Mikrobiologische Übung FI, Teil 2b - Mikrobiologie und Weinforschung

Mikrobiologische Übung
FI, Teil 2b
Identifizierung, Wachstum
und Regulation
WS 2013/14
Mikrobiologie und Weinforschung
Johannes Gutenberg-Universität
Mainz
1

Hinweise zur Mikrobiologischen Übung FI, Teil 2b
1. Inhalt: Einführung in quantitatives Arbeiten in der Mikrobiologie.
2. Voraussetzung: Zulassung zum Studium der Biologie, Vordiplom oder
Zwischenprüfung, Mikrobiologische Grundvorlesung, Mikrobiologische Übung FI, Teil 1
oder Äquivalenzbescheinigung.
3. Zeit: Beginn: 9 00 Uhr
4. Anweisungen der MitarbeiterInnen sind unbedingt Folge zu leisten.
5. Die Versuchsansätze sind eindeutig zu beschriften.
6. Die Protokolle sind am angegebenen Tag abzugeben: Protokolle müssen freitags eine
Woche nach Ende der jeweiligen FI Übung, Teil 2 abgegeben werden. Nach einer weiteren
Woche können die Protokolle zur Überarbeitung abgeholt werden. Vier Wochen nach Ende
der F I Übung muß die endgültige Version abgegeben sein. Jeder Student erstellt ein Protokoll
zu Versuch 5 (Wachstum) oder Versuch 6 (Induktion der ß-Galaktosidase), sodaß pro
Zweiergruppe zu beiden Versuchen ein Protokoll vorliegt. Die Einteilung wird von den
Betreuern vorgenommen. Auf dem Protokoll Gruppennummer, Parallele, und Gruppenpartner
angeben und vermerken, wer das Protokoll verfasst hat!
Zu Versuch 7 wird von jedem Studenten ein Kurzprotokoll erstellt (siehe Versuchsvorschrift),
das von den Betreuern abgezeichnet wird.
7. Das Protokoll (Erstabgabe) wird bewertet (0 bis max. 4 Punkte). Für den Schein sind 50 %
der max. Punktzahl aus Klausur und Protokoll erforderlich (Summe beider Punkte !).
8. Jede(r) ÜbungsteilnehmerIn hat den Arbeitsplatz sauber zu hinterlassen.
Entsprechend den Anweisungen der/des ÜbungsleiterIn (oder VertreterIn) sind
Versuchsansätze zu versorgen und zu entsorgen.
9. Das Fernbleiben von der Übung ist möglichst früh im Sekretariat (Tel.: 39-22662) oder
dem/der Übungsleiter/in mitzuteilen. Ein Attest ist vorzulegen. Fehlzeiten von mehr als 1
Tag im Teil 2a/b müssen nachgeholt werden. Mehr als einmaliges Fernbleiben von den
Übungen ohne glaubhafte Entschuldigung schließt die Teilnahme am Abschlußtest aus.
10. Am Ende der Übung erfolgt ein schriftlicher Abschlußtest. Der Übungsschein wird
ausgegeben, wenn aus Versuchsdurchführung, Protokollen, Kolloquien und dem
Abschlußtest hervorgeht, daß die Leistungen ausreichen. Bei nicht ausreichenden
Leistungen kann der Abschlußtest wiederholt werden. Wird dieser Nachtest schuldhaft
versäumt, gilt die Übung als nicht bestanden.
11. Über die Gefahrenstoffverordnung und Sicherheitsmaßnahmen wurde ich - soweit es
die Übung betrifft - informiert.
12. Bezüglich der Gefahrenstoffverordnung gelten Studentinnen als Arbeitnehmerinnen.
Somit stehen besonders werdende und stillende Mütter unter dem Schutz des § 26 der
Gefahrenstoffverordnung. Deswegen sollen Schwangere oder junge Mütter sich zu
Beginn der Übung mit dem/der ÜbungsleiterIn in Verbindung setzen.
Hiermit bestätige ich von den Hinweisen zur mikrobiologischen Übung, insbesondere der
Punkte 9, 10 und 11, Kenntnis genommen und eine Kopie der Übungsanleitung erhalten zu
haben.
Mainz, den: Unterschrift: Übungsteilnehmer/In:________________
2

Sicherheitstechnische Richtlinien
1. Mäntel, Taschen usw. sind im Spind abzulegen.
2. Mitzubringen sind ein Edding 3000 schwarz, Baumwollkittel,
Feuerzeug und ein Vorhängeschloß.
3. Essen, Trinken, Rauchen ist am Arbeitsplatz nicht erlaubt. Das
Mitbringen von Nahrungsmitteln in die Arbeitsräume ist nicht
zugelassen.
4. Das Tragen eines hochgeschlossenen Baumwollkittels mit
langen Ärmeln ist unbedingt erforderlich.
5. Lange Haare müssen hochgebunden werden (Haare dürfen
nicht nach vorne fallen können).
6. Das Tragen von offenen Schuhen ist unzulässig. Das Tragen
von OP-Schuhen und ähnlichen ohne Riemen ist nicht
zugelassen.
7. Das Pipettieren mit dem Mund ist nicht zugelassen.
8. Das Tragen von Kontaktlinsen ist mit dem Augenarzt
abzusprechen.
9. Sollte bei einer Übungsteilnehmerin eine Schwangerschaft
vorliegen, muß dies dem / der ÜbungsleiterIn unbedingt zu
Beginn mitgeteilt werden.
10. Generell müssen alle Mikroorganismen nach Ende des
Versuches abgetötet werden.
11. Alle Substanzen müssen entsprechend ihrer
Zusammensetzung entsorgt werden (Absprache mit den
MitarbeiternInnen).
12. Im Einzelfalle informiert der/die ÜbungsleiterIn am Übungstag
über sicherheitstechnische Maßnahmen.
13. Nach Beendigung der Arbeiten sind die Hände zu waschen.
3

FI, Teil 2b: Identifizierung, Wachstum und Regulation
Stoff zur Vorbereitung und für die Abschlußklausur
• Skript
• Vorlesung zum FI
• Fuchs, Allgemeine Mikrobiologie (Thieme, 8. Auflage, 2007)
S. 169-176; 202-219; 223-226; 500-506; 150-151
oder: entsprechende Kap. Aus ‚Brock, Biology of Microorgansims’
• Lehrbücher der Chemie:
Puffergleichung, Molarität, Konzentration; Lambert-Beersches Gesetz,
Extinlktioskoeffizient
2. Woche: Versuch 5 Wachstum von Escherichia coli mit Glucose oder Acetat
Versuch 6 Induktion der -Galactosidase von Escherichia coli
Versuch 7 Antibiotika
Lösungen und Medien für Versuche Nr. 5 bis 7
Die Lösungen und Medien sind vor Beginn der Versuche Nr. 5 bis 8 anzusetzen. Die
Mengen sind für 11 Gruppen berechnet. Wenn nicht anders angegeben, Lösungen
und Medien durch Autoklavieren sterilisieren. Die genauen Angaben zur
Zusammensetzung der Lösungen und Medien sind bei den einzelnen Versuchen zu
finden!
Bei Versuchen 5 + 6 alle Lösungen auf 11 Gefäße (10 Gruppen + 1 mReserve)!!
1) Lösungen und Medien
Versuch 5 (Wachstum)
11 x 5 ml 0.1 M Na-Acetat
11 x 100 ml H 2 O
11 x 5 ml 10 % AHC
11 x 5 ml 10 mM CaCl 2
11 x 5 ml 1 M MgSO 4
11 x 5 ml 0.1 M Glucose
11 x 25 ml 10 x M9-Salzlösung
Versuche 5 + 6
Versuch 6 (Induktion)
11 x 250 ml H 2 O
11 x 5 ml 0.1 M Lactose (sterilfiltrieren!)
11 x 25 ml Reaktionspuffer -Gal, pH 7,0
(nicht autoklavieren; bei 4°C lagern)
11 x 2,5 ml 0.1 % SDS (unsteril), aus 10 % Stammlösung ansetzen
11 x 25 ml 1 M Na 2 CO 3 (unsteril)
4

Versuch 7 (Antibiotika)
11 x 2 Platten mit dicker LB-Agarschicht à 40 ml (Lochtest)
88 x 12 ml Standard I-Agar in Röhrchen (für 8 x 4 Gradientenplatten)
11 x 2 große Platte Standard I-Agar (1.5%) (25 ml) (Chromatographie)
22 x 25 ml Standard I mit 0.7% Agar in großen Reagenzgläsern
(Chromatographie)
12 x 2 ml 3 % NH 4 Cl in Reagenzgläsern
11 x 10 ml H 2 O in Reagenzgläsern
11 x 2 ml H 2 O in Reagenzgläsern
B) Gefäße (für 8 Gruppen, sterilisieren)
Versuch 5 (Wachstum)
22 x Erlenmeyerkolben mit Alufolie abgedeckt, 100 ml
14 x Meßzylinder 50 ml
sterile Glaspipetten gemischt (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml): alle vorhandenen Glaspipetten
in Blechdosen sterilisieren
Versuch 6 (Induktion)
15 x Meßzylinder (100 ml)
55 x Reagenzgläser
Glaspipetten
Versuch 7 (Antibiotika)
55 x Reagenzgläser
Glaspipetten
80 x Chromatographiestreifen (Schnittmuster beim Assistenten erfragen)
Stichworte zur Vorbereitung der Versuche 5 bis 7 (Theorie)
Allgemeines
- Berechnung Molaritäten, Konzentration, etc.
- Puffergleichung
- Lambert-Beersches Gesetz
- Extinktionskoeffizient
5. Wachstum von Escherichia coli mit Glucose oder Acetat
- Wachstumsgleichung
- Bestimmung , t d
- Zellertrag Y Glucose
5

- OD-Messung
- Stoffwechsel Acetat und Glucose
- Glyoxylatzyklus
- Anaplerotische Reaktionen
- PEP-Carboxylase
- PEP-Carboxykinase
6. Induktion der -Galactosidase
- ’ONPG’-Test (Reaktion, Testbedingungen)
- lac Operon
- Lactosestoffwechsel
- Diauxie
- Glucoserepression bei E. coli
- cyclo AMP, CPR (CAP) Protein
- -Galactosidase
- Lac-Repressor
- Glucose-Phosphotransferasesystem
7. Antibiotika
- Wichtige Antibiotikagruppen
- -Lactamantibiotika
- Resistenzmechanismen
- Angriffspunkte Antibiotika
6

5. Wachstum von Escherichia coli mit Glucose oder Acetat
Bitte zur Vorbereitung Fragen S. 14 beantworten
In dem Experiment wird das aerobe Wachstum von E. coli mit Glucose oder Acetat
als Substrat untersucht. Das Wachstum erfolgt in statischer Kultur (Batchkultur) und
wird anhand der optischen Dichte verfolgt. Aus den beiden Wachstumskurven sollen
verschiedene Wachstumsparameter berechnet werden (Wachstumsrate µ,
Verdopplungszeit t d , Zellertrag Y Glc ), die es ermöglichen das Wachstum auf jedem
der beiden Substrate zu bewerten und miteinander zu vergleichen.
Angewandte Methoden:
1. Trübungsmessung und Bestimmung der optischen Dichte (OD):
Anhand von Trübungsmessungen im Photometer kann das Wachstum einer
Bakterienkultur verfolgt werden. Hierzu wird jeweils 1 ml der wachsenden Kultur
entnommen und in eine Küvette überführt. Im Photometer wird ein Lichtstrahl durch
die Bakterienkultur geschickt, dessen Restintensität nach Durchstrahlen der Kultur
vom Gerät gemessen wird.
Bakterienzellen unterscheiden sich deutlich in ihrem Brechungsindex von dem
umgebenden wässrigen Medium. Wegen der resultierenden Lichtstreuung sieht eine
Bakterienkultur trüb aus. Bis zu einer bestimmten Zelldichte (OD 578 0,5), bei der
sich die Bakterienzellen gegenseitig zu beschatten beginnen, ist die Trübung
proportional der Zellzahl. Die Trübung kann im Photometer wie eine Absorption
gemessen werden. Häufig wird die OD bei 578 nm, 600 nm oder 650 nm gemessen,
weil die meisten Bakterien bei diesen Wellenlängen keine Lichtabsorption besitzen.
Die OD wird gegen Luft als Referenz gemessen. Von diesem Wert wird die OD von
unbewachsenem Medium (=Blindwert) abgezogen.
2. Glucosebestimmung:
Die Bestimmung des Substratverbrauchs während des Wachstums stellt ein
wichtiges Instrument zur Charakterisierung des bakteriellen Stoffwechsels dar. In
diesem Versuch soll der Glucoseverbrauch von E. coli während des aeroben
Wachstums mit Glucose bestimmt werden. Hierzu dient ein enzymatischer Test. Um
den Glucoseverbrauch zu bestimmen, werden zu Anfang der Zucht (t 0 ) und am Ende,
wenn die Bakterien in der stationären Phase sind, Proben von 0,5 ml Kultur
entnommen und abzentrifugiert. Der Überstand kann in den enzymatischen Test
eingesetzt werden und der Glucoseverbrauch kann bestimmt werden. Zusammen mit
den berechneten Parametern aus der Wachstumskurve kann der Zellertrag Y Glc
berechnet werden. Dieser gibt Auskunft darüber wie viel g Zellmasse pro Mol
verbrauchtem Substrat gebildet werden können.
7

Versuchsablauf:
Vor Beginn: Einteilen der Photometer!
1. Ansetzen von M9 Medium (sterile Glaspipetten):
jede Gruppe setzt 50 ml M9 Medium an
Rezept für 1 Liter angegeben, zuerst umrechnen auf 50 ml
alle Reagenzien wurden bereits am Montag angesetzt und autoklaviert
2. Ansetzen der Zuchten E. coli mit Glucose oder Acetat:
Es werden in sterilen Erlenmeyerkolben je eine Zucht mit M9-Medium plus
Glucose und eine Zucht mit M9-Medium plus Acetat angesetzt. Das
Gesamtvolumen jeder Kultur soll 15 ml betragen. Die Endkonzentration an
Glucose bzw. Acetat soll 3 mM sein. Somit muss berechnet werden, wieviel
der jeweiligen Stammlösung (= 0,1 M) im Gesamtvolumen enthalten sein
muss, um auf die erforderlich Endkonzentration zu kommen.
Nach Zugabe von M9-Medium und der C-Quelle (Glucose oder Acetat) wird
der Kolben mit 1 ml Inokulum beimpft. Hierzu werden Vorkulturen (VK) von E.
coli ausgegeben, die über Nacht entweder mit Glucose oder Acetat gezüchtet
wurden. Jeweils die entsprechende VK wird für die Kultur verwendet.
Kulturansätze:
M9-Medium:
Glucose oder Acetat:
Inokulum
gesamt
x ml
x ml (Endkonz. 3 mM)
1 ml
15 ml
3. Beginn der Wachstumskurve:
Unmittelbar nach Ansetzen der Kulturen werden die Proben für die
Wachstumskurve (immer mit sterilen Glaspipetten arbeiten) entnommen.
Wichtig: vor Entnahme Kulturen schwenken, um Inhalt gleichmäßig zu
verteilen.
Von der Glucosezucht werden 1,5 ml steril entnommen. 1 ml davon ist zur
Bestimmung der OD, 0,5 ml davon werden direkt in einem Eppendorf-Cup
abzentrifugiert und der Überstand in ein neues Eppendorf-Cup dekantiert. Der
Überstand wird bis zur Glucosebestimmung eingefroren. Von der Acetatzucht
wird nur 1 ml zur Bestimmung der OD entnommen.
Die Kulturen werden bis zur nächsten Messung bei 37°C unter Schütteln im
Wasserbad inkubiert.
8

4. Messen der Proben:
Für die Wachstumskurve wird von der Glucosezucht alle 30 Minuten 1 ml
Probe entnommen (steril, Glaspipette) und von der Acetatzucht alle 60
Minuten.
Die OD wird sowohl ohne Verdünnung der Kultur und bei einer OD 0,5 nach
geeigneter Verdünnung mit Medium ( OD in der Küvette muss < 0,5 sein!)
bestimmt. In die Wertetabellen sollen die unverdünnten und gegebenenfalls auch
die verdünnten Werte samt Verdünnungsfaktor eingetragen werden.
Im Anschluss an das Ansetzen der Zuchten ist jeweils ein Praktikant pro Gruppe
verantwortlich für die Wachstumskurve, der andere für die Glucosebestimmung (s.
Seite 11).
Material zur Zellzucht:
Stamm:
Vorkulturen:
Zuchtmedium:
E. coli AN387 („Wildtyp“, K-12 Derivat)
Von E. coli AN387 werden frische Vorkulturen (VK)
ausgegeben, die mit Glucose oder Acetat über Nacht
gezüchtet wurden.
M9-Medium
Pro Gruppe werden 50 ml M9 Medium steril in einem
Messzylinder angesetzt.
- 100 ml/l M9 10 x –Salzlösung: Na 2 HPO 4 60 g/l
KH 2 PO 4 30 g/l
NH 4 Cl 10 g/l
NaCl 5 g/l
- 10 ml/l CaCl 2 (10 mM)
- 1 ml/l MgSO 4 (1 M)
- 10 ml/l Säurehydrolysiertes Casein (=AHC, 10%)
nach Zusatz aller Lösungen im Messzylinder auf 50 ml mit sterilem H 2 O auffüllen
und mischen (schwenken)
C-Quelle: D-Glucose (0,1 M)
Na-Acetat pH 7 (0,1 M)
9

Wachstum mit Glucose
Blindwert (nur M9-Medium): OD 578 :
0
min
30
min
60
min
90
min
120
min
150
min
180
min
210
min
240
min
OD 578 unverdünnt
minus BW
OD 578 verdünnt
minus BW
Verdünnungsfaktor
OD 578 Endwert
Wachstum mit Acetat
OD 578 unverdünnt
minus BW
OD 578 verdünnt
minus BW
Verdünnungsfaktor
0 min 60 min 120 min 180 min 240 min
OD 578 Endwert
10

5. Glucosebestimmung mit Glucoseoxidase (GOD) und Peroxidase (POD)
(Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse)
jeweils 1 Praktikant aus jeder Gruppe verantwortlich
Lösungen:
NaP i -Puffer
700 mg Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O
360 mg NaH 2 PO 4 x H 2 O
auf 50 ml auffüllen (davon 500 µl für GOD abzweigen)
Glucoseoxidase (GOD)
Menge reicht für 50 Tests, haltbar bei 4°C
400 Units GOD (aus Schimmelpilz, Grad II) in 500 µl NaP i -Puffer
lösen (Lösung 2-3 Tage stabil bei 4°C)
Glucosereagenz
50 ml NaP i -Puffer
200 Units POD (aus Meerettich, Grad II)
25 mg ABTS, Diammoniumsalz
5 Tropfen Chloroform
Glucosestandard 500 µM Glucose x H 2 O in 500 ml Messkolben ansetzen
die benötigte Glucosemenge muss über das Molekulargewicht
(s. Verpackung) berechnet werden
Testprinzip:
In diesem enzymatischen Test wird die Glucosekonzentration photometrisch
bestimmt. Dabei wird Glucose durch die Glucoseoxidase oxidiert. Das hierbei
gebildete H 2 O 2 oxidiert in der Folgereaktion ABTS. Das oxidierte ABTS ist gefärbt
und absorbiert im Photometer bei 436 nm. Da pro Mol Glucose auch 1 Mol ABTS
oxidiert und somit bestimmbar wird, ist die gemessen Absorption proportional zum
Glucosegehalt der Lösung.
GOD
Glucose + O 2 + H 2 O Gluconat + H 2 O 2
POD
H 2 O 2 + ABTS red ABTS ox + 2 H 2 O
GOD:
POD:
ABTS:
Glucoseoxidase
Peroxidase
2,2’-Azino-di-3-ethylbenzthiazolinsulfonat
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Praktische Durchführung:
Die Glucosebestimmung wird in Eppendorf-Cups durchgeführt.
Pipettierschema:
Start der Reaktion:
1 ml Glucosereagenz
50 µl Probe*
10 µl GOD
mischen und im Wasserbad bei 37°C 30 Minuten inkubieren.
Die Ansätze werden anschließend direkt im Photometer bei 436 nm gegen Luft
immer in derselben Küvette gemessen.
*Probe: entweder 50 µl t 0 oder t end
Glucosestandard-Verdünnung.
der Glucosezucht oder 50 µl einer
Eichgerade:
Zuerst wird eine Eichgerade erstellt mit bekannten Glucosekonzentrationen von
0-500 µM. Diese Eichgerade dient dazu zu zeigen, dass in diesem Bereich die
Glucosekonzentration proportional zu der gemessenen Extinktion bei 436 nm ist.
Mit dem hergestellten Glucosestandard (s. Lösungen S. 11) wird eine
Glucoseverdünnungsreihe erstellt, die anschließend als Probe in den Test eingesetzt
wird (Doppelbestimmung).
Glucosekonzentration 0 µM 100 µM 200 µM 300 µM 400 µM 500µM
µl Glucosestandard
(500 µM)
µl H 2 O
Es wird jeweils 1 ml der entsprechenden Verdünnung (0-500 µM Glucose) angesetzt.
Die Messwerte werden in die Tabelle auf Seite 13 eingetragen.
Aus den erhaltenen Werten werden für alle Konzentrationen Mittelwerte gebildet und
der Blindwert (= 0 µM Glucose) abgezogen. Die Eichgerade soll im Anschluss auf
Millimeterpapier gezeichnet werden.
12

Eichgerade Glucosebestimmung
Gluc.
Konzentration
der
Eichlösung
E 436 (1)
0 µM
(=BW)
100 µM 200 µM 300 µM 400 µM 500 µM
E 436 (2)
Mittelwert
Mittelwert
minus BW
Nach Fertigstellen der Eichgeraden werden die Proben der Glucosezucht gemessen.
Die zentrifugierten Kulturüberstände werden aufgetaut, homogenisiert und bis zur
Verwendung auf Eis gehalten. Für diese Proben muss ein geeigneter
Verdünnungsfaktor überlegt werden. Die zuvor erstellte Eichgerade zeigt, über
welchen Bereich die Glucosekonzentration im Test proportional zur gemessenen
Extinktion ist. Ist die Konzentration zu hoch, kann keine Aussage mehr über den
Glucosegehalt gemacht werden. Die Glucosekonzentration muss also vor
Durchführung des Tests abgeschätzt werden und die Probe entsprechend verdünnt
werden. Die Verdünnungen werden mit H 2 0 hergestellt. Zur Kontrolle wird die
Konzentration einer unbekannten Probe bestimmt, welche zuvor 1:10 und 1:20
verdünnt wird. Alle Proben werden jeweils in Doppelbestimmung gemessen.
Bestimmung des Glucosegehalts
Anfang der Zucht Ende der Zucht Unbekannt Proben
Verdünnung unverdünnt unverdünnt 1:10 1:20
E 436 (1)
E 436 (2)
Mittelwert
minus BW
Glucosegehalt
Bei Berechnung des Glucosegehalts muss der Verdünnungsfaktor berücksichtigt
werden.
13

Fragen (Zur Vorbereitung VOR dem Versuch als Hausaufgabe bearbeiten!) :
Bitte lesen Sie das Skript zum Versuch aufmerksam durch und versuchen Sie dann,
folgende Fragen zu beantworten (Evtl. Lehrbücher zu Rate ziehen).
1) Zum Wachstum :
Welche Stoffwechselwege spielen beim Wachstum mit Glucose eine wichtige
Rolle für die Energiekonservierung von E.coli?
Braucht E.coli beim Wachstum mit Acetat noch zusätzliche Stoffwechselwege?
Wenn ja, welche? Wofür?
Was würden Sie erwarten, mit welchem der beiden Substrate E. coli die höhere
Wachstumsrate µ hat? Warum ?
2) Zur Glucosebestimmung :
Wie hoch ist die Glucosekonzentration der Batch-Kultur zum Startzeitpunkt (in
mM)?
Wie hoch ist die maximale Glucosekonzentration einer unbekannten Lösung, die
wir mit unserer Eichgerade messen können (in mM)?
Was ist also ein sinnvoller Verdünnungsfaktor für die Messung der
Glucosekonzentration am Startzeitpunkt der Kultur?
Warum soll man die Glucosekonzentration am Anfang und am Ende messen? Für
welche Berechnungen benötigt man den Glucoseverbrauch? Siehe Auswertung!
Protokoll:
Einleitung (1 – 2 Seiten)
- Stoffwechselwege unter beiden Bedingungen (Wachstum auf Glucose und
Acetat, welche Stoffwechselwege werden benötigt?)
- Was machen wir in dem Versuch (Batchkulturen von E.coli mit Glucose bzw.
Acetat, Messung der optischen Dichte, Erklärung der Wachstumsparameter µ, t d
und Y, was ist bezüglich der Parameter als Ergebnis zu erwarten, wenn man die
beiden Zuchten vergleicht)?
- Beschattungseffekt der Zellen
Material und Methoden siehe Skript
Ergebnisse
- Tabellen für die Wachstumskurven (Glucose und Acetat getrennt) mit Blindwert,
Zeit, unverdünnten und verdünnten Messergebnissen, Verdünnungsfaktor und
den berechneten Endwerten
- Wachstumskurve für Glucose jeweils verdünnt/unverdünnt in ein lineares
Diagramm auftragen (beide Kurven in ein Diagramm)
- Wachstumskurve für Glucose jeweils verdünnt/unverdünnt in ein
halblogarithmisches Diagramm
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- Berechnung von µ und t d für Glucose
µ = ln xt – ln xt0 / t-t 0
t d = ln 2/ µ
- Wachstumskurve für Acetat jeweils verdünnt/unverdünnt in ein lineares Diagramm
auftragen
- Wachstumskurve für Acetat jeweils verdünnt/unverdünnt in ein
halblogarithmisches Diagramm
- Berechnung von µ und t d für Acetat
- Wertetabelle für Glucose-Eichgerade
- Grafik: Eichgerade der Glucosebestimmung mit Geradengleichung und R 2 -Wert
- Tabelle: Berechnung von Epsilon ABTS ox über Lambert-Beer’sches Gesetz mit allen
5 Konz. der Eichgerade (Verdünnung der Glucose in der Küvette
berücksichtigen), Durchschnittswert angeben.
- Wertetabelle mit E 436 -Messwerten und berechneten Glucosekonzentrationen
(mM):
-Standard 500 µM (für die Berechnung der anderen Konzentrationen verwenden)
-t 0 unverdünnt und 1:10 (Welcher berechnete Wert ist realistischer und warum?)
-t end
-unbek. Probe 1:10 und 1:20 (Welcher Wert ist realistischer und warum?)
Rechenbeispiel für Glucosekonzentration angeben
- Berechnung von Y Glucose anhand OD 578 – Zunahme und Glucoseverbrauch
- Abschätzung von Y Acetat , d.h. Berechnung unter der Annahme, dass Acetat (3
mM) vollständig verbraucht wird.
Wieviel Zellmasse wird pro Mol Glucose gebildet? Zur Umrechnung von OD 578 in
Zellmasse verwenden Sie den Wert von 300 mg Trockengewicht / L
Kulturvolumen bei OD 578 = 1.
Berechnen Sie die molaren Ertragskoeffizienten Y Glc (Y Glc = g Trockenzellen/ mol
Glucose).
Diskussion (1/2 bis 2 Seiten)
Ergebnisse besprechen:
- Vergleich von allen Wachstumskurven und Parametern.
- Entsprechen die Ergebnisse den Erwartungen aus der Einleitung und Theorie ?
Erklärung! Wenn nein, was könnte der Grund dafür sein?
15

6. Induktion der -Galactosidase von Escherichia coli
Das Dissacharid Lactose kann erst nach Spaltung in die Hexoseabbauwege
eingeschleust und umgesetzt werden:
Lactose + H 2 O
-Galactosidase
D-Glucose + D-Galactose
Das Lactose-(lac)-Operon von E. coli trägt die Information zur Synthese der Enzyme
des Lactosestoffwechsels. Es umfasst den lac-Promotor, den lac-Operator und die
Strukturgene für die -Galactosidase (lacZ), die Lactosepermease (lacY) und die
Transacetylase (lacA). Die Expression der Strukturgene wird sehr genau reguliert. In
Lactose-freiem Nährmedium bilden die Bakterien nur sehr wenige Moleküle der
Lactose-verwertenden Enzyme. In einem Nährmedium, das Lactose als einzige
Energiequelle enthält, kann die Konzentration der Enzyme um den Faktor 1000
zunehmen.
Das lac-Operon unterliegt einer negativen und einer positiven Transkriptionskontrolle.
Die negative Regulation wird durch den Lac-Repressor bewirkt. Der Repressor
verhindert in Abwesenheit von Lactose die Transkription. Die positive Kontrolle wird
durch das Genaktivatorprotein CRP (= cycloAMP Rezeptor Protein) (CAP =
Synonym) ausgeübt. Bei Fehlen von Glucose bildet die Zelle cycloAMP als
"Hungersignal". Unter diesen Bedingungen aktiviert der CRP•cAMP Komplex die
Transkription.
In dem Praktikumsversuch wird die -Galactosidase-Aktivität von E. coli-Zellen
bestimmt, die unter induzierenden und unter nicht induzierenden Bedingungen
gezüchtet wurden. Dazu werden die Zellen in Minimalmedium gezüchtet, das als C-
Quelle entweder nur Glucose, nur Lactose oder Glucose und Lactose enthält. Wenn
die Kulturen eine OD 578 von 0,5 - 0,7 erreicht haben, kann die Aktivität der -
Galactosidase der drei verschiedenen Zuchtansätze in einem enzymatischen Test
bestimmt werden.
Das Enzym ist nicht nur in der Lage, Lactose zu hydrolysieren, es hydrolysiert
allgemein Substrate, die -1,4-verknüpfte Galactose-Moleküle enthalten. Daher kann
zur Bestimmung der -Galactosidase-Aktivität als Substrat ortho-Nitrophenyl--Dgalactopyranosid
(ONPG) verwendet werden. Die -Galactosidase spaltet ONPG in
Galactose und o-Nitrophenol, dessen Extinktion bei 420nm gemessen werden kann.
Um die -Galactosidaseaktivität hinreichend genau zu bestimmen, müssen
mindestens 3 Messungen und 1 Blindwert pro Kultur durchgeführt werden. Die
Aktivität des Enzyms wird in permeabilisierten Zellen bestimmt. Die Membranen der
Bakterien werden dabei durch geringe Mengen Detergenz (SDS = Sodiumdodecylsulfat)
und Lösungsmittel (Chloroform) für die Enzymsubstrate durchlässig
gemacht, ohne dass die -Galactosidase geschädigt wird.
.
16

I. Zucht der Bakterien unter induzierenden und nicht induzierenden
Bedingungen
Stamm:
E. coli AN387 („Wildtyp“, K12-Derivat)
Vorkulturen: Von E. coli AN387 werden frische Vorkulturen (VK) ausgegeben, die mit
folgenden C-Quellen gezüchtet wurden: Glucose, Lactose, Glucose und
Lactose
Zuchtmedium:
1. Medium: Pro Gruppe 100 ml Medium in einem sterilen 100 ml Messzylinder steril
aus folgenden Zusätzen ansetzen:
- 10 x M9-Salzlösung 10 ml
- 10 mM CaCl 2 1ml
- 1 M MgSO 4 0,1 ml
- 10 % säurehydrolysiertes Casein 1 ml
- mit sterilem Wasser auf 100 ml auffüllen
Nach Zusatz aller Lösungen mischen!
2. C-Quellen:
Lösungen getrennt ansetzen und autoklavieren:
- D-Glucose (0.1 M)
- Lactose (0.1 M) (sterilfiltrieren !)
3. Zuchtansätze:
In 3 vorbereitete sterile Reagenzgläser werden folgende Lösungen pipettiert:
Ansatz Medium C-Quelle Vorkultur
A
B
5 ml
Medium
5 ml
Medium
+ 0,3 ml Gluc
(0,1 M)
C 5ml Medium + 0,3 ml Gluc
(0,1 M)
+ 0,3 ml Lac
( 0,1 M)
+ 0,3 ml Lac
( 0,1 M)
+ 0,15 ml VK Gluc
+ 0,15 ml VK Lac
+ 0,15 ml VK Gluc/Lac
- Anschließende Inkubation der Hauptkulturen für etwa 1,5 h bei 37°C auf dem
Schüttler.
17

- nach 1,5 h Wachstum: Zuchtansätze in ein vorbereitete Eisbad stecken
- Bestimmung der optischen Dichte von allen drei Kulturen (0,8 ml) sowie des M9-
Medium für den Blindwert bei 578nm (Doppelbestimmungen!)
- Für die Durchführung des -Galactosidase-Tests sollte die OD 578 der Kulturen
nach Abzug des Blindwerts zwischen 0,5 – 0,8 liegen.
- Für die Messung der optischen Dichte müssen Kulturen ab einer OD 578 > 0,5 so
mit Medium verdünnt werden, dass die OD 578 wieder unter 0,5 liegt. Später muss
über den Verdünnungsfaktor die endgültige optische Dichte berechnet werden.
- In den anschließenden -Galactosidase-Test werden dann die unverdünnten
Kulturen eingesetzt.
Wichtig: Für den -Galactosidase-Test von jeder Kultur 1 ml in ein
Eppendorfgefäß füllen, gut beschriften und auf Eis halten!!!
Tabelle zum Eintragen: Bestimmung der optischen Dichte bei 578nm nach 1,5 h Wachstum bei 37°C
Kultur
A) Glucose
OD 578
unverdünnt
OD 578
verdünnt
Verdünnungsfaktor
Blindwert OD578
B) Lactose
C) Glucose/Lactose
II. -Galactosidase-Bestimmung mit ONPG (o-Nitrophenylgalactosid)
Lösungen:
- Reaktionspuffer (nicht autoklavieren, Lagerung bei 4°C): 0,1M KP i pH 7,0
10 mM KCl
1 mM MgCl 2
am Versuchstag pro Gruppe benötigtes Volumen (+ Reserve) des
Reaktionspuffers für alle Testansätze berechnen, Puffer entnehmen und mit 2,7
ml/l 2-Mercaptoethanol versetzen (im Abzug!)
Reaktionspuffer + Mercaptoethanol = -Gal-Puffer
18

enötigte Substanzen:
- 0,1% SDS aus 10% Stammlösung
- Chloroform (Abzug!)
- ONPG-Lösung (4 mg/ml in H 2 0, am Versuchstag frisch ansetzen)
- 1M Na 2 CO 3
Vorgehensweise:
Der Test wird in kurzen Reagenzgläsern durchgeführt, pro Kultur 4
Parallelbestimmungen (3 x mit Kultur, 1 x mit Medium für den Blindwert). Für alle
Testansätze kann der -Gal-Puffer (Reaktionspuffer mit 2-Mercaptoethanol), SDS
und Chloroform in die kurzen Reagenzgläser vorgelegt werden (siehe Durchführung).
Achtung: noch keine Bakterienkultur hinzugeben!!
WICHTIG:
Der Enzymtest wird zunächst nur mit der Lactosekultur durchgeführt! Erst wenn die
Lactose-Messreihe abgeschlossen ist, wird der Test mit der Glucose- und der
Glucose-/Lactosekultur parallel begonnen.
Durchführung:
- 0,8 ml -Gal-Puffer (im Abzug vorlegen)
- + 3 Tropfen Chloroform (mit Pasteurpipette im Abzug pipettieren!)
- + 2 Tropfen 0,1% SDS (Pasteurpipette)
bis hier für alle Ansätze vorbereiten
Dann den -Galactosidase-Test starten (erst mit Lactosekultur):
- + 0,2 ml Kultur (wichtig: unverdünnt aus vorbereitetem Eppi entnehmen!!!) bzw.
0,2 ml M9-Medium (Blindwert)
- 10 Sekunden mischen (vortexen)!!!!
- 5 min bei Raumtemperatur inkubieren
- Start der Reaktion durch Zugabe von 0,2 ml ONPG, gleichzeitig Zeitnahme
starten, Ansatz kurz vortexen
- die nächsten Proben im Abstand von 15 sec starten, Reihenfolge beachten!!!
- Inkubation bei RT bis eine deutlich sichtbare gelbe Farbe zu sehen ist.
- Stopp durch Zugabe von 0,5 ml Na 2 CO 3 (wieder 15 sec Abstand und Reihenfolge
einhalten! Zeit notieren!)
- kurz vortexen, ins Eisbad stellen
- in Eppendorfcups kippen und 5 min zentrifugieren
- den Überstand in eine Glasküvette pipettieren (ca. 0,8 ml, nicht kippen) und die
Extinktion der Proben (Testansatz mit Kultur bzw. Testansatz mit Medium =
Blindprobe) bei 420nm messen.
19

Tabelle zum Eintragen: Bestimmung der Extinktion bei 420 nm und Inkubationsdauer der Testansätze
Kultur E 420 Zeit [min]
1 2 3 BW E 420
Lactose
Glucose/Lactose
Glucose
Berechnung der-Galactosidaseaktivität in Miller-Units :
Für die Bestimmung der spezifischen Aktivität müssen folgende Werte bestimmt
werden:
- die OD 578 der Kultur, die in den Test eingesetzt wird und die OD 578 des M9-
Medium
- die Inkubationsdauer des Testansatzes vom Start durch ONPG-Zugabe bis zum
Stopp durch die Natriumcarbonatzugabe (in ganzen Minuten)
- Die E 420 des Testansatzes mit Kultur und die E 420 eines identisch behandelten
Blindwertansatzes mit Medium
Aktivität (Miller-Units) =
1000 x (E 420 Probe – E 420 Blindwert )
Zeit [min] x V Probe [ml] x (OD 578 Probe – OD 578 Medium )
V Probe : Kulturvolumen (ml), das in den Test eingesetzt wurde.
E 420 Probe : Extinktion des Probenansatzes bei 420 nm
E 420 Bw : Extinktion des identisch behandelten Blindwertansatzes
20

Fragen:
1. Welche Aktivität der -Galactosidase von E. coli (niedrig - mittel – hoch) erwarten
Sie bei Zucht auf folgenden Substraten:
- Lactose
- Glucose:
- Glycerin
- Lactose plus Glucose
- Lactose plus Glycerin:
2. Formulieren Sie die Reaktionsgleichung (mit Strukturformeln), die zur Messung
der -Galactosidase im optischen Test verwendet wird.
3. Erklären Sie die Bedeutung folgender Zusätze im -Galactosidasetest:
- Chloroform
- SDS
- Na 2 CO 3
Protokoll:
Einleitung:
- Aufbau des lac-Operons
- positive und negative Regulation
- Diauxie
- Phosphotransferasesystem
- Versuchsziel
Material und Methode:
- siehe Skript
Ergebnisse:
- Tabellarische Darstellung aller gemessenen Werte
- Miller-Units für alle Messreihen berechnen und in einer Tabelle zusammenfassen
(Miller-Units runden)
- Eine Bespielrechnung angeben
Diskussion:
- Für alle drei getesteten Wachstumsbedingungen den Zustand am Promotor
beschreiben.
- Was für Aktivitäten hat man unter den jeweiligen Bedingungen erwartet? Stimmen
die Erwartungen mit den Ergebnissen überein? Falls nicht, wieso?
21

7. Chromatographie von Penicillin-G-Natrium-Salz
Antibiotika sind von lebenden Organismen gebildete Wirkstoffe, die das Wachstum
von Mikroorganismen hemmen (Bakteriostatika) oder sie abtöten (Bakterizide). Sie
wirken in geringen Konzentrationen.
Zur Feststellung des Wirkungsspektrums von Antibiotika können eine Reihe von
Tests durchgeführt werden, so der Strich-, Loch-, Zylinder- oder Blättchentest. Mit
diesen Tests kann die Kulturflüssigkeit eines antibiotikumbildenden Stammes oder
reine Antibiotikumlösung untersucht werden. Wird das Wachstum eines Keims
gehemmt oder verhindert, entsteht um den Wirkstoff ein Hof (s. Kurs I). In der Praxis
spielt die Empfindlichkeit eines Bakteriums auf den Wirkstoff eine bedeutende Rolle.
Dies wird in der Hemmstoffverdünnungsreihe getestet (s. Kurs I). Die o. a. genannten
Methoden können quantitativ und qualitativ durchgeführt werden. Da die gängigen
Methoden bereits durchgeführt wurden, soll hier eine Methode zur Charakterisierung
von Antibiotika angewendet werden.
Zur Charakterisierung einer Substanz gehört unter anderem die Feststellung seiner
Löslichkeit. Das Löslichkeitsverhalten gibt Hinweise auf die Möglichkeit einer
Abtrennung der Substanz aus der Nährlösung des Produzenten.
In einem Lösungsmittel sind die Teilchen entweder als Ion oder ungeladen als
Molekül enthalten. Bei den Molekülen gibt es 2 Grenzfälle:
a) polare Moleküle, in denen die Elektronen ungleichmäßig verteilt sind, so daß sie
einen Dipol bilden.
b) apolare Moleküle, die eine gleichmäßige Elektronenverteilung aufweisen. Von den
Lösungsmitteln ist Wasser polar. Bei Verbindungen, die polare und apolare
Gruppen in unterschiedlichem Verhältnis aufweisen, gibt es alle Übergänge bis
zum völlig apolaren Lösungsmittel. Die Löslichkeit ist abhängig von der Polarität
des Lösungsmittels und des zu lösenden Stoffes.
Bei der Chromatographie ist die Wanderungsstrecke einer Substanz von deren
Löslichkeit im Lösungsmittel und der stationären Phase abhängig. (Die Adsorption
wird bei dieser Betrachtung vernachlässigt.) In Lösungsmitteln unterschiedlicher
Polarität soll die Wanderungsgeschwindigkeit von Penicillin durch Chromatographie
auf Papierstreifen bestimmt werden. Es sollen folgende Lösungsmittel verwendet
werden: Wasser, 3 % NH 4 Cl, Aceton, Ethylacetat und Trichlormethan. Das
Lösungsverhalten von Penicillin-G-Na-Salz soll untersucht werden. Der Nachweis
des Antibiotikums erfolgt durch Auflegen der Chromatogramme auf Doppelschicht-
Testplatten, die mit Staphylococcus carnosus beimpft sind. Die Lage des
Hemmhofes ist abhängig von der Löslichkeit des Penicillins im Lösungsmittel. Je
geringer die Löslichkeit, desto weniger weit wandert das Penicillin.
Durchführung
1. Auf der Startlinie des Chromatographiestreifens 2 l einer 170 E/ml (entspricht 10 -
1 -Verdünnung vom Versuch “Gradientenplatte”) enthaltenden Penicillinlösung mit
Hilfe einer 10 µl Pipette auftragen und trocknen lassen.
22

2. Chromatographiestreifen in beschriftete und 2 ml Lösungsmittel enthaltende
Reagenzgläser hängen (Startlinie unten) und mit Stopfen verschließen.
Gruppe 1: Gruppe 2:
Wasser Wasser
3% NH 4 CI Methanol
Aceton Ethylacetat
Trichlormethan Trichlormethan
Zunehmend apolar Zunehmend
3. Weichagar verflüssigen, auf 50°C abkühlen (25 ml)
4. Mit 2 ml einer 24 Stunden alten Staphylococcenkultur beimpfen und gleichmäßig
über die Grundschicht auf der Petrischale mit Nähragar verteilen, fest werden
lassen.
5. Auf der Plattenunterseite beschriften (Laufmittel) und Strich ziehen, um
Chromatogramme auf eine Startlinie zu legen.
6. Chromatographiestreifen entnehmen, auf Alufolie legen, trocknen (an der
Flamme!).
7. Die Streifen an den Enden so zurechtschneiden, daß sie auf die Platte passen.
Die gut getrockneten Chromatogramme werden vorsichtig mittels abgeflammter
Pinzette auf die beschriftete Platte gelegt (genügend Abstand derselben beachten)
(je 2 Streifen auf eine Platte).
8. Die Platte wird 24 Std. bei 37°C bebrütet.
Auswertung:
Es wird graphisch dargestellt, wo sich die Mittelpunkte der Hemmhöfe befinden.
Berechnung der R f -Werte (R f -Wert = Laufstrecke Hemmhofmitte / Laufmittelfront).
23

Skizze der Platten mit Chromatographiestreifen und Lage der Hemmhöfe (bitte eintragen):
R f -Wert:
Laufstrecke Hemmhofmitte: = mm
Laufmittelfront = mm
R f -Wert =
R f -Wert:
Laufstrecke Hemmhofmitte: = mm
Laufmittelfront = mm
R f -Wert =
R f -Wert:
Laufstrecke Hemmhofmitte: = mm
Laufmittelfront = mm
R f -Wert =
R f -Wert:
Laufstrecke Hemmhofmitte: = mm
Laufmittelfront = mm
R f -Wert =
24

Medien und Reagenzien:
Standard I (Fertigpräparat der Fa. MERCK) mit 1,5 % Agar für Grundschicht und
0,7 % für Weichagar
Penicillin-G-Na-Salz 1700 E/ml (~ 1 mg/ml)
Lösungsmittel
Wasser
3 % NH 4 Cl
Aceton
Methanol
Essigsäureethylester = Ethylacetat
Trichlormethan = Chloroform
Chromatographiepapierstreifen: 0,6 cm breit, 19 cm lang; Start 5 cm vom Rand,
Frontlinie
8 cm vom Rand entfernt.
Große Petrischale ( 14 cm)
Organismus: 24 Stundenkultur von Staphylococcus carnosus.
Antibiotika-Test
Die Beobachtung von Hemmhöfen in einem Bakterienrasen um Kolonien von
Antibiotikabildner wird im Screening-Verfahren benutzt, um Antibiotikabildner zu
isolieren. Durch Variation der Methode können auch Wirkungsspektren von
Antibiotika ermittelt und Aussagen über die Wirkung gegen Teststämme gemacht
werden.
1. Der Lochtest: Zur Bestimmung der Wirkung eines Antibiotikums auf verschiedene
Mikroorganismen eignet sich der Lochtest. In der Mitte einer Nähragarplatte wird
ein Loch ausgestanzt, in das Antibiotikumlösung pipettiert wird. Die zu testenden
Organismen werden radial strichförmig aufgetragen, s. Abb.
Anstelle der Antibiotikumlösung kann ein antibiotikumbildender Organismus in der
Mitte der Nähragarplatte geimpft werden. Erst nach Wachstum der Kolonie des
Antibiotikumbildners werden die zu prüfenden Organismen aufgetragen. (wird nicht
durchgeführt)
25

Durchführung
1) Plattenunterseite beschriften:
E. coli, Staphylococcus carnosus, Micrococcus luteus, Pseudomonas stutzeri
2) Loch mit Korkbohrer 1 cm aus Agarschicht stanzen, mit Impföse herausstechen
3) Testkeime entsprechend der Abbildung ausstreichen
4) In Loch a) 1 Tropfen steriles Wasser pipettieren, Kontrollplatte
b) 1 Tropfen Penicillinlösung pipettieren (1700 E/ml)
5) Plattenoberseite beschriften: Name, Datum, Kontrollplatte bzw. Versuchsplatte.
6) Beide Petrischalen werden 24 Std. bei 37°C bebrütet.
Auswertung
Je näher die Organismen zum Antibiotikum wachsen, desto geringer ist dessen Wirksamkeit.
Mit dem Test kann auf einer Platte die Wirkung eines Antibiotikums auf
mehrere Organismen geprüft werden.
__________________________________________________________
Abstand (Wachstum) in mm vom Zentrum
a) Wasser b) Penicillin
__________________________________________________________
E. coli
S. carnosus
M. luteus
Ps. stutzeri
__________________________________________________________
2. Gradientenplatte:
Die Verwendung dieses Tests beschränkt sich auf die Überprüfung isolierter
Antibiotika und betrifft immer nur ein Antibiotikum in verschiedenen
Konzentrationen gegenüber einem Testorganismus. Ursprünglich wurde dieser
Test zur Mutantenauslese verwendet. Heute wird durch Auflegen eines mit einem
zweiten Antibiotikum getränkten Papierstreifen die synergistische Wirkung von
Antibiotika ermittelt. In eine schräggestellte Petrischale wird Nähragar ohne
Antibiotikum gegossen. Nach Erstarren der Agarschicht wird die Platte waagerecht
gestellt und eine zweite antibiotikumhaltige Nähragarschicht darüber gegossen.
Auf der einen Seite ist praktisch nur Nähragar, auf der anderen Seite Nähragar mit
Antibiotikum, s. Abb.
Nähragar
Nähragar mit Antibiotikum
26

Durchführung
1) Petrischale schräg stellen (Pipette oder ähnliches), 12 ml verflüssigten Standard I
Agar ausgießen, Agarschicht fest werden lassen.
2) Antibiotikumsverdünnungsreihe herstellen:
Die Konzentration in der Ausgangslösung beträgt 1 mg/ml (= 1700 E / ml). Aus der
Verdünnungsstufe 10 -1 soll eine weitere Verdünnung auf 10 -2 erfolgen.
3) Petrischale waagerecht stellen, von der höchsten Verdünnungsstufe ausgehend
dem verflüssigten Agar 0,1 ml Penicillinlösung bzw. für die Kontrolle 0,1 ml
Wasser zugeben, ausgießen, Agarschicht erstarren lassen.
4) 0,1 ml Staphylococcenkultur mit Glaspipette herausnehmen und ausplattieren.
5) Petrischale beschriften
6) Platten 24 Std. bei 37°C bebrüten.
Auswertung:
Je nach Ausmaß des Bakterienrasens oder der Häufigkeit vereinzelter Kolonien
können Rückschlüsse auf die Wirksamkeit des Antibiotikums bzw. die Häufigkeit
resistenter Keime gezogen werden.
Skizzieren Sie die Wachstumszonen für die Platten mit den verschiedenen
Antibiotikakonzentrationen (Antibiotikagradienten einzeichnen !)
Penicillin:
0 E / ml 17 E / ml 170 E / ml 1700 E / ml
Stoffgradient
steigende Konz.
27