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3 Material und Methoden Abbildung 3.3: OPU-Sondenträger mit Nadelführung sowie Vergrößerung des vorderen Teiles; Abbildung nach HANSTEDT (2009) Abbildung 3.4: Schematische Darstellung der Follikelpunktion; Abbildung nach HANSTEDT (2009) Nach erneuter Überführung der KOKs mit Hilfe einer 0,25 µl Glaspipette (Fa. Hirschmann, Eberstadt) und eines Pipettierhelfers (Fa. Brand, Wertheim) in eine 2 ml TCM air enthaltende Petrischale der Größe 35 x 10 mm (Fa. Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen) fand eine Beurteilung der KOK hinsichtlich ihrer Qualität sowie eine Einteilung in 5 Kategorien (siehe Tabelle 3.1) statt. Tabelle 3.1: Klassifizierungsschema für bovine KOK Klasse Mindestanzahl an Kumulus- Zytoplasma Kumuluszelllagen beschaffenheit 1 3 Lagen keine Expansion homogen 2 1 Lage keine Expansion homogen 3 einzelne Zellen keine Expansion homo-/heterogen 4 keine Zellen keine Expansion homo-/heterogen 5 keine/einzelne Zellen expandiert homo-/heterogen leere Zonae deformiert 32
3.1 Ovum Pick-Up (OPU) Abbildung 3.5: Apparatur zur Separation von KOK aus Follikelpunktaten; Abbildung nach HANSTEDT (2009) Abbildung 3.6: IVP-taugliche bovine Kumulus-Oozyten-Komplexe, 50fache Vergrößerung Kumulus-Oozyten-Komplexe der Kategorien 1-3 wurden tierindividuell in auf 37 ◦ C temperierte PBS Complete-Lösung mit Zusatz von 0,1 % Hyaluronidase (Sigma-Aldrich, H 3506) und 0,1 % Bovinem Serum Albumin (BSA-FAF, Sigma-Aldrich) gegeben und für 5 Min. inkubiert. Darauf folgte eine mechanische Entfernung der Kumuluszellen mittels eines Strippers (The Stripper, MXL3-STR, Mid Atlantic Diagnostics, Inc., Mount Laurel, USA) und einer Stripper- Spitze (Stripper Tip, Mid Atlantic Diagnostics, Inc., Mount Laurel, USA) mit einem Durchlass von 135 bzw. 125 µm. Nach dreimaligem Pipettieren durch Polyvinylalkohol (PVA 0,1 %) wurden die denudierten Oozyten einzeln in 0,5 ml fassende, nicht-DNA-bindende Reaktionsgefäße (Fa. Eppendorf, Hamburg) verbracht und bei -80 ◦ C eingefroren. 3.1.3 Blutentnahme und Konservierung der Blutproben Nach jeder OPU-Sitzung wurde den Tieren je ein Serumröhrchen (Fa. Sarstedt, Sarstedt) sowie ein EDTA-Röhrchen (Fa. Sarstedt, Sarstedt) Blut entnommen. Die Entnahme erfolgte aus der Vena bzw. Arteria coccygea mittels einer handelsüblichen Einmalkanüle der Größe 18 G x 1,5 “. Die Blutproben wurden innerhalb von 2 h bei 2000 x g und 4 ◦ C für 15 Min zentrifugiert (Hettich Zentrifuge Universal 30RF, Fa. Andreas Hettich GmbH u. Co. KG, Tuttlingen). Je 33
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Abbildungen 2.1 Schematische Darste
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Tabellen 2.1 Untersuchungen zu vers
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