Tierärztliche Hochschule Hannover Einfluss unterschiedlicher ...

3.3 mRNA-Analyse der Oozyten zur Darstellung qualitätsanzeigender Gentranskripte
3.3.3 Quantitative Polymerase Kettenreaktion (qPCR)
Die in Tabelle 3.4 aufgelisteten Gene wurden in der RT-qPCR auf die Intensität ihrer mRNA-
Expression hin untersucht. Die Selektion der Primer erfolgte mit Hilfe der Software Primer3
unter Vorgabe der Amplifikatgröße (150-250 bp), des GC-Gehaltes (40-60 %) und der Annealingtemperatur
(59,5-60,5 ◦ C). Die Quantifizierung der Gentranskripte fand in der RT-qPCR
durch die Sichtbarmachung der Fragmente mittels Fluoreszenzen statt. Die eingesetzten Embryonenäquivalente
variieren je nach untersuchtem Gentranskript, wobei ein Embryonenäquivalent
20 µl des Reaktionsansatzes entspricht (siehe Tabelle 3.3).
Das Endvolumen für die PCR betrug 20 µl. Dabei bestand jeder Ansatz aus dem kommerziell
erhältlichen Reaktionsmix, den jeweilig benötigten 5´- und 3´-Primern für die zu untersuchenden
Transkripte sowie der cDNA aus der RT und sterilem Wasser (Ampuwa, Fa. Fresenius, Bad
Homburg).
Für alle Ansätze erfolgte zunächst eine 10minütige Denaturierung bei 95 ◦ C. Danach fanden
43 Zyklen mit folgendem Aufbau statt [vgl. auch HANSTEDT (2009), KUZMANY et al. (2011),
BEILBY et al. (2011), STINSHOF et al. (2012)]:
- Spaltung der cDNA für 15 Sekunden bei 95 ◦ C (Denaturierung)
- Anlagerung der Primer für 30 Sekunden bei 60 ◦ C (Annealing)
- Extension für 30 Sekunden bei 72 ◦ C (Verlängerung)
Anschließend wurde eine Schmelzkurve zur Verifikation der PCR-Fragmente durch eine schrittweise
Erhöhung um 0,5 ◦ C alle zehn Sekunden erstellt. Die Starttemperatur betrug hierbei 55 ◦ C
und die Endtemperatur 95 ◦ C. Die Verifizierung der Größe der spezifischen Fragmente wurde
mittels Agarosegelelektrophorese in einem 2 %igen Agarosegel in TBE-Puffer (90 mM Tris,
90 mM Borsäure, 2 mM EDTA, pH=8,3), welches mit 2 µl Ethidiumbromid gefärbt war, durchgeführt.
Die Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte für 4 min bei 100 Volt und anschließende
35 min bei 80 Volt.
Tabelle 3.3: Eingesetzte Oozyten- bzw. Embryonenäquivalente (EÄ; 1 EÄ ˆ= 20 µl des
Reaktionsansatzes) für die jeweiligen Gentranskripte
Gen EÄ
GDF9 0,05
BMP15 0,0125
HIF2α 0,05
SLC2A1 (GLUT1) 0,1
PGR 0,1
PGRMC1 0,025
PGRMC2 0,025
PAQR5 0,05
Globin 0,05
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