TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

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4.4 Untersuchungsmethoden
4.4.1 Serologische Untersuchungen
4.4.1.1 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Zur Bestimmung des Antikörpertiters wurden folgende, kommerziell erhältliche Test-
Kits von BioCheck® („(NDV) Newcastle Disease Antibody Test Kit“, Product Code:
CK 116, Smart Veterinary Diagnostics, Niederlande) und von IDEXX Laboratories®,
Inc. (IDEXX® FlockChek, „Newcastle Disease Virus Antibody Test Kit“, Product Code
5080.00, Maine, USA) untereinander verglichen. Das zu untersuchende Serum
wurde 1: 500 verdünnt und mit den mitgelieferten Positiv- und Negativkontrollen in
den Vertiefungen der mitgelieferten Mikrotiterplatten für 30 Minuten bei
Raumtemperatur belassen, sodass die NDV Antikörper an die mit Virusantigen
beschichteten Wellböden binden konnten. Nach den folgenden Waschschritten
wurde das Konjugat (BioCheck®: Anti-Huhn: Konjugiert mit Alkalischer Phosphatase
in Tris-Puffer mit Proteinstabilisatoren, IDEXX®: Ziege Anti-Huhn, konjugiert mit
Meerrettichperoxidase und Zusatz von Proteinstabilisatoren) für 30 Minuten bei
Raumtemperatur in den Vertiefungen der Mikrotiterplatten belassen. Nach erneuten
Waschschritten wurde das TMB (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin)-Substrat für 15
Minuten bei Raumtemperatur zugegeben und anschließend eine Stop-Lösung
(Natriumhydroxid in Diaethanolaminpuffer) zugegeben. Der entstandene
Farbumschlag wurde mittels OD-Wertmessung bei einer Wellenlänge von 405 nm
(BioCeck®) und 650 nm (IDEXX®) mit dem Spektrometer Tecan Sunrise (Tecan
Group AG, Österreich) gemessen. Zur Auswertung wurde das Programm Magellan TM
(V6.5, Tecan Austria GmbH) genutzt. Die Titer wurden folgendermaßen berechnet:
Log 10 Titer = 1,0(Log(P/PK)+3,52 (BioCheck®)* 1
Log 10 Titer = 1,09(log 10 S/P)+3,36 (IDEXX®)* 2
Proben mit Titer ≥ 396 (BioCheck®) und ≥ 1159 (IDEXX®) wurden als positiv
betrachtet.
* 1 = P = Probe; PK = Positivkontrolle = BioCheck®
* 2 = S = Probe; P = Positivkontrolle =IDEXX®