Tierärztliche Hochschule Hannover Einfluss unterschiedlicher ...

3.2 In-vitro-Produktion boviner Embryonen
3.2.7 In-vitro-Kultur (IVC)
Die vermeintlichen Zygoten wurden 19 h nach Beginn der Fertilisation in eine Petrischale mit
35 mm Durchmesser mit 2 ml auf 37 ◦ C erwärmten TCM air verbracht und die Kumuluszellen
mittels eines Strippers (The Stripper, MXL3-STR, Mid Atlantic Diagnostics, Inc.) und einer
Stripper-Spitze (Stripper Tip, Mid Atlantic Diagnostics, Inc.) mit einem Durchlass von 135 bzw.
125 µm mechanisch unter stereomikroskopischer Sichtkontrolle bei 20facher Vergrößerung entfernt.
Zur Temperaturerhaltung des Mediums wurde auf einer Wärmebank (Modell HAT 200,
Fa. Minitüb GmbH, Tiefenbach) bei einer Temperatur von 37 ◦ C gearbeitet. Die von den Kumuluszellen
vollständig befreiten Zygoten wurden nach drei Medienausdünnungsschritten in
Gruppen à sechs Stück in 30 µl Tropfen SOFaa-Kulturmedium unter Öl (Fa. Serva, Heidelberg)
bei 39 ◦ C, 5 % CO 2 , 5 % O 2 , 90 % N 2 und feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre für insgesamt
sieben Tage (= 8 Entwicklungstage) kultiviert.
3.2.8 Beurteilung der Embryonen
An Tag 7 und 8 (IVF = Tag 0, Beginn der IVC = Tag 1) erfolgten die Kontrollen hinsichtlich der
Teilungs- und Entwicklungsrate. Die Teilungsrate bezeichnet den Anteil (in %) der gefurchten
Embryonen an den in die In-vitro-Kultur eingebrachten vermeintlichen Zygoten, die Entwicklungsrate
ergibt sich dementsprechend aus dem Anteil (in %) der Embryonen im Morula- oder
Blastozystenstadium an den in die Kultur eingesetzten vermeintlichen Zygoten.
Abbildung 3.8: a: 8-Zell-Embryo, b: Morula, c: expandierte Blastozysten, d: geschlüpfte
Blastozysten
3.2.9 Archivierung von gereiften Oozyten für die mRNA-Analyse
Jeweils 3-5 Oozyten der einzelnen Gruppen der IVP-Durchgänge wurden vor dem Umsetzen in
das Fertilisationsmedium entnommen und in eine Petrischale (35 mm Durchmesser) mit vorgewärmtem
TCM air verbracht. Diese KOK wurden dann unter dem Stereomikroskop auf einer
Wärmeplatte mechanisch mit Hilfe eines Strippers denudiert, dreimal in PVA 0,1 % gewaschen
und einzeln in 0,5 ml nicht-DNA-bindenden Eppendorf-Cups bei -80 ◦ C eingefroren.
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