen.
19