TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

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-70 °C gelagert. Die tiefgefrorenen Organe wurden mit einem Kryostaten (Model
2800 Frigocut (Reichert-Jung, Leica GmbH, Beasheim)) mit einer Schnittdicke von 5
µm bei -22°C geschnitten und auf Glasobjektträger (Thermo Scientific, Superfrost
Ultra Plus ®, Objektträger, geschliffen, Braunschweig, Deutschland) überführt. Die
Kryostatschnitte wurden in einem Exsikkator bei Raumtemperatur für 24 Stunden
getrocknet. Danach wurden die Schnitte in -20°C kaltem Aceton für 10 Minuten bei
Raumtemperatur fixiert und bei Raumtemperatur getrocknet. Diese Azeton-fixierten
Schnitte können für 6 Monate in einem Exsikkator bei Raumtemperatur gelagert oder
direkt bearbeitet werden. Zwischen jedem der nun folgenden Arbeitsschritte erfolgte
eine kurze (10 Sekunden) und eine lange Waschung (fünf Minuten) der Schnitte mit
phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, 0,01M, Na 2 HPO 4 2,9 g, NaCl 8g, KCl 2g,
KH 2 PO 4 0,2 g, pH 7,4) in einer Glaskammer. Pro Objekträger wurden 500 µl der
jeweiligen Lösungen aufgetragen. Nach dem Fixierungsschritt wurden alle Schnitte
zur Inaktivierung von endogenen Peroxidaseaktivitäten der Organe bei 0,03 % H 2 O 2
für 15 Minuten in einer Glasküvette belassen. Danach wurde ein Blocking Antikörper
(Pferdeserum in PBS verdünnt, Vectastain ®, Vector Laboratories, Inc., Burlingame.
USA plus Avidin D) für 20 Minuten auf den Schnitten belassen, um freie
Proteinstrukturen, welche unspezifische Bindungen hervorrufen können, zu
blockieren. Nach diesem Schritt erfolgte die Zugabe der primären Antikörper, welche
für eine Stunde bei 37°C inkubiert wurden. Die Erstantikörper wurden von der Firma
Southern Biotech (Alabama, USA) über Biozol Diagnostica Vertrieb GmbH (Eching,
Deutschland) bezogen: CD4+ ,CD8+ (T-Zellen), BU-1+ (unreife und reife B-Zellen,
keine Plasmazellen (HOUSSAINT et al. 1989) , KUL01+ (Hühner Monozyten und
Makrophagen sowie interdigitierende dendritische Zellen und aktivierte
Mikrogliazellen) und IgA+ Zellen wurden mit den in Tabelle 3 gelisteten primären
Antikörpern markiert (Tabelle 3).