Tierärztliche Hochschule Hannover Einfluss unterschiedlicher ...

3.2 In-vitro-Produktion boviner Embryonen
3.2.3 In-vitro-Maturation (IVM)
Zunächst wurde eine 40 µM Progesteronstocklösung aus Progesterone minimum 99 % (Fa.
Sigma) und unvergälltem Ethanol (EtOH; Rotipuran ≥ 99,8 %, Fa. Carl Roth GmbH + Co.
KG, Karlsruhe) hergestellt und aliquotiert. Dem Reifungsmedium des jeweiligen Versuchsdurchlaufes
wurde die Progesteronlösung zugesetzt, sodass die Endkonzentrationen im Reifungsmedium,
in Anlehnung an DIELEMAN et al. (1983), 0,16 µM, 0,48 µM, 0,95 µM oder
1,4 µM betrugen. Um während der In-vitro-Reifung der Oozyten den Einfluss verschiedener
Progesteronkonzentrationen zu ermitteln, erfolgte eine Modifizierung des konventionellen Invitro-Maturationssystems
mit Ölüberschichtung. Ein Diffundieren des lipophilen Progesterons
in die Ölphase wurde verhindert, indem einzelne, mit 200 µl Reifungsmedium gefüllte Wells
einer 96-Well-Plate (Fa. Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen) ohne Ölüberschichtung Anwendung
fanden. Je zwei Wells standen in einer Petrischale. Die Petrischale enthielt ca. 10 ml
destilliertes Wasser, um Verdunstungsverluste gering zu halten. Der aufgelegte Deckel der Petrischale
diente der Vermeidung von Schmutzeinträgen in die Kultur.
Die Kontrollwells enthielten Reifungsmedium ohne jeglichen Zusatz (Normalkontrolle) sowie
Reifungsmedium mit 2 µl, 4 µl oder 8 µl unvergälltem Ethanol ≥ 99,8 % (Alkoholkontrolle).
Die Medien wurden für mindestens eine Stunde im Brutschrank (HeraCell, Fa. Heraeus,
Thermo Fisher Scientific, USA) bei 39 ◦ C und 5 % CO 2 und gesättigter Feuchtigkeit äquilibriert.
Als IVP-tauglich angesehene KOK wurden in Gruppen zu 30-40 KOK durch je eine Reihe mit
3 Tropfen aus 100 µl Reifungsmedium ohne Zusatz, die mit Siliconöl (Fa. Serva, Deutschland)
überschichtet waren (sogenannte „Waschdrops“), pipettiert (nachfolgend "waschen"genannt)
und in die Gefäße mit dem Reifungsmedium überführt. Die Maturation erfolgte für 24 h bei
39 ◦ C, 5 % CO 2 und feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre im Brutschrank. Der Zeitraum von
der Entnahme der Ovarien am Schlachthof bis zum Beginn der In-vitro-Reifung betrug maximal
6 h.
3.2.4 Progesteronbestimmung im Reifungsmedium und Einteilung der
Versuchsgruppen
Zur Kontrolle der eingesetzten Progesteronzugaben zum Reifungsmedium wurde das Medium
nach der Entnahme der gereiften KOK zunächst in 0,5 ml fassenden Reaktionsgefäßen (Fa. Eppendorf,
Hamburg) bei -20 ◦ C asserviert. Die Bestimmung des Progesterongehaltes im Medium
erfolgte wie bei den Blutproben (siehe Kapitel 3.1.4) mittels Radioimmunoassay. Da jedoch die
zugegebenen Progesteronmengen den Messbereich des Assays überschritten, war eine Verdünnung
der Proben (1:5, 1:10, 1:20) mit Boratpuffer erforderlich. Um etwaige Veränderungen des
Progesterongehaltes im Medium durch die KOK oder das Milieu im Brutschrank zu detektieren,
wurden auch Medienansätze ohne KOK (Leerkontrollen) in den Brutschrank verbracht,
dort für 24 Stunden inkubiert und dann asserviert. Zusätzlich fand auch eine Analyse von reinem,
nicht inkubiertem Reifungsmedium statt, um Kontaminationen der Medienkomponenten
mit Progesteron auszuschließen. Die endgültige Einteilung der einzelnen IVP-Durchgänge in
die Versuchsgruppen erfolgte anhand der im Medienansatz und den Leerkontrollen gemessenen
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