Tierärztliche Hochschule Hannover Einfluss unterschiedlicher ...
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3 Material und Methoden KOK aus Schlachthofovarien Selektion nach morpholog. Kriterien IVM +/-Progesteron RT-qPCR IVM-Medium gereifte KOK Denudierung P4-Analyse IVF Reifungskontrolle IVC Morulae/Blastozysten an Tag 7 und 8 Beurteilung der Teilungs-und Entwicklungsraten Abbildung 3.7: Schematische Darstellung des IVP-Versuchsteils dem bereits in der Petrischale enthaltenen PBS Complete durch ein herkömmliches Sieb in ein Becherglas, um überschüssige Gewebestücke zu entfernen. Die Petrischale und das Sieb werden noch zweimal mit je ca. 50 ml PBS Complete gespült, um noch eventuell in der Petrischale vorhandene KOK zu erhalten. Dann erfolgt eine 10minütige Sedimentation der Flüssigkeit im Becherglas. Um ein Auskühlen der Flüssigkeit zu verhindern bzw. zu verlangsamen, steht das Becherglas auf Styropor. Nach dem Absaugen des Flüssigkeitsüberstandes bis auf ca. 100 ml mit einer herkömmlichen Vakuumpumpe erfolgt eine gleichmäßige Verteilung des Sediments auf Falconröhrchen (Fa. Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen) mit je 15 ml Fassungsvermögen und eine erneute 10minütige Sedimentation auf einer Wärmeplatte mit einer Temperatur von 37 ◦ C. Das Sediment in jedem Reagenzgefäß wird nun mittels einer Pasteurpipette abgesaugt, in eine Petrischale überführt und auf ca. 80 ml mit PBS Complete aufgefüllt. Das Heraussuchen der KOK aus dem verdünnten Sediment erfolgt unter einem Stereomikroskop (Fa. Olympus, Hamburg, Deutschland) mit Wärmeplatte (Fa. Minitüb, Modell HAT 200) bei 20facher Vergrößerung. Nach Durchsicht aller Reagenzgefäße und Überführung der KOK mit Hilfe einer 0,25 µl fassenden Glaspipette und eines Pipettierhelfers in 2 ml TCM air erfolgte die Selektion der KOK bezüglich ihrer Qualität. Eine Übersicht der Klassifizierungskriterien ist in Tabelle 3.1 zu sehen. Als für die In-vitro-Produktion taugliche KOK wurden solche der Kategorien 1, 2 und 3 angesehen. 36
3.2 In-vitro-Produktion boviner Embryonen 3.2.3 In-vitro-Maturation (IVM) Zunächst wurde eine 40 µM Progesteronstocklösung aus Progesterone minimum 99 % (Fa. Sigma) und unvergälltem Ethanol (EtOH; Rotipuran ≥ 99,8 %, Fa. Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe) hergestellt und aliquotiert. Dem Reifungsmedium des jeweiligen Versuchsdurchlaufes wurde die Progesteronlösung zugesetzt, sodass die Endkonzentrationen im Reifungsmedium, in Anlehnung an DIELEMAN et al. (1983), 0,16 µM, 0,48 µM, 0,95 µM oder 1,4 µM betrugen. Um während der In-vitro-Reifung der Oozyten den Einfluss verschiedener Progesteronkonzentrationen zu ermitteln, erfolgte eine Modifizierung des konventionellen Invitro-Maturationssystems mit Ölüberschichtung. Ein Diffundieren des lipophilen Progesterons in die Ölphase wurde verhindert, indem einzelne, mit 200 µl Reifungsmedium gefüllte Wells einer 96-Well-Plate (Fa. Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen) ohne Ölüberschichtung Anwendung fanden. Je zwei Wells standen in einer Petrischale. Die Petrischale enthielt ca. 10 ml destilliertes Wasser, um Verdunstungsverluste gering zu halten. Der aufgelegte Deckel der Petrischale diente der Vermeidung von Schmutzeinträgen in die Kultur. Die Kontrollwells enthielten Reifungsmedium ohne jeglichen Zusatz (Normalkontrolle) sowie Reifungsmedium mit 2 µl, 4 µl oder 8 µl unvergälltem Ethanol ≥ 99,8 % (Alkoholkontrolle). Die Medien wurden für mindestens eine Stunde im Brutschrank (HeraCell, Fa. Heraeus, Thermo Fisher Scientific, USA) bei 39 ◦ C und 5 % CO 2 und gesättigter Feuchtigkeit äquilibriert. Als IVP-tauglich angesehene KOK wurden in Gruppen zu 30-40 KOK durch je eine Reihe mit 3 Tropfen aus 100 µl Reifungsmedium ohne Zusatz, die mit Siliconöl (Fa. Serva, Deutschland) überschichtet waren (sogenannte „Waschdrops“), pipettiert (nachfolgend "waschen"genannt) und in die Gefäße mit dem Reifungsmedium überführt. Die Maturation erfolgte für 24 h bei 39 ◦ C, 5 % CO 2 und feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre im Brutschrank. Der Zeitraum von der Entnahme der Ovarien am Schlachthof bis zum Beginn der In-vitro-Reifung betrug maximal 6 h. 3.2.4 Progesteronbestimmung im Reifungsmedium und Einteilung der Versuchsgruppen Zur Kontrolle der eingesetzten Progesteronzugaben zum Reifungsmedium wurde das Medium nach der Entnahme der gereiften KOK zunächst in 0,5 ml fassenden Reaktionsgefäßen (Fa. Eppendorf, Hamburg) bei -20 ◦ C asserviert. Die Bestimmung des Progesterongehaltes im Medium erfolgte wie bei den Blutproben (siehe Kapitel 3.1.4) mittels Radioimmunoassay. Da jedoch die zugegebenen Progesteronmengen den Messbereich des Assays überschritten, war eine Verdünnung der Proben (1:5, 1:10, 1:20) mit Boratpuffer erforderlich. Um etwaige Veränderungen des Progesterongehaltes im Medium durch die KOK oder das Milieu im Brutschrank zu detektieren, wurden auch Medienansätze ohne KOK (Leerkontrollen) in den Brutschrank verbracht, dort für 24 Stunden inkubiert und dann asserviert. Zusätzlich fand auch eine Analyse von reinem, nicht inkubiertem Reifungsmedium statt, um Kontaminationen der Medienkomponenten mit Progesteron auszuschließen. Die endgültige Einteilung der einzelnen IVP-Durchgänge in die Versuchsgruppen erfolgte anhand der im Medienansatz und den Leerkontrollen gemessenen 37
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3 Material und Methoden<br />
KOK aus Schlachthofovarien<br />
Selektion nach morpholog. Kriterien<br />
IVM +/-Progesteron<br />
RT-qPCR<br />
IVM-Medium<br />
gereifte KOK<br />
Denudierung<br />
P4-Analyse<br />
IVF<br />
Reifungskontrolle<br />
IVC<br />
Morulae/Blastozysten an Tag 7 und 8<br />
Beurteilung der Teilungs-und Entwicklungsraten<br />
Abbildung 3.7: Schematische Darstellung des IVP-Versuchsteils<br />
dem bereits in der Petrischale enthaltenen PBS Complete durch ein herkömmliches Sieb in ein<br />
Becherglas, um überschüssige Gewebestücke zu entfernen. Die Petrischale und das Sieb werden<br />
noch zweimal mit je ca. 50 ml PBS Complete gespült, um noch eventuell in der Petrischale<br />
vorhandene KOK zu erhalten. Dann erfolgt eine 10minütige Sedimentation der Flüssigkeit im<br />
Becherglas. Um ein Auskühlen der Flüssigkeit zu verhindern bzw. zu verlangsamen, steht das<br />
Becherglas auf Styropor. Nach dem Absaugen des Flüssigkeitsüberstandes bis auf ca. 100 ml<br />
mit einer herkömmlichen Vakuumpumpe erfolgt eine gleichmäßige Verteilung des Sediments<br />
auf Falconröhrchen (Fa. Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen) mit je 15 ml Fassungsvermögen<br />
und eine erneute 10minütige Sedimentation auf einer Wärmeplatte mit einer Temperatur<br />
von 37 ◦ C. Das Sediment in jedem Reagenzgefäß wird nun mittels einer Pasteurpipette abgesaugt,<br />
in eine Petrischale überführt und auf ca. 80 ml mit PBS Complete aufgefüllt. Das<br />
Heraussuchen der KOK aus dem verdünnten Sediment erfolgt unter einem Stereomikroskop<br />
(Fa. Olympus, Hamburg, Deutschland) mit Wärmeplatte (Fa. Minitüb, Modell HAT 200) bei<br />
20facher Vergrößerung.<br />
Nach Durchsicht aller Reagenzgefäße und Überführung der KOK mit Hilfe einer 0,25 µl<br />
fassenden Glaspipette und eines Pipettierhelfers in 2 ml TCM air erfolgte die Selektion der<br />
KOK bezüglich ihrer Qualität. Eine Übersicht der Klassifizierungskriterien ist in Tabelle 3.1 zu<br />
sehen. Als für die In-vitro-Produktion taugliche KOK wurden solche der Kategorien 1, 2 und 3<br />
angesehen.<br />
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