TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

50
ExTaq Polymerase 0,25 µl
ExTaq 10x Buffer 5,00 µl
dNTPmix 4,00 µl
HVT-F 2,00 µl
HVT-R 2,00 µl
H 2 0 31,75 µl
DNA
5,00 µl (200 ng/µl)
Die folgenden PCR Zyklen wurden mit dem SensoQuest Labcycler (Biomedizinische
Elektronik, Göttingen, Germany) durchgeführt: Ein Zyklus bei 94 °C für 240
Sekunden, 45 Zyklen für 94°C für 15 Sekunden, 56°C für 60 Sekunden, 72°C für 95
Sekunden und anschließend ein Zyklus bei 72°C für 120 Sekunden.
4.4.8 Zellzählung
Die Zellen wurden mithilfe einer Neubauer Zählkammer gezählt. Jede Probe wurde
1:10 in Trypan Blau Farbe 0,4% (Gibco, Invitrogen cooperation, Darmstadt) verdünnt
und die Zellen unter dem Lichtmikroskop gezählt. Die Zellzahl wurde unter einem
Großquadrat (Volumen 0,1 µl) ermittelt und auf 1 ml hochgerechnet (Faktor 10 4 ).
4.4.9 Durchflusszytometrie
Im zweiten Versuch wurden am sechsten und am 36. Tag nach dem Schlupf die Milz,
am 11. und 36. Tag nach dem Schlupf Blutproben in heparinisierten
Reagenzröhrchen zur durchflusszytometrischen Analyse nach bekannter Methode
(SCHWARZ et al. 2011) entnommen. Bei der Milzentnahme wurde die Milzkapsel
entfernt, die Milz zerkleinert und zerteilt mit und Phosphat-gepufferter Salzlösung
(PBS 0,01M) durch einen 70 µm Filter (BD Falcon, Heidelberg) in ein Falcon Tube
(50 ml Röhre, 114 x28 mm, PP, lot. 3040401, Sarstedt AG & Co, Nümbrecht,
Deutschland) überführt. Anschließend wurde die frisch gewonnene Zellsupsension
bei 1500 rpm für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Die folgenden Antikörper der Firma
Southern Biotech (Alabama, USA), bezogen über Biozol Diagnostica Vertrieb GmbH