TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

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Hintergrundfarbsignal steigt. Die Fluoreszenz stammt von sogenannten
Reporterfarbstoffen, die mit der Sonde gekoppelt sind. FAM ist der Fluoreszenz-
Farbstoff, welcher synchron sequenzspezifisch mit der Anreicherung der PCR-
Produkte (142 bp) ansteigt. Nicht korrekt gebundene und daher nicht durch die
Polymerase hydrolisierte Sonden werden durch einen sogenannten Quencher
(BHQ1) daran gehindert, zu fluoreszieren. Als Reference Dye, also ein weiterer
Reporterfarbstoff, welcher ebenfalls eingesetzt wird, um nicht PCR-bedingte
Variationen in der Fluoreszenz auszugleichen, wurde ROX eingesetzt. Alle Proben
bis auf die Kontrollen wurden im Doppelansatz untersucht. Es wurde das PCR Kit
Ambion Ag Path-ID One-Step RT-PCR Kit verwendet.
Pro PCR-Mix (25 µl) wurden 3 µl RNase-freies Wasser, 12,5 µl Reaktionsmix (2x RT-
PCR Buffer), 1,875 µl des Vorwärtsprimers (NDF; 10 pmol/µl), 0,625 µl des
Rückwärtsprimers (NDR; 10pmol/µl), je 0,5 µl jeder Sonde (NDpro1, NDpro2; 1,25
pmol/µl), 1 µl Enzym-Mix (25x RT-PCR Enzyme Mix) und 5 µl der Proben-RNS
verwendet. Die Primersequenzen lauten wie folgt:
NDforward primer: GAGCTAATGAACATTCTTTC, Position 12679-12696;
NDreverse primer: AATAGGCGGACCACATCTG, Position 12820-12838;
ND-probe 1: [FAM]TCATTCTTTATAGAGGTATCTTCATCATA[BHQ1],
Position 12738-12766;
ND-probe 2: [FAM]TCATACACTATTATGGCGTCATTCTT[BHQ1],
Position 12759-12784.
Zur APMV-1 rRT-PCR wurde das real time PCR-Gerät Stratagene MX 3005P
(Stratagene, La Jolla, CA) eingesetzt. Das Thermalprofil wurde mit einem Zyklus bei
45°C für 10 Minuten, einem Zyklus bei 95°C für weitere 10 Minuten, 40 Zyklen bei
95°C für 15 Sekunden und 55°C für 45 Sekunden eingestellt. Insgesamt wurden 40
Zyklen durchgeführt. Sobald die Fluoreszenz der Probe 0,018 Fluorescence dRn
(delta Rn = normalisiertes Reportersignal) überschritt, wurde die Probe als positiv
bewertet.