Tierärztliche Hochschule Hannover Einfluss unterschiedlicher ...
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2 Literatur bei Eukaryoten und Eubakterien finden (TANG et al. 2005). Bei Säugern existieren insgesamt 11 verschiedene Rezeptoren dieser Art, die sich in die Untergruppen α, β und γ einteilen lassen (ZHU et al. 2003a). Die einzelnen Familienmitglieder sind entweder ubiquitär anzutreffen (PAQR1, 2, 11) oder sehr organspezifisch (PAQR10). Ihre Expression unterliegt hormoneller Regulation (ZHU et al. 2003a, CAI und STOCCO 2005). Auch PAQRs vermitteln nichtgenomische Progesteroneffekte, sind aber weder mit den nPR noch mit den mPR verwandt (ZHU et al. 2003b). PAQR5 gehört zur γ-Subfamilie und konnte in Lunge und Leber (NUTU et al. 2007), Nieren, Nervengewebe sowie weiblichen und männlichen Reproduktionsgeweben (ZHU et al. 2003a, DRESSING et al. 2011) nachgewiesen werden. PAQR5 zeichnet sich durch eine hohe Bindungsaffinität zu P4 mit begrenzter Kapazität und die γ-Subtyp-spezifische Progestinbindung aus (ZHU et al. 2003a). Es konnte eine Beteiligung des Rezeptors an der Reifung von Fisch- (ZHU et al. 2003b), Amphibien- (THOMAS et al. 2002) und Säugeroozyten (QIU et al. 2008) nachgewiesen werden. 2.15 Ziel des Projektes Die Rolle von Progesteron in der Eizellreifung ist nach wie vor unzureichend definiert (FAIR und LONERGAN 2012). In dieser Arbeit soll der Einfluss des Steroidhormons Progesteron auf die reifende Eizelle insbesondere im Hinblick auf molekulare Veränderungen untersucht werden. Der direkte Vergleich von in vivo gereiften, durch die OPU-Methode gewonnenen Oozyten und in vitro unter dem Einfluss verschiedener Progesteronkonzentrationen gereiften Eizellen soll eventuelle Veränderungen in der Genexpression bezüglich qualitätsanzeigender Gentranskripte deutlich machen. Die Analyse der Expression der Progesteronrezeptoren gibt Aufschluss über die Rolle von Progesteron während der Reifung. Somit könnte diese Arbeit ein wertvoller Beitrag zum besseren Verständnis der Wirkung von Progesteron auf die reifende Eizelle sein. 28
3 Material und Methoden Die genaue Zusammensetzung der in den Versuchen eingesetzten Medien und Chemikalien ist in Anhang A beschrieben. 3.1 Ovum Pick-Up (OPU) Die Abbildung 3.1 zeigt die einzelnen Arbeitsschritte des OPU-Versuchsteiles. Die Gewinnung von Kumulus-Oozyten-Komplexen (KOK) erfolgt mittels OPU ab dem siebten Tag nach der Brunst (Brunst=Tag 0). Bei jeder OPU-Session erfolgt eine Blutprobenentnahme für die spätere Ermittlung des Serumprogesterongehaltes. Weiterhin werden morphologische Eigenschaften der C.l. sowie Anzahl und Größen der punktierten Follikel erfasst. Nach jeder OPU-Session erfolgt die Entfernung der Kumuluszellen und die Konservierung der Oozyten für die spätere RT-qPCR. Die einzelnen Arbeitsschritte sollen im Folgenden ausführlich erläutert werden. 3.1.1 Auswahl der Versuchstiere und Feststellung des Versuchsbeginns Die Versuchstiergruppe bestand aus insgesamt drei trockenstehenden Kühen sowie sechs Färsen der Rasse Deutsche Holstein, die alle einen physiologischen Zyklus aufwiesen. Durch routinemäßige tägliche Brunstkontrolle erfolgte zunächst eine Bestimmung des Zyklusstandes. Ab dem siebten Tag (±1) nach Brunst (= Tag 0) wurden die Tiere dann über einen Zeitraum von 5-6 Wochen regelmäßig dem OPU-Verfahren unterzogen. Im erstem Durchgang mit zweimal wöchentlichen OPU-Sitzungen bestand die Versuchsgruppe aus sechs Tieren, davon je drei Kühe und Färsen. Aufgrund auftretender Zwischenbrunsten wurde bei zwei Tieren der Punktionsdurchlauf an Tag 21 des Zyklus abgebrochen und nach erneuter natürlicher Brunst neu begonnen. Ein erneuter Durchgang des OPU-Versuches mit vier Tieren des ersten Durchganges erfolgte nach einer zweimonatigen Ruhepause. Bei zwei Tieren fand die Punktion zweimal wöchentlich statt, bei zwei Tieren dreimal. Drei Tiere, die vor Versuchsbeginn noch keiner OPU-Sitzung unterzogen worden waren, bildeten den dritten Versuchsdurchgang mit zweimal wöchentlichen Punktionen. 29
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3 Material und Methoden<br />
Die genaue Zusammensetzung der in den Versuchen eingesetzten Medien und Chemikalien ist<br />
in Anhang A beschrieben.<br />
3.1 Ovum Pick-Up (OPU)<br />
Die Abbildung 3.1 zeigt die einzelnen Arbeitsschritte des OPU-Versuchsteiles. Die Gewinnung<br />
von Kumulus-Oozyten-Komplexen (KOK) erfolgt mittels OPU ab dem siebten Tag nach der<br />
Brunst (Brunst=Tag 0). Bei jeder OPU-Session erfolgt eine Blutprobenentnahme für die spätere<br />
Ermittlung des Serumprogesterongehaltes. Weiterhin werden morphologische Eigenschaften<br />
der C.l. sowie Anzahl und Größen der punktierten Follikel erfasst. Nach jeder OPU-Session<br />
erfolgt die Entfernung der Kumuluszellen und die Konservierung der Oozyten für die spätere<br />
RT-qPCR. Die einzelnen Arbeitsschritte sollen im Folgenden ausführlich erläutert werden.<br />
3.1.1 Auswahl der Versuchstiere und Feststellung des Versuchsbeginns<br />
Die Versuchstiergruppe bestand aus insgesamt drei trockenstehenden Kühen sowie sechs Färsen<br />
der Rasse Deutsche Holstein, die alle einen physiologischen Zyklus aufwiesen. Durch routinemäßige<br />
tägliche Brunstkontrolle erfolgte zunächst eine Bestimmung des Zyklusstandes. Ab dem<br />
siebten Tag (±1) nach Brunst (= Tag 0) wurden die Tiere dann über einen Zeitraum von 5-6 Wochen<br />
regelmäßig dem OPU-Verfahren unterzogen. Im erstem Durchgang mit zweimal wöchentlichen<br />
OPU-Sitzungen bestand die Versuchsgruppe aus sechs Tieren, davon je drei Kühe und<br />
Färsen. Aufgrund auftretender Zwischenbrunsten wurde bei zwei Tieren der Punktionsdurchlauf<br />
an Tag 21 des Zyklus abgebrochen und nach erneuter natürlicher Brunst neu begonnen.<br />
Ein erneuter Durchgang des OPU-Versuches mit vier Tieren des ersten Durchganges erfolgte<br />
nach einer zweimonatigen Ruhepause. Bei zwei Tieren fand die Punktion zweimal wöchentlich<br />
statt, bei zwei Tieren dreimal. Drei Tiere, die vor Versuchsbeginn noch keiner OPU-Sitzung<br />
unterzogen worden waren, bildeten den dritten Versuchsdurchgang mit zweimal wöchentlichen<br />
Punktionen.<br />
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