Tierärztliche Hochschule Hannover Einfluss unterschiedlicher ...

3 Material und Methoden
3.3 mRNA-Analyse der Oozyten zur Darstellung qualitätsanzeigender
Gentranskripte
3.3.1 Aufbereitung der Proben zur Isolierung der mRNA
Zur Analyse der Transkripte aus den einzelnen Eizellen wurde der Dynabeads mRNA DIRECT
Micro Kit (Fa. Invitrogen, Karlsruhe) verwendet. Zuerst erfolgte ein Prewash der Dynabeads-
Lösung mit entsprechender Separation von Flüssigkeit und Dybnabeads im Magnetic Particle
Concentrator (MPC). Jeder zu analysierenden Eizelle wurden 150 µl des Lysis/Binding-Puffers
sowie 1 µl Kaninchen-Globin-mRNA (1 pg/µl ) zugegeben. Die Kaninchen-Globin-mRNA
dient als externer Standard. Die Proben wurden nun für 10 Sekunden gevortext, zentrifugiert
und 10 Min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden jeder
Probe 10 µl der vorher gewaschenen, in Lysis/Binding-Puffer befindlichen Dynabeads zugegeben
und erneut für 5 Min bei Raumtemperatur auf einem Thermoblock unter leichtem Schütteln
inkubiert. Während dieser Zeitspanne erfolgte die Bindung des PolyA-Endes der mRNA an die
Dynabeads. Als nächstes wurden die Proben erneut im MPC separiert, und nach Verwerfen des
Überstandes ausserhalb der MPC mit 100 µl Washing- Buffer A (Dynabeads mRNA Micro Kit,
Fa. Invitrogen, Karlsruhe) resuspendiert. Nach einer erneuten Separation und Entfernung des
Überstandes wurde mit 100 µl Washing-Buffer B resuspensiert und dieser Vorgang ein weiteres
Mal durchgeführt. Nach einem letzten Separationsvorgang wurde mit 11 µl sterilem H 2 O
(Ampuwa, Fa. Fresenius, Bad Homburg) resuspensiert. Die Trennung der mRNA von den Dynabeads
erfolgte in einem Thermomixer (Fa. Eppendorf, Hamburg) bei 65 ◦ C für 3 Min. Im
Anschluss wurden die Proben auf Eis in den MPC verbracht. Nach Abnahme des Überstandes
erfolgte sofort die Reverse Transkriptase Reaktion.
3.3.2 Reverse Transkription (RT)
Für die Reaktion der Reversen Transkriptase wurde ein Endvolumen von 20 µl verwendet.
Es wurden ein Globinstandard, eine Negativ-Kontrolle des Standards, eine Negativ-Kontrolle
der Probe, die Probe selbst sowie eine Negativ-Kontrolle mit sterilem Wasser (Ampuwa, Fa.
Fresenius, Bad Homburg) anstelle von mRNA mitgeführt, um Kontaminationen der Reaktionsansätze
ausschließen zu können. Der Master-Mix (MM) wurde für alle Proben gemeinsam
angesetzt (Zusammensetzung siehe Anhang A.33). Diesem wurden 11 µl mRNA aus der vorhergehenden
mRNA-Isolierung zugegeben, die Negativkontrollen wurden mit sterilem Wasser
(Ampuwa, Fa. Fresenius, Bad Homburg) auf dieses Volumen aufgefüllt. Im PCR-Cycler (IQ
Multicolor Real-Time PCR Detection System, Fa. Bio-Rad, München) wurde daraufhin die in
den Proben vorhandene mRNA in cDNA umgewandelt. Dabei fand zunächst eine 10minütige
Inkubation bei 25 ◦ C statt. Dann erfolgte die Reverse Transkription der mRNA in cDNA bei
42 ◦ C für 60 Min. Zur Denaturierung verblieben die Proben dann noch 5 Min bei 99 ◦ C, um
danach sofort bis zur Polymerase-Kettenreaktion auf Eis verbracht zu werden.
40