Tierärztliche Hochschule Hannover Einfluss unterschiedlicher ...
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3 Material und Methoden Abbildung 3.1: Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs der OPU-Versuche 3.1.2 Gewinnung von Kumulus-Oozyten-Komplexen im OPU-Verfahren Das Equipment für das OPU bestand aus einem Ultraschallgerät, einem Sondenträger mit Nadelführung, einer Vakuumpumpe mit angeschlossenem Schlauchsystem mit Auffanggefäß sowie einem Wasserbad (Abbildung 3.2). Die ultraschallgeleitete Follikelpunktion wurde mit Hilfe eines Ultraschallgerätes der Marke GE Logiq Book XP und einer 7,5 MHz-Konvexsonde (Modell 8C-RS, Fa. GE, München) durchgeführt. Die Einstellungen des GE Ultraschallgerätes finden sich im Anhang. Der Sondenträger aus PVC wurde durch die Feinmechanik-Werkstatt des Institutes für Nutztiergenetik des Friedrich-Löffler-Institutes in Mariensee in Zusammenarbeit mit der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover gebaut. Dabei war die Ultraschallsonde in leicht geneigtem Winkel zur Nadelführung eingebettet, um den toten Winkel der Sonde im Bereich der Punktionslinie zu minimieren. Oberhalb der Sonde befand sich eine Führungsrinne für das Edelstahlrohr, welches die Nadelführung bildet. An dessen einem Ende war ein einschraubbarer Adapter angebracht, an dem die Punktionsnadel sowie am anderen Ende ein Schlauch zum Abführen des Punktates befestigt wurden. Der ableitende Schlauch aus Polyethylen mit einem Innendurchmesser von 0,6 mm mündete nach Durchtritt durch einen Silikonstopfen in einem 50 ml Röhrchen (Fa. Greiner Bio-One, Frickenhausen), welches als Auffanggefäß fungierte und in einem Wasserbad mit einer Temperatur von 39 ◦ C warm gehalten wurde. Zum Abführen des Punktates wurde mittels einer über ein Fußpedal bedienten Pumpe (Fa. Cook, Mönchengladbach) ein Vakuum von -75 mmHg generiert und über einen handelsüblichen PVC-Schlauch (Aussendurchmesser 8 mm, Innendurchmesser 5 mm) zugeführt. Der Durchfluss betrug durchschnittlich ca. 22 ml pro Minute. Zur Punktion wurden handelsübliche Einmalkanülen der Firma Braun aus Melsungen der Größe 20 G x 2“ (0,9 mm x 50 mm) und einem kurzen Anschliff verwendet. Der kurze Anschliff sollte hierbei 30
3.1 Ovum Pick-Up (OPU) Abbildung 3.2: OPU-Equipment: (1) Vakuumpumpe, (2) Ultraschallgerät, (3) Sondenträger; Wasserbad, Schlauchsystem und Auffanggefäß nicht abgebildet; Abbildung nach HANSTEDT (2009) gewährleisten, dass die Öffnung der Kanüle vollständig auch in kleineren Follikeln verborgen ist, um Druck- und Flüssigkeitsverluste beim Absaugen zu verhindern. Zu Beginn jeder OPU-Sitzung wurde der Punktionsschlauch mehrfach intensiv mit ca. 10 ml PBS Complete gespült, um eine Verunreinigung des Punktates mit Rückständen von Reinigungsmitteln auszuschliessen. Ein erneutes Spülen nach dem Anbringen der Punktionsnadel sollte gewährleisten, dass sich der kapillare Spalt zwischen Nadel und Schlauchadapter schloss. Weitere Spülungen des Schlauchsystems erfolgten jeweils nach dem Absaugen aller Follikel eines Ovars bzw. nach Bedarf. Nach Applikation von 4 ml des Lokalanästhetikums Procainhydrochlorid ohne Sperrkörper (Procasel 2 % der Fa. Selectavet, Weyarn-Holzolling) in den epiduralen Spalt zwischen dem letzten Sakral- und dem ersten Schwanzwirbel wurde die Vulva trocken gereinigt und das Punktionsgerät vaginal eingeführt. Auf die rektale Exploration folgte eine transrektale Positionierung des jeweiligen Ovars vor der Ultraschallsonde, um das Ovar und seine Funktionskörper darzustellen. Die Größe der Follikel sowie Lokalisation (linkes oder rechtes Ovar), Größe und Beschaffenheit (Homogenität, Vorhandensein eines Hohlraumes und dessen Größe) des Gelbkörpers wurden ermittelt und protokolliert. Ein Absaugen des Inhaltes der Follikel ab einer Größe von 3 mm folgte. Das gewonnene, im Wasserbad bei 39 ◦ C warmgehaltene Punktat wurde zunächst mit Hilfe von warmer PBS Complete-Lösung durch ein Analysensieb mit einer Maschenweite von 50 µm gespült. Es erfolgte eine Überführung der auf dem Sieb verbliebenen KOKs und Zellbestandteile mittels PBS Complete in eine Petrischale der Größe 94 x 16 mm (Fa. Greiner Bio-One, Frickenhausen) um die KOKs unter einem Stereomikroskop (Fa. Olympus, Hamburg, Modell SZX-ILLK200) mit Wärmeplatte (Fa. Minitüb, Modell HAT 200) in einer 20fachen Vergrößerung herauszusuchen. 31
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3 Material und Methoden<br />
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3.1.2 Gewinnung von Kumulus-Oozyten-Komplexen im OPU-Verfahren<br />
Das Equipment für das OPU bestand aus einem Ultraschallgerät, einem Sondenträger mit Nadelführung,<br />
einer Vakuumpumpe mit angeschlossenem Schlauchsystem mit Auffanggefäß sowie<br />
einem Wasserbad (Abbildung 3.2). Die ultraschallgeleitete Follikelpunktion wurde mit Hilfe<br />
eines Ultraschallgerätes der Marke GE Logiq Book XP und einer 7,5 MHz-Konvexsonde<br />
(Modell 8C-RS, Fa. GE, München) durchgeführt. Die Einstellungen des GE Ultraschallgerätes<br />
finden sich im Anhang. Der Sondenträger aus PVC wurde durch die Feinmechanik-Werkstatt<br />
des Institutes für Nutztiergenetik des Friedrich-Löffler-Institutes in Mariensee in Zusammenarbeit<br />
mit der Klinik für Rinder der Stiftung <strong>Tierärztliche</strong> <strong>Hochschule</strong> <strong>Hannover</strong> gebaut. Dabei<br />
war die Ultraschallsonde in leicht geneigtem Winkel zur Nadelführung eingebettet, um den toten<br />
Winkel der Sonde im Bereich der Punktionslinie zu minimieren. Oberhalb der Sonde befand<br />
sich eine Führungsrinne für das Edelstahlrohr, welches die Nadelführung bildet. An dessen einem<br />
Ende war ein einschraubbarer Adapter angebracht, an dem die Punktionsnadel sowie am<br />
anderen Ende ein Schlauch zum Abführen des Punktates befestigt wurden.<br />
Der ableitende Schlauch aus Polyethylen mit einem Innendurchmesser von 0,6 mm mündete<br />
nach Durchtritt durch einen Silikonstopfen in einem 50 ml Röhrchen (Fa. Greiner Bio-One,<br />
Frickenhausen), welches als Auffanggefäß fungierte und in einem Wasserbad mit einer Temperatur<br />
von 39 ◦ C warm gehalten wurde. Zum Abführen des Punktates wurde mittels einer über ein<br />
Fußpedal bedienten Pumpe (Fa. Cook, Mönchengladbach) ein Vakuum von -75 mmHg generiert<br />
und über einen handelsüblichen PVC-Schlauch (Aussendurchmesser 8 mm, Innendurchmesser<br />
5 mm) zugeführt. Der Durchfluss betrug durchschnittlich ca. 22 ml pro Minute. Zur Punktion<br />
wurden handelsübliche Einmalkanülen der Firma Braun aus Melsungen der Größe 20 G x 2“<br />
(0,9 mm x 50 mm) und einem kurzen Anschliff verwendet. Der kurze Anschliff sollte hierbei<br />
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