Tierärztliche Hochschule Hannover Einfluss unterschiedlicher ...
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3 Material und Methoden 1 ml Serum bzw. EDTA-Plasma wurde in 2 ml fassenden Reaktionsgefäßen (Fa. Eppendorf, Hamburg) bei -20 ◦ C asserviert. 3.1.4 Bestimmung der Progesteronkonzentration im Blut Die Bestimmung des Serumprogesterongehaltes erfolgte mittels Radioimmunoassay (RIA Progesteron PITKPG-9, Fa. Siemens Healthcare Diagnostics GmbH, Eschborn). Das Prinzip des Verfahrens beruht auf der kompetitiven Bindung des P4 in der zu analysierenden Probe und einer mit 125 I radioaktiv markierten Variante von P4 an spezifische Antikörper, die an die Wandung eines Reaktionsgefäßes aufgebracht waren (Festphasen-Immunoassay). Die Menge des P4 in der Probe lässt sich anhand der Verdrängung des radioaktiven P4 mit Hilfe eines Gamma- Counts ermitteln, wobei die Anzahl der gemessenen Counts umgekehrt proportional zur eingesetzten Konzentration ist. Durch den Vergleich mit den eingesetzten Standards kann dann die Progesteronkonzentration der Proben aus der Standardkurve ermittelt werden. Zuerst wurden die asservierten Serumproben bei Raumtemperatur aufgetaut. Die Messung erfolgte routinemäßig als Doppelbestimmung. Für die Messung wurde eine Standardreihe mit 0, 0,1, 0,5, 2, 10, 20 und 40 ng/ml Progesteron angelegt und je 100 µl der Standards sowie 100 µl der zu analysierenden Proben in Antikörper-beschichtete Röhrchen pipettiert. Nach Zugabe von 1,0 ml des radioaktiv markierten Progesterons ( 125 I Progesteron) in jedes Röhrchen erfolgte eine 3stündige Inkubation bei Raumtemperatur (15-28 ◦ C). Anschließend wurde die Flüssigkeit in den Röhrchen dekantiert und die Röhrchen für eine Minute zur Messung in den Gamma-Counter (LKB 1272 Clinigamma, Fa. Perkin-Elmer, Monza, Italien) verbracht. Anhand der gemessenen Counts pro Minute (cpm) der Standardreihe erfolgte die Erstellung einer Standardkurve und die Berechnung der Progesteronkonzentration der Proben anhand dieser Kurve. Der Interassayvariationskoeffizient betrug 3,9 % und der Intraassayvariationskoeffizient 3,5 %. Die Spezifität des Antikörpers für Progesteron wurde vom Hersteller mit 100 % angegeben. Die vom Hersteller angegebenen Kreuzreaktivitäten des Antikörpers sind in Tabelle 3.2 aufgeführt. 34
3.2 In-vitro-Produktion boviner Embryonen Tabelle 3.2: Kreuzreaktivität des im RIA genutzten Antikörpers Substrat Kreuzreaktivität in % Kortikosterone 0,9 Kortisol 0,03 Danazol 0,006 11-Deoxykortikosteron 2,2 11-Deoxycortisol 0,01 DHEA-SO 4 0,002 20alpha-Dihydroprogesteron 0,2 17alpha-Hydroxyprogesteron 3,4 Medroxyprogesteron 0,3 5beta-Pregnen-3alphaol-20-one 0,05 5alpha-Pregnan-3,20-dione 9,0 5beta-Pregnan-3,20-dione 3,2 Pregnenolon 0,1 5-Pregnen-3beta-ol-20-one-sulfat 0,05 Testosteron 0,1 3.2 In-vitro-Produktion boviner Embryonen Der in Abbildung 3.7 dargestellte Arbeitsablauf wird im Folgenden ausführlich erläutert. 3.2.1 Herkunft der Ovarien Einmal wöchentlich wurden Ovarien frisch geschlachteter Tiere an einem Schlachthof gesammelt, wobei Ovarien von Tieren, deren Schlachtkörper sichtbare krankhafte Veränderungen aufwiesen, ausschieden. Weiterhin beschränkte sich die Auswahl auf Ovarien von Tieren, die weder trächtig noch juvenil waren und an deren Ovarien keine zystischen Veränderungen sichtbar waren. Die Lagerung der Ovarien nach dem Abschneiden bis zur weiteren Bearbeitung erfolgte in 37 ◦ C warmem PBS Complete in einem Thermobehälter. 3.2.2 Vorbereitung und Selektion der Kumulus-Oozyten-Komplexe Zuerst fand eine dreimalige Spülung der Ovarien mit je 350 ml Natrium-Chlorid (NaCl)-Komplett-Lösung, die zuvor im Wasserbad auf 37 ◦ C erwärmt worden war, statt. Zur Isolation der Oozyten aus den Ovarien fand die Slicing-Methode (NIEMANN und MEINECKE 1993) Anwendung. Hierbei wird das mit einer Arterienklemme fixierte Ovar in eine Petrischale mit ca. 100 ml PBS Complete getaucht. Das Schneiden erfolgt dann mit einem Block bestehend aus zehn parallel im Abstand von 3-5 mm zueinander befestigten Rasierklingen. Auf diese Weise werden oberflächliche und tiefe Follikel eröffnet und die KOK zusammen mit der Follikelflüssigkeit herausgespült. Anschließend giesst man die so gewonnene Flüssigkeit gemeinsam mit 35
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3 Material und Methoden<br />
1 ml Serum bzw. EDTA-Plasma wurde in 2 ml fassenden Reaktionsgefäßen (Fa. Eppendorf,<br />
Hamburg) bei -20 ◦ C asserviert.<br />
3.1.4 Bestimmung der Progesteronkonzentration im Blut<br />
Die Bestimmung des Serumprogesterongehaltes erfolgte mittels Radioimmunoassay (RIA Progesteron<br />
PITKPG-9, Fa. Siemens Healthcare Diagnostics GmbH, Eschborn). Das Prinzip des<br />
Verfahrens beruht auf der kompetitiven Bindung des P4 in der zu analysierenden Probe und<br />
einer mit 125 I radioaktiv markierten Variante von P4 an spezifische Antikörper, die an die Wandung<br />
eines Reaktionsgefäßes aufgebracht waren (Festphasen-Immunoassay). Die Menge des<br />
P4 in der Probe lässt sich anhand der Verdrängung des radioaktiven P4 mit Hilfe eines Gamma-<br />
Counts ermitteln, wobei die Anzahl der gemessenen Counts umgekehrt proportional zur eingesetzten<br />
Konzentration ist. Durch den Vergleich mit den eingesetzten Standards kann dann die<br />
Progesteronkonzentration der Proben aus der Standardkurve ermittelt werden.<br />
Zuerst wurden die asservierten Serumproben bei Raumtemperatur aufgetaut. Die Messung<br />
erfolgte routinemäßig als Doppelbestimmung. Für die Messung wurde eine Standardreihe mit<br />
0, 0,1, 0,5, 2, 10, 20 und 40 ng/ml Progesteron angelegt und je 100 µl der Standards sowie<br />
100 µl der zu analysierenden Proben in Antikörper-beschichtete Röhrchen pipettiert. Nach Zugabe<br />
von 1,0 ml des radioaktiv markierten Progesterons ( 125 I Progesteron) in jedes Röhrchen<br />
erfolgte eine 3stündige Inkubation bei Raumtemperatur (15-28 ◦ C). Anschließend wurde die<br />
Flüssigkeit in den Röhrchen dekantiert und die Röhrchen für eine Minute zur Messung in den<br />
Gamma-Counter (LKB 1272 Clinigamma, Fa. Perkin-Elmer, Monza, Italien) verbracht. Anhand<br />
der gemessenen Counts pro Minute (cpm) der Standardreihe erfolgte die Erstellung einer Standardkurve<br />
und die Berechnung der Progesteronkonzentration der Proben anhand dieser Kurve.<br />
Der Interassayvariationskoeffizient betrug 3,9 % und der Intraassayvariationskoeffizient 3,5 %.<br />
Die Spezifität des Antikörpers für Progesteron wurde vom Hersteller mit 100 % angegeben. Die<br />
vom Hersteller angegebenen Kreuzreaktivitäten des Antikörpers sind in Tabelle 3.2 aufgeführt.<br />
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