TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

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infizierte Zelle ruft im Zellmonolayer einen Plaque hervor. Die Anzahl der Plaques
wurde gezählt, zusätzlich wurde ein Titrationsstandard mit bekanntem Titer, hier mit
dem Marekimpfstoff Marexine CA, durchgeführt.
Die Titrationen werden für zwei Verdünnungen (1:50 und 1:500) jeweils im
Doppelansatz ausgeführt. Der Titer wird als Plaque Forming Units pro Milliliter
(PFU/ml) angegeben und folgendermaßen kalkuliert:
Titer pro Milliliter (log 10 ) =
Durchschnitt gezählter Plaques x
x
4.2.1.1 rHVT-Detektion mittels Immunfluoreszenztest
Replizierendes rHVT-ND wurde am 10. Tag nach rHVT-ND Impfung aus Milzzellen in
Cokultivierung mit Hühnerembryofibroblasten nach dem oben genannten Protokoll
von MSD Tiergesundheit nachgewiesen. Sekundäre Hühnerembryofibroblasten
wurden mit 37° C warmen, 1% FCS-haltigen M6B8 (MSD Animal Health)
Erhaltungsmedium in Polystyrene Zellkulturplatten (Corning Cell Culture Dish,
430196, mit 2 mm Zählgitter oder Costar, cat. No. 3060 mit 2mm Zählgitter) für 24
Stunden mit Milzzellen der geimpften Tiere cokultiviert. Bei der Milzentnahme wurde
die Milzkapsel entfernt, die Milz mechanisch zerkleinert und zertrennt, mit phosphatgepufferter
Salzlösung (PBS 0,01M, Na 2 HPO 4 2,9 g, NaCl 8g, KCl 2g, KH 2 PO 4 0,2 g,
pH 7,4) durch einen 100 µm Filter (BD Falcon, Heidelberg) in ein Falcon Tube (50 ml
Röhre, 114 x28 mm, PP, lot. 3040401, Sarstedt AG & Co, Nümbrecht, Deutschland)
überführt und in Zellkulturmedium M6B8 (MSD Animal Health) mit 5%FCS gelöst.
Anschließend wurden die restlichen Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS
0,01 s.o.) aus dem Filter gewaschen. Dann wurden die Zellen für 10 Minuten bei
1500 rpm und 4°C zentrifugiert, der Überstand verworfen, das Zellpellet in zwei
Milliliter Medium (M6B8 (MSD Animal Health, 5% FCS)) resuspendiert und eine
Zellkonzentration von 5 x 10 6 Zellen pro Milliliter hergestellt (Neubauer Zählkammer).
Ein Milliliter dieser Zelllösung (5 x 10 6 Zellen) wurde dann auf die Platten mit
konfluenten Monolayern aus sekundären Hühnerembryofibroblasten, welche fünf