TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover
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38 Milliliter frisches Erhaltungsmedium (1% FCS, 37°C) enthielten, gegeben. Die Zellen wurden drei Tage unter warmen Erhaltungsmedium (37° C, 1% FCS) belassen und jeden Tag kontrolliert. Nach drei Tagen wurden die Plaques nach einstündiger Ethanol-Fixierung (96%) und 24-stündiger Raumtemperatur-Lufttrocknung mit einem monoklonalen Antikörper gegen das F-Protein (MCA NDV-F, lot. MAB040226DM, exp. MAB-0320-102D, MSD Tiergesundheit) und einem fluoreszierenden Zweitantikörper (Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG (H+L), Lot: 861163, Invitrogen TM Eugene, Oregon, USA) sichtbar gemacht. Anschließend wurde unter einem Inversmikroskop bei 25-facher Vergrößerung ausgezählt (Inverses Mikroskop IM 35, Carl Zeiss, Göttingen, Deutschland). Zytopathische Effekte (Plaques) wurden mikroskopisch detektiert und die Anzahl der positiven immunfluoreszierenden Plaques gezählt. Die positiven Plaques wurden drei Tage nach Inkubation gezählt, die Durchschnittsanzahl der Plaque Forming Units (PFU) pro Tier und pro Tiergruppe angegeben (Daten nicht gezeigt). 4.3 Versuchsaufbau Es wurden zwei Tierversuche mit SPF-Hühnern und kommerziellen Broilern durchgeführt (Abbildungen 1 und 2). Im ersten Versuch wurden Eier von SPF- Hühnern in der Klinik für Geflügel in Hannover ausgebrütet. Die Tiere wurden per Zufall in vier verschiedene Gruppen eingeteilt und gegen die Newcastle Disease geimpft. Die erste Gruppe wurde ungeimpft als Kontrollgruppe belassen. Der dritten und vierten Gruppe wurde die ND-Lebendvakzine per Augentropfen verabreicht. rHVT-ND wurde der zweiten sowie vierten Gruppe subkutan im Nackenbereich appliziert. Am 10. und 35. Tag nach der Impfung wurden 7 Tiere pro Gruppe durch Kopfschlag betäubt, durch Blutentzug getötet und anschließend seziert. HVT wurde am 10. Tag nach Impfung durch Co-Kultivierung der Milzellen in Hühnerembryofibroblasten detektiert. Hardersche Drüse, Konjunktiva, Trachea, Lunge und Zäkaltonsille wurden zur immunhistochemischen Analyse auf verschiedene Immunzellpopulationen entnommen. Ebenfalls wurden Proben zur histologischen Untersuchung von Lunge, Trachea und Harderschen Drüsen am 10.
39 Tag entnommen. Die Belastungsinfektion fand am 35. Tag nach dem Schlupf mit einer Impfdosis mit dem APMV-1 Stamm LaSota statt. Die Tiere (n=5-10) wurden zur Belastungsinfektion und im Zeitraum danach in Isolationseinheiten vom Horsfall- Bauer Typ verbracht und gehalten, die restlichen Tiere (n=5) verblieben ohne Belastungsinfektion in den Ställen. Am 35. Tag nach der Impfung vor der APMV-1 Stamm LaSota Inokulation wurden Trachealtupferproben entnommen (7/Gruppe), pro Gruppe zusammengelegt und auf APMV-1 mittels qRT-PCR untersucht. Am 36. und 40. Tag nach dem Schlupf (einen und fünf Tage nach der APMV-1 Stamm LaSota Challenge) wurden Kontaktsentineltiere (5/Gruppe) zu den belastungsinfizierten Tieren hinzugesetzt. Die zweite Gruppe Sentinels wurde fünf Tage nach Belastungsinfektion für fünf Tage hinzugesetzt, nachdem die erste entfernt worden war. Die Tiere wurden jeden Tag auf klinische Symptome untersucht, Trachealtupfer wurden am 3., 5., 7. und 10. Tag nach Challenge gesammelt, um NDV durch qRT-PCR zu detektieren. Serumproben wurden am 36. und am 43. Tag (sowie im zweiten Versuch am 46. Tag von nicht belastungsinfizierten Tieren) nach dem Schlupf entnommen (5-7/Gruppe), um sie mittels ELISA und HAH-Test auf NDV spezifische Antikörper zu untersuchen. Am 46. Tag nach der Impfung wurden alle Vögel durch Kopfschlag betäubt, durch Blutentzug getötet und seziert. Der zweite Versuch hatte neben einigen Abweichungen den gleichen Versuchsaufbau wie der erste und wurde mit kommerziellen Broilern durchgeführt (Abb. 2). Zusätzlich zum ersten Versuch wurden anstelle von sieben Tieren fünf Tiere pro Gruppe eingesetzt. Am 35. Tag nach der Impfung wurden drei bis vier Vögel pro Gruppe getötet und seziert. Auch wurden Milz und Blutlymphozyten am sechsten, 11. und 36. Tag des Versuchs entnommen und auf verschiedene Immunzellpopulationen wie bei der Immunhistochemie in der Durchflusszytometrie untersucht. Tränenflüssigkeitsproben wurden am Tag der Challenge entnommen (35 Tage nach der Impfung), welche im ELISA auf APMV-1 Antikörper untersucht wurden. Die PCR Untersuchung auf rHVT-ND fand ebenfalls nur im zweiten Versuch statt und wurde mit Milzzellen vom 36. Versuchstag durchgeführt.
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- Seite 18 und 19: 2 wodurch die Tiere somit früh in
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- Seite 94 und 95: 78 Abb. 13 A B C Abbildung 13 (A-C)
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- Seite 98 und 99: 82 5.8 Durchflusszytometrische Unte
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- Seite 102 und 103: 86 6 Diskussion 6.1 Zielsetzung der
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Tag entnommen. Die Belastungsinfektion fand am 35. Tag nach dem Schlupf mit<br />
einer Impfdosis mit dem APMV-1 Stamm LaSota statt. Die Tiere (n=5-10) wurden zur<br />
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Bauer Typ verbracht und gehalten, die restlichen Tiere (n=5) verblieben ohne<br />
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Stamm LaSota Inokulation wurden Trachealtupferproben entnommen (7/Gruppe),<br />
pro Gruppe zusammengelegt und auf APMV-1 mittels qRT-PCR untersucht. Am 36.<br />
und 40. Tag nach dem Schlupf (einen und fünf Tage nach der APMV-1 Stamm<br />
LaSota Challenge) wurden Kontaktsentineltiere (5/Gruppe) zu den<br />
belastungsinfizierten Tieren hinzugesetzt. Die zweite Gruppe Sentinels wurde fünf<br />
Tage nach Belastungsinfektion für fünf Tage hinzugesetzt, nachdem die erste<br />
entfernt worden war. Die Tiere wurden jeden Tag auf klinische Symptome<br />
untersucht, Trachealtupfer wurden am 3., 5., 7. und 10. Tag nach Challenge<br />
gesammelt, um NDV durch qRT-PCR zu detektieren. Serumproben wurden am 36.<br />
und am 43. Tag (sowie im zweiten Versuch am 46. Tag von nicht<br />
belastungsinfizierten Tieren) nach dem Schlupf entnommen (5-7/Gruppe), um sie<br />
mittels ELISA und HAH-Test auf NDV spezifische Antikörper zu untersuchen. Am 46.<br />
Tag nach der Impfung wurden alle Vögel durch Kopfschlag betäubt, durch Blutentzug<br />
getötet und seziert.<br />
Der zweite Versuch hatte neben einigen Abweichungen den gleichen<br />
Versuchsaufbau wie der erste und wurde mit kommerziellen Broilern durchgeführt<br />
(Abb. 2). Zusätzlich zum ersten Versuch wurden anstelle von sieben Tieren fünf<br />
Tiere pro Gruppe eingesetzt. Am 35. Tag nach der Impfung wurden drei bis vier<br />
Vögel pro Gruppe getötet und seziert. Auch wurden Milz und Blutlymphozyten am<br />
sechsten, 11. und 36. Tag des Versuchs entnommen und auf verschiedene<br />
Immunzellpopulationen wie bei der Immunhistochemie in der Durchflusszytometrie<br />
untersucht. Tränenflüssigkeitsproben wurden am Tag der Challenge entnommen (35<br />
Tage nach der Impfung), welche im ELISA auf APMV-1 Antikörper untersucht<br />
wurden. Die PCR Untersuchung auf rHVT-ND fand ebenfalls nur im zweiten Versuch<br />
statt und wurde mit Milzzellen vom 36. Versuchstag durchgeführt.
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