Tierärztliche Hochschule Hannover Einfluss unterschiedlicher ...

3 Material und Methoden
Progesterongehalte in die Gruppen < 50 ng/ml, 150 ng/ml, 300 ng/ml und 450 ng/ml, entsprechend
0,16 µM, 0,48 µM, 0,95 µM und 1,43 µM.
3.2.5 Reifungskontrolle
An einer repräsentativen Anzahl an KOK fand eine Kontrolle der Reifung nach der IVM statt.
Nach Verbringen der KOK auf einen Objektträger mit vorsichtig angedrücktem Deckgläschen
erfolgte eine Fixierung in Essiglösung (Fixierlösung) für 24 h. Danach wurde die Färbelösung
(Lacmoid-Arbeitslösung) eingebracht und nach 10 Min mit Fixierlösung wieder entfernt. Die
Beurteilung des Kernreifestadiums erfolgte unter dem Mikroskop (Zeiss, Axiostar plus, Carl
Zeiss, Jena) bei 40facher Vergrößerung unter Einsatz eines Phasenkontrastfilters 2. Oozyten,
welche das Meiosestadium II (MII), erkennbar an Metaphasenplatte und ausgeschleustem Polkörperchen
erreicht hatten, galten als gereift, solche, die in der Meiosephase I (MI) verblieben
waren, galten als unreif.
3.2.6 In-vitro-Fertilisation (IVF)
Die gereiften KOK wurden dreimal in 100 µl Waschdrops aus FertTALP-Gebrauchslösung gewaschen
und anschließend in Gruppen von 15-20 KOK in die Fertilisationstropfen pipettiert.
In einer Petrischale mit dem Durchmesser von 35 mm waren jeweils vier Tropfen von 100 µl
aufgebracht und mit Silikonöl überschichtet. Die Fertilisationstropfen waren zur Äquilibrierung
mindestens eine Stunde vor dem Umsetzen der KOK bei 39 ◦ C und 5 % CO 2 in den Brutschrank
verbracht worden. Das Tiergefriersperma eines IVF-gestesteten Bullen wurde für die Fertilisation
zunächst 10 Sekunden lang in 30 ◦ C warmem Wasser aufgetaut. Direkt nach dem Auftauen
erfolgte eine Überprüfung der Motilität der Spermien und danach die Zentrifugation für 16 Min
bei 380 x g in einer Zentrifuge (Mini Spin plus, Fa. Eppendorf, Hamburg) mit einem 90 %igen
Gradienten aus Sperm Filter R○ (Gynemed GmbH und Co., Lensahn) und FertTALP-Lösung in
einem Eppendorfgefäß. Der Überstand wurde nach Ende der Zentrifugation bis auf 50 µl abgenommen
und verworfen. Das im Eppendorfgefäß verbliebene Pellet wurde in 750 µl FertTALP-
Gebrauchslösung resuspendiert und erneut für 3 Min bei 380 x g zentrifugiert. Daraufhin wurde
der Überstand wieder bis auf 50 µl abgesogen und verworfen. Eine erneute Resuspendierung
erfolgte mit 750 µl HHE-Lösung. Abschließend wurden die Spermien nochmals bei 380 x g
zentrifugiert. Der Überstand wurde nun bis auf 100 µl abgenommen und die Spermatozoen im
offenen Eppendorfgefäß im Brutschrank bei 39 ◦ C und 5 % CO 2 und feuchtigkeitsgesättigter
Atmosphäre aufbewahrt. Schließlich wurde die Dichte der Spermiensuspension mittels einer
Thomakammer ermittelt. Anhand der Dichte wurde die erforderliche Menge der Spermalösung
errechnet, um pro Fertilisationsdrop mit 20 KOK 100 000 Spermien zuzugeben. Der Zusatz der
Spermien erfolgte 24 h nach Maturationsbeginn direkt in die Fertilisationstropfen mit den KOK.
Es folgte eine 19stündige Kokultur von Spermien und KOK in einem Brutschrank (HeraCell,
Fa. Heraeus, Thermo Fisher Scientific, USA) mit 39 ◦ C und 5 % CO 2 in feuchtigkeitsgesättigter
Atmosphäre.
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