TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchungen zu lokalen Immunreaktionen nach
Impfung gegen das Newcastle Disease Virus mit einem
rekombinanten Putenherpesvirus und einer herkömmlichen
Lebendvakzine
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades
eines Doktors der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von
Jens-Christian Cors
aus Bonn
Hannover 2013

Wissenschaftliche Betreuung:
Prof. Dr. Silke Rautenschlein, PhD
Klinik für Geflügel der Stiftung Tierärztliche
Hochschule Hannover
1.Gutachter:
2.Gutachter:
Prof. Dr. Silke Rautenschlein, PhD
Apl.-Prof. Dr. med. vet. Ludwig Haas
Tag der mündlichen Prüfung: 05.11.2013

Meiner Familie

V
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ....................................................................................................... V
Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................ VIII
Abbildungsverzeichnis .............................................................................................. XII
Tabellenverzeichnis ................................................................................................. XIV
Veröffentlichungen .................................................................................................... XV
1 Einleitung ............................................................................................................. 1
2 Literaturübersicht ................................................................................................. 3
2.1 Newcastle Disease .......................................................................................... 3
2.1.1 Einleitung ................................................................................................ 3
2.1.2 Definition ................................................................................................. 3
2.1.3 Historische Entwicklung .......................................................................... 3
2.1.4 Ätiologie/Taxonomie ............................................................................... 5
2.1.5 Morphologie und Genomaufbau .............................................................. 6
2.1.6 Replikation .............................................................................................. 7
2.1.7 Virulenz im Wirt ....................................................................................... 8
2.1.8 Molekularbiologische Grundlagen der Virulenz ....................................... 8
2.1.9 Epidemiologie ....................................................................................... 10
2.1.10 Klinisches Bild ....................................................................................... 12
2.1.11 Pathologie ............................................................................................. 13
2.1.12 Histologie .............................................................................................. 14
2.1.13 Diagnose ............................................................................................... 15
2.1.14 Vorbeuge- und Kontrollmaßnahmen ..................................................... 16
2.2 Impfung gegen die Newcastle Disease .......................................................... 17
2.2.1 Einleitung .............................................................................................. 17
2.2.2 Lebendimpfstoffe .................................................................................. 18
2.2.3 Inaktivatvakzinen .................................................................................. 19
2.2.4 Zukunftsentwicklungen ......................................................................... 20
2.2.5 Impfstrategien ....................................................................................... 20

VI
2.2.6 Einschätzen des Impferfolgs ................................................................. 22
2.2.7 Rekombinante Impfstoffe ...................................................................... 23
2.3 Immunität gegen die Newcastle Disease ....................................................... 26
2.3.1 Angeborene Immunmechanismen ........................................................ 26
2.3.2 Zellvermittelte Immunität ....................................................................... 27
2.3.3 Humorale Immunität .............................................................................. 27
2.3.4 Maternal vermittelte Immunität .............................................................. 28
2.3.5 Lokale Immunität ................................................................................... 28
3 Fragestellung der eigenen Untersuchung .......................................................... 33
4 Material und Methoden ...................................................................................... 35
4.1 Tiere ............................................................................................................... 35
4.2 Impfstoffe ....................................................................................................... 35
4.2.1 Titration des Impfvirus ........................................................................... 36
4.3 Versuchsaufbau ............................................................................................. 38
4.4 Untersuchungsmethoden ............................................................................... 42
4.4.1 Serologische Untersuchungen .............................................................. 42
4.4.2 Klinischer Score .................................................................................... 43
4.4.3 Histologische Untersuchungen ............................................................. 43
4.4.4 Immunhistochemische Untersuchungen ............................................... 44
4.4.5 Virus-RNA Isolierung ............................................................................ 47
4.4.6 Nachweis von APMV-1 mittels qRT-PCR (quantitative Reverse
Transcription Polymerase Chain Reaction) ........................................... 47
4.4.7 PCR (Polymerase Chain Reaction) des Impfvirus ................................ 49
4.4.8 Zellzählung............................................................................................ 50
4.4.9 Durchflusszytometrie ............................................................................ 50
4.5 Statistische Analyse ....................................................................................... 51
5 Ergebnisse ......................................................................................................... 53
5.1 Titration des Impfvirus .................................................................................... 53
5.2 Nachweis des rHVT-ND nach Impfung durch Anzucht in vitro (Exp. 1) oder
mittels Polymerase Kettenreaktion (Exp. 2) ................................................... 53

VII
5.3 Immunhistochemische Untersuchungen von Immunzellpopulationen ........... 54
5.4 Immunzellpopulationen 5 Tage nach der Impfung bei Broilern ...................... 55
5.5 Immunzellpopulationen 10 Tage nach der Impfung bei SPF- Hühnern und
Broilern ........................................................................................................... 61
5.6 Virusdetektion von Tracheal- und Kloakaltupfern durch qRT-PCR ................ 72
5.6.1 Virusanzucht im embryonierten Hühnerei ............................................. 73
5.7 Serologische Untersuchungen - humorale Immunantwort ............................. 76
5.8 Durchflusszytometrische Untersuchungen ..................................................... 82
6 Diskussion .......................................................................................................... 86
6.1 Zielsetzung der Studie ................................................................................... 86
6.2 Klinisches Bild nach Impfung mit rHVT-ND und ND-Lebendimpfstoff sowie
nach APMV-1 Stamm LaSota Belastungsinfektion ........................................ 87
6.3 Pathologische und histopathologische Läsionen nach ND-Impfung .............. 88
6.4 Einfluss von rHVT-ND und dem ND-Lebendimpfstoff auf Immunparameter .. 89
6.4.1 Systemische Immunparameter ............................................................. 89
6.4.2 Lokale Immunität ................................................................................... 93
6.5 Virusausscheidung....................................................................................... 100
6.6 Vergleich von SPF-Hühnern und Broilern .................................................... 102
6.7 Weiterführende Untersuchungen ................................................................. 103
6.8 Fazit ............................................................................................................. 104
7 Zusammenfassung........................................................................................... 105
8 Summary .......................................................................................................... 107
9 Literaturverzeichnis .......................................................................................... 109
10 Anhang ........................................................................................................ 133
10.1 SPF-Liste ................................................................................................... 133
10.2 Lösungen, Puffer, Medien ......................................................................... 134
11 Danksagung ................................................................................................. 138

VIII
Abkürzungsverzeichnis
°C Grad Celsius
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µm Mikrometer
Abb.
Abbildung
ABC
Avidin-Biotin-Complex
AGG
Agglutinations-Test
AGP
Agar-Gel-Präzipitationstest
AOV
Analysis of variance
APMV-1 Aviäres Paramyxovirus Serotyp 1
BALT
Bronchus-associated lymphoid tissue
bp
Base pairs
BU
Bakteriologische Untersuchung
CALT
Conjunctiva-associated lymphoid tissue
Cat.No.
Catalogue number
CMI
Cell-mediated immunity
CpG
Cytosinphosphat Guanin-Oligonukleotide
Ct
Cycle threshold
DAB
Diaminobenzidin
DNA
Desoxyribonukleinsäure
E
Glutaminsäure
EID
Egg infectious dose
ELD
Egg lethal dose
ELISA
Enzyme-linked Immunosorbent Assay
EWG
Europäische Wirtschaftsgemeinschaft
F
Phenylalanin
FACS
Fluorescence activated cell sorting
FAM
Carboxyfluorescein Fluoreszenzfarbstoff
FAT
Fluoreszenz Antikörper Test
FCS Bovines Kälberserum (fetal calf serum )
F-Protein
Fusionsprotein
G
Glyzin

IX
GALT
H&E
H+L
H 2 O 2
HAH-Test
HALT
HA-Test
HAU
HN
HRP
HVT
ICPI
IgA
IgG
IgM
IgY
K
Kbp
KCl
KH 2 PO 4
KU
L
L
LSD-Test
M
MALT
MCA
min
ml
mRNA
N
Na 2 HPO 4
NaCl
ND
Gut-associated lymphoid tissue
Hämatoxylin-Eosin
Heavy and light chains
Wasserstoffperoxid
Hämagglutinationshemmungstest
Head-associated lymphoid tissue
Hämagglutinationstest
hämagglutinierende Einheit
Hämagglutinin-Neuraminidase Protein
Horseradish Peroxidase
Herpesvirus of turkeys
Intrazerebraler Pathogenitätsindex
Immunglobulin A
Immunglobulin G
Immunglobulin M
Immunglobulin Y
Lysin
Kilobase pairs
Kaliumchlorid
Kaliumdihydrogenphosphat
klinische Untersuchung
Leucin
RNA-Polymerase
Fishers Least Significant Difference-Test
Matrixprotein
Mucosa-associated lymphoid tissue
Monoklonaler Antikörper
Minuten
Milliliter
Messenger ribonucleic acid
Negative
Dinatriumhydrogenphosphat
Natriumchlorid
Newcastle Disease

X
NDV
NK-Zelle
nm
NOD
NP
NPPT
NT
OD
OIE
P
P
P
PAMP
PBL
PBS
PCR
PFU
pH
PK
PM
Newcastle Disease Virus
Natürliche Killerzelle
Nanometer
Nucleotide-Binding Oligomerization Domain Pattern
Nukleoprotein
Neomycin, Polymyxin, Pimafucin, Tylosin
Nicht getestet
Optische Dichte
Weltorganisation für Tiergesundheit
Phosphoprotein
Positivkontrolle (IDEXX®)
Probe (BioCheck®)
Pathogen-Associated Molecular Pattern
periphere Blut-Leukozyten
phosphatgepufferte Salzlösung
Polymerase Chain Reaction
Plaque Forming Unit
negativ dekadischer Logarithmus der Konzentration
von Protonen (H+)
Positivkontrolle (BioCheck®)
Post mortem
PMV-1 Paramyxovirus Serotyp 1
PPMV-1 Pigeon Paramyxovirus Serotyp 1
PRR
pv
p-Wert
Q
R
rHVT-ND
RNA
RNP-Komplex
rpm
rRT-PCR
Pattern Recognition Receptor
Post vaccination
Überschreitungswahrscheinlichkeit
Glutamin
Arginin
Rekombinantes Putenherpesvirus mit
Fusionsprotein
Ribonucleic acid
Ribonukleoproteinkomplex
Rounds per minute
Real-Time-Reverse Transkriptase-Polymerase-
Kettenreaktion

XI
RT-PCR
S
SPF
TLR
TMB
tni
V
v/v
VNT
Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion
Probe (IDEXX®)
Spezifisch-pathogen frei
Toll-Like Receptor
Tetramethylbenzidin
Tage nach Impfung
Valin
Volume/volume
Virus-Neutralisationstest
VVND Viszerotrope velogene Form der Newcastle
Disease
w/v
Weight/volume

XII
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Versuchsdurchführung des ersten Versuchs ....................................... 40
Abbildung 2: Versuchsdurchführung des zweiten Versuchs ..................................... 41
Abbildung 3 a,b (A-H): Immunhistochemische Detektion von CD4+ Zellen (A-D) und
CD8+ Zellen (E-H) in verschiedenen Organen (Hardersche Drüse, CALT, Lunge,
Zäkaltonsille) von kommerziellen Broilern am 5. Tag nach ND-Impfung. ................. 56
Abbildung 4 (A-D): Immunhistochemische Detektion von CD4+ Zellen bei 200-facher
Vergrößerung in Harderschen Drüsen von Broilern am fünften Tag nach ND-Impfung.
................................................................................................................................. 57
Abbildung 5 a, b (A-H): Immunhistochemische Detektion von Bu-1+ Zellen (A-D) und
KUL01+ Zellen (E-H) in verschiedenen Organen (Hardersche Drüse, CALT, Lunge,
Zäkaltonsille) von kommerziellen Broilern am 5. Tag nach ND-Impfung. ................. 59
Abbildung 6 (A-D): Immunhistochemische Detektion von IgA+ Zellen (A-D) in
verschiedenen Organen (Hardersche Drüse, CALT, Lunge, Zäkaltonsille) von
kommerziellen Broilern am fünften Tag nach ND-Impfung. ...................................... 60
Abbildung 7 (A-J): Immunhistochemische Detektion von verschiedene
Immunzelltypen in Harderschen Drüsen von SPF-Hühnern (A, C, E, G, I) und
Broilern (B, D, F, H, J) am 10. Tag nach ND-Impfung. ............................................. 63
Abbildung 8 (A-D): Immunhistochemische Detektion von CD4+ Zellen bei 200-facher
Vergrößerung in Harderschen Drüsen von SPF-Hühnern am 10. Tag nach ND-
Impfung..................................................................................................................... 64
Abbildung 9 (A-J): Immunhistochemische Detektion von verschiedenen
Immunzelltypen in Lungen in Nähe eines Parabronchus unter einem lateroventralen
sekundären Bronchus von SPF-Hühnern (A, C, E, G, I) und Broilern (B, D, F, H, J)
am 10. Tag nach ND-Impfung. ................................................................................. 66
Abbildung 10 (A-D): Immunhistochemische Detektion von CD4+ Zellen bei 200-
facher Vergrößerung eines Parabronchus ventral eines lateroventralen sekundären
Bronchus in Lungen von SPF-Hühnern am 10. Tag nach ND-Impfung. ................... 67

XIII
Abbildung 11 (A-E): Immunhistochemische Detektion von verschiedenen
Immunzelltypen im Konjunktiva-assoziierten lymphatischem Gewebe (CALT) von
Broilern am 10. Tag nach ND-Impfung. .................................................................... 68
Abbildung 12 (A-J): Immunhistochemische Detektion von verschiedenen
Immunzelltypen in Zäkaltonsillen von SPF-Hühnern (A, C, E, G, I) und Broilern (B, D,
F, H, J) am 10. Tag nach ND-Impfung. ..................................................................... 71
Abbildung 13 (A-C): Serum-NDV-Antikörpertiter im BioCheck®-ELISA (A), IDEXX®-
ELISA (B) und HAH-Test (C) aus Seren von SPF-Hühnern nach ND Impfung, null
und sieben Tage nach Belastungsinfektion (35 und 42 Tage nach ND Impfung). .... 78
Abbildung 14 (A-C): Serum-NDV-Antikörpertiter im BioCheck®-ELISA (A), IDEXX®-
ELISA (B) und HAH-Test (C) aus Seren von Broilern nach ND Impfung, null und
sieben Tage und 10 Tage nach Belastungsinfektion (=Challenge). ......................... 80
Abbildung 15: IDEXX®-ELISA IgG-NDV Antikörper aus Tränenflüssigkeiten von
kommerziellen Broilern am 35. Tag nach ND-Impfung. ............................................ 81
Abbildung 16 (A-R): Detektion von verschiedenen Milz- (linke Spalte) und peripheren
Blutleukozyten (rechte Spalte) von Broilern mittels Durchflusszytometrie zu
verschiedenen Zeitpunkten nach der ND-Impfung. .................................................. 84
Abbildung 17: Übersicht über signifikant erhöhte Immunzellparameter von SPF-
Hühnern am zehnten Tag nach ND-Impfung (p

XIV
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Aminosäuresequenzen an der Spaltstelle des F0-Proteins verschiedener
NDV-Stämme ............................................................................................................. 9
Tabelle 2 : Virusstämme als Lebendimpfstoffe gegen die Newcastle Disease ......... 19
Tabelle 3: Antikörper zur immunhistochemischen Detektion von verschiedenen
Immunzellpopulationen ............................................................................................. 46
Tabelle 4: Virusausscheidung über die Trachea nach Belastungsinfektion mit dem
APMV-1 Stamm LaSota am 35. Tag nach Impfung. ................................................. 74
Tabelle 5: Virusausscheidung über die Kloake nach Belastungsinfektion mit dem
APMV-1 Stamm LaSota am 35. Tag nach Impfung .................................................. 75

XV
Veröffentlichungen
Tagungsvorträge
Esser, K.-H., Cors, J.-C., Meyer-Kühling, B., Gruber, A., Günther, R., Rautenschlein,
S. (2013) Elektroenzephalographische Untersuchungen zur Betäubung beim
Geflügel. 84. Geflügelfachgespräch, Hannover, Mai 2013
Cors, J.-C., Koopman, R., Malo, A., Rautenschlein, S. (2013) Induktion lokaler
Immunität bei Hühnern nach Impfung mit einer rHVT-ND Vakzine. 84.
Geflügelfachgespräch, Hannover, Mai 2013
Rautenschlein, S., Cors, J.-C., Koopman, R., Malo, A. (2013) Induction of Local
Respiratory Immunity following Vaccination of Chickens with an HVT-NDV-
Recombinant. The American Association Of Avian Pathologists Symposium and
Scientific Program, Chicago, Juli 2013
Poster-Präsentation
Cors, J.-C., Koopman, R., Malo, A., Rautenschlein, S. (2013) A recombinant
Herpesvirus-vectored Newcastle Disease vaccine induces local immune reaction and
protection in chickens. 23 rd Annual Meeting of the Society for Virology, Kiel, März
2013

XVI

1
1 Einleitung
Die Newcastle-Krankheit (ND) oder atypische Geflügelpest ist weltweit verbreitet und
führt jährlich zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten (ALEXANDER u. SENNE
2008). Bei Huhn und Pute kann die Erkrankung in Abhängigkeit von der Virulenz des
aviären Paramyxovirus Serotyp 1 (APMV-1)-Stammes vom plötzlichen perakuten
Tod bis zur subklinischen Erkrankung variieren. Es werden apathogene, lentogene,
mesogene und velogene Stämme in Abhängigkeit von ihren krankmachenden
Eigenschaften unterschieden. Die Newcastle-Krankheit liegt nach Geflügelpest-
Verordnung und Richtlinie 92/66/EWG (Gemeinschaftsmaßnahmen zur Bekämpfung
der Newcastle-Krankheit) nur dann vor, wenn die Erkrankung durch einen definierten
Pathotypen, also ein APMV-1 Isolat mit einem intrazerebralen Pathogenitätsindex
von mindestens 0,7 verursacht wurde, also eines mesogenen oder velogenen
Virusstammes.
Die sich derzeit in Deutschland im Einsatz befindlichen Impfstoffe gegen die
Newcastle-Krankheit basieren meistens auf einem entweder inaktivierten
(Totimpfstoff) oder abgeschwächten lentogenen Virusstamm (Lebendimpfstoff),
welcher eine protektive Immunität hervorruft, ohne aber in klinisch gesunden Herden
respiratorische oder systemische Symptome zu erzeugen.
Die jedoch in Europa und weltweit immer wieder auftretenden Ausbrüche der ND mit
erheblichen Verlusten zeigen, dass die Erkrankung mit diesen Impfprogrammen nicht
ausreichend kontrolliert werden kann (DORTMANS et al. 2012). Impfdurchbrüche
und eine Ausbreitung des Feldvirus unter der Impfdecke werden immer wieder
beobachtet. Möglicherweise ist dies bedingt durch fehlerhafte Impfstoffapplikation,
unzureichende Induktion lokaler Immunität an den Eintrittspforten des Newcastle
Disease Virus (NDV) und mangelnde Kreuzimmunität zwischen Feld- und Impfviren.
Rekombinante Impfstoffe auf der Basis des Putenherpesvirus (HVT), welches dann
entsprechend Proteine des NDV exprimiert, stellen eine interessante Alternative zu
den herkömmlichen avirulenten oder lentogenen NDV-Impfstämmen dar (PALYA et
al. 2012). Diese können bereits in-ovo oder direkt nach dem Schlupf verabreicht
werden. Außerdem kommt es zu keiner Interferenz mit maternalen Antikörpern,

2
wodurch die Tiere somit früh in ihrer Entwicklung die Möglichkeit haben, nach
Impfung eine protektive Immunität auszubilden (MORGAN et al. 1993). Inwieweit ein
rekombinanter HVT-ND-Impfstoff auch lokale Immunmechanismen im Bereich des
oberen Respirationstraktes, der Haupteintrittspforte von NDV, und im Bereich des
Gastrointestinaltraktes stimuliert, ist nicht bekannt.
Ziel dieser Studie war es, einen rekombinanten HVT-ND-Impfstoff (rHVT-ND) mit
einer herkömmlichen NDV-Lebendvakzine zu vergleichen sowie eine gleichzeitige
Verabreichung beider Impfstoffe auf ihre Protektion gegen eine Belastungsinfektion
zu testen. Insbesondere sollte die Induktion lokaler Immunmechanismen im oberen
Respirationstrakt sowie die Kontrolle der Ausscheidung von Belastungsvirus näher
untersucht werden. Diese Untersuchungen werden zum Verständnis der Wirksamkeit
und Protektionsmechanismen nach Vakzination mit unterschiedlichen NDV-
Impfstoffen sowie auch der Rolle der lokalen Immunität in der Protektion gegen die
atypische Geflügelpest beitragen, was nachhaltig zur Verbesserung aktueller
Bekämpfungsmaßnahmen dieser Krankheit führen kann.

3
2 Literaturübersicht
2.1 Newcastle Disease
2.1.1 Einleitung
Die Newcastle-Krankheit (ND) oder auch atypische Geflügelpest ist eine hoch
ansteckende Krankheit des Geflügels, hervorgerufen durch das aviäre
Paramyxovirus Serotyp 1 (APMV-1). Die Übertragung erfolgt von Tier zu Tier über
Inhalation und Ingestion von vermehrungsfähigen Viruspartikeln oder auch über
Vektoren (ALEXANDER 2003). Die Krankheit variiert in ihrem klinischen Bild von
milden subklinischen Verläufen bis hin zu hohen Mortalitätsraten.
2.1.2 Definition
Die Newcastle Disease ist eine Infektion mit einem aviären Paramyxovirus des
Serotyps 1 (APMV-1), welches entweder einen intrazerebralen Pathogenitätsindex
von mindestens 0,7 in Eintagsküken (Gallus gallus) aufweist und/oder mehrere
basische Aminosäuren im Virus am C-Terminus des F2-Proteins und Phenylalanin
am Rest 117, dem N-Terminus des F1-Proteins, besitzt. Der Begriff „mehrere
basische Aminosäuren“ umfasst mindestens drei Arginin- oder Lysinreste zwischen
Rest 113 und 116 (OIE 2008).
2.1.3 Historische Entwicklung
ND wurde erstmalig 1926 in Newcastle upon Tyne und auf der Insel Java (heutiges
Indonesien) beschrieben, obwohl schon vorherige Ausbrüche möglich gewesen sein
könnten (MACPHERSON 1956; ALEXANDER 2001).

4
Der seit 1926 auftretende hochpathogene Verlauf der Viruserkrankung legt nahe,
dass seitdem grundlegende Veränderungen auf Virus- oder Wirtsebene aufgetreten
sind.
Nach Hanson (HANSON 1972) gibt es drei Theorien zu dem plötzlichen Auftreten
der Krankheit. Die erste Theorie besagt, dass virulente Virenstämme schon immer
endemisch in der Geflügelpopulation waren und erst seit Beginn der kommerziellen
Geflügelhaltung auffällig wurden. In der zweiten Theorie geht man davon aus, dass
das Virus in anderen Spezies endemisch war, wo es nur einen leichteren
Krankheitsverlauf auslöste und dann auf das Nutzgeflügel überging. Diese Theorie
wurde durch die Beobachtungen in der zweiten Panzootie von 1970-1973 bestätigt,
als die Krankheit durch Import von Hauspsittaziden weltweit verbreitet wurde, ohne
aber bei diesen eine schwerwiegende Erkrankungen zu verursachen. In der dritten
Theorie geht man davon aus, dass das Virus durch Mutation hochpathogene
Eigenschaften erlangte. Die dritte Theorie könnte durch große Ähnlichkeiten der
NDV-Variante, welche bei Ausbrüchen der atypischen Geflügelpest in Irland um 1990
isoliert wurde, mit niedrig pathogenen Varianten, welche in Irland in 1987 isoliert
wurden, begründet werden (MCNULTY et al. 1988). Diese beiden sehr ähnlichen
Varianten unterschieden sich antigenetisch und genetisch von allen anderen
Newcastle Disease Viren (ALEXANDER u. SENNE 2008).
Der eigentlich nur als vorläufig gedachte Name Newcastle Disease wurde von Doyle
gewählt und blieb bis heute erhalten (DOYLE 1935). Seit 1926 sind vier
panzootische Verläufe der ND bekannt. Beim ersten Verlauf geht man davon aus,
dass sich die Krankheit von 1926 bis 1960 sehr schnell in Asien und dann langsamer
im Rest der Welt ausbreitete (ALEXANDER et al. 2012). Die zweite Panzootie verlief
deutlich schneller, breitete sich vom mittleren Osten aus und erreichte ab den späten
1960er Jahren alle Länder bis 1973. Dieser weitaus schnellere Verlauf wurde durch
einen intensiveren internationalen Handel der Geflügelindustrie ermöglicht.
Außerdem wurde die Virusverbreitung durch den rasch ansteigenden Import von
Hauspsittaziden zu dieser Zeit beschleunigt, bei dem das Virus durch diese Tiere aus
endemischen Ländern in ND-freie Länder verschleppt wurde. Der Einfluss dieser
zweiten Panzootie auf die Geflügelwirtschaft führte zur Entwicklung von Impfstoffen

5
und Impfplänen, die bei der Geflügelhaltung unerlässlich wurden. In den späten
1970er Jahren kam es zur dritten Panzootie, vermutlich hervorgerufen durch den
universellen Einsatz von Impfstoffen, welche zwar die Geflügelbestände schützten,
aber auch eine Adaption und Replikation der Virusstämme förderten, was in weiteren
Ausbrüchen der Krankheit resultierte (ALEXANDER et al. 2012). Die vierte Panzootie
ereignete sich hauptsächlich in der Brief- und Haustaubenpopulation in den Jahren
1982 und 1983 und wurde durch eine antigenetische Variante des AMPV-1
hervorgerufen. Hierbei handelte es sich um das Paramyxovirus Type 1 der Tauben
(PPMV-1), welches sich nach Untersuchungen mit monoklonalen Antikörpern als
antigenetisch unterschiedlich zu anderen AMPV-1 Varianten erwies (ALDOUS et al.
2004). Die Krankheit äußerte sich hauptsächlich in zentralnervösen Erscheinungen
und wässrig-grünlichem Durchfall. In den späten 1970er Jahren traten solche Fälle
gehäuft im mittleren Osten auf und verbreiteten sich von dort aus durch Wettflüge in
der restlichen Welt. Das hierbei involvierte Virus fand seinen Weg auch über durch
Tauben kontaminiertes Futter 1984 in Hühnerbetriebe, was zu 20 Ausbrüchen führte
(ALEXANDER et al. 1985). Bis heute wurde das Newcastle Disease Virus auf der
ganzen Welt isoliert. Endemische ND ist heutzutage trotz aller Impfprogramme ein
limitierender Faktor in der weltweit wachsenden Geflügelproduktion (ALEXANDER
2011), nicht nur durch verheerende Verluste, sondern auch durch die dadurch
resultierenden Handelsrestriktionen und Embargos der betroffenen Länder.
Im Jahre 1995 wurde in Deutschland eine Impfpflicht gegen die Newcastle Disease
für Hühner- und Putenbestände eingeführt (GEFLÜGELPEST-VERORDNUNG
2007).
2.1.4 Ätiologie/Taxonomie
Das Newcastle Disease Virus gehört in die Ordnung der Mononegavirales, die
Familie der Paramyxoviridae mit der Unterfamilie Paramyxovirinae und dem Genus
Avulavirus an. Es gibt 11 Serotypen des Aviären Paramyxovirus (APMV-1), wobei
nur Stämme des ersten Serotyps die Newcastle Disease auslösen können (BRIAND
et al. 2012). Zur Klassifizierung der Newcastle Disease Viren, welche eine hohe

6
genetische und antigenetische Diversität aufweisen, sind zwei unterschiedliche
Systeme beschrieben (MILLER et al. 2010).
Hierbei wurde eine Vielzahl von NDV-Isolaten nach phylogenetischer Analyse der
Nukleotidsequenz des F-Gens in Linien oder Genotypen eingeteilt. Das erste System
nach Aldous et al. teilt NDV in sechs Hauptlinien und dreizehn Unterlinien ein
(ALDOUS et al. 2003). Später wurde eine siebte Hauptlinie und sieben Unterlinien
hinzugefügt (DIEL et al. 2012a). Das zweite Klassifizierungssystem nach Ballargi-
Pordany et al. teilt NDV in zwei Klassen von Genotypen ein, wobei die erste in neun
und die zweite in elf Genotypen unterteilt wird (BALLAGI-PORDANY et al. 1996). Die
Genotypen I, II, VI und VII wurden weiter eingeteilt in Sub-Genotypen Ia und Ib, II
und IIa, VIa bis VIf und VIIa bis VIIh (DIEL et al. 2012a).
2.1.5 Morphologie und Genomaufbau
Paramyxoviren aus der Ordnung der Mononegavirales haben eine einzelsträngige
RNA mit negativer Polarität. Das behüllte Virion des NDV ist pleomorph und hat
einem Durchmesser von etwa 100-350 nm. Das nicht segmentierte RNA-Genom ist
über 15000 Nukleotide lang und kodiert für folgende sechs Strukturproteine:
Nukleoprotein (NP), Phosphoprotein (P), Matrixprotein (M), Fusionsprotein (F),
Hämagglutinin-Neuraminidase Protein (HN) und die RNA-Polymerase (L). Die Gene
sind folgendermaßen angeordnet: 3′-NP-P-M-F-HN-L-5′. Das Nukleoprotein,
Phosphoprotein und die RNA-Polymerase bilden mit dem RNA-Genom den
Ribonukleoproteinkomplex (RNP) (MILLER et al. 2010; RAMP 2012).
Die Virulenz des NDV ist zwar abhängig von mehreren Genen, jedoch wirken sich
Veränderungen an der F-Proteinspaltstelle am stärksten auf die Virulenz aus. Niedrig
virulente Viren besitzen weniger basische Aminosäuren an der Spaltstelle und die
Aminosäure Leucin anstelle von Phenylalanin an Position 117 (DE LEEUW et al.
2003).
Phylogenetische Untersuchungen zeigten, dass die zwei Klassen der NDV in drei
Genomgrößenkategorien aufgrund ihrer Nukleotidanzahlen eingeteilt werden
können. Alle Viren der Klasse I (Genotyp 1-9) besitzen eine Genomlänge von 15198

7
Nukleotiden. Diese Viren blieben in ihrem ursprünglichem Reservoir, den
Wildwasservögeln. Viren der zweiten Klasse gingen auf die Hühnerpopulation über
und erlangten virulente Eigenschaften. Die Genotypen I-IV der zweiten Klasse,
welche vor 1960 isoliert wurden, haben eine Länge von 15186 Nukleotiden. Die
ausschließlich pathogenen Genotypen V-VIII der zweiten Klasse (Isolierung nach
1960) weisen eine Genomlänge von 15192 Nukleotiden auf (CZEGLEDI et al. 2006).
2.1.6 Replikation
Die Virusanheftung an die Wirtszelle erfolgt über das transmembrane virale
Oberflächenprotein Hämagglutinin-Neuraminidase (HN-Protein), welches an die
sialinsäurehaltigen Oberflächenrezeptoren der Zelle bindet. Daraufhin wird die
Membranfusion durch das Fusionsprotein eingeleitet, welches mit seinen
hydrophoben Aminosäuren am Aminoterminus des F1-Proteins mit der
Wirtszellmembran interagiert (FERREIRA et al. 2004). Die Virushülle und die
Wirtszellmembran fusionieren bei neutralem pH-Wert und das Nukleokapsid wird in
die Zelle abgegeben. Die Virusreplikation findet ausschließlich im Zytoplasma statt.
Sie beginnt mit der Transkription der Virus-RNA zu mRNAs durch die Polymerase
des Virus. Zusätzlich wird durch den RNP-Komplex ein zusammenhängender
positiver RNA-Strang der Virus-RNA erzeugt (Antigenom), welcher zur Synthese
neuer Virusgenome dient. Die viralen Proteine werden am rauen endoplasmatischen
Retikulum translatiert. Parallel dazu erfolgt die Glykosylierung der HN- und F-
Proteine und die Spaltung des F0-Proteins (inaktives F-Vorläuferprotein) mithilfe der
wirtseigenen Polymerase im Golgiapparat. Dadurch ensteht die aktive Form des F-
Proteins, welches aus einer F1- und einer F2-Untereinheit besteht, die über Disulfid-
Brückenbindung zusammenhängen. Sobald genügend NP-Proteine vorhanden sind,
beginnt die Replikation, bei der die neu synthetisierten Genome umhüllt werden. Das
neue Ribonukleotid verbindet sich daraufhin mit dem Matrixprotein an der
Wirtszellmembran und das Virion wird durch „Knospung“ entlassen (LAMB 2001).

8
2.1.7 Virulenz im Wirt
Die Virulenz eines NDV Stammes ist wirtsabhängig und hängt von folgenden
Eigenschaften ab: Virus-Dosis, Übertragungsweg, Alter, Immunstatus und
Umweltbedingungen, welche sich begünstigend auf den Krankheitsverlauf
auswirken. Je jünger die Tiere, desto akuter ist der Verlauf der Erkrankung, der Tod
tritt ein, bevor klinische Symptome zu beobachten sind. Bei älteren Tieren ist ein
eher protrahierter Verlauf mit charakteristischen klinischen Symptomen zu
beobachten.
2.1.8 Molekularbiologische Grundlagen der Virulenz
Bei der Replikation des NDV wird das Vorläufer-Glykoprotein F0 des F-Proteins
durch Proteasen in die beiden Untereinheiten F1 und F2 gespalten (ROTT 1988).
Diese nach der Translation stattfindende Spaltung erfolgt durch eine zelleigene
Protease (NAGAI et al. 1976). Die Spaltbarkeit des F0-Vorläufermoleküls steht in
direktem Zusammenhang zur Virulenz des Virus in vivo (NAGAI et al. 1976;
ALEXANDER u. BELL 2004). F0-Vorläufermoleküle von virulenten Viren können von
ubiquitär vorkommenden, Furin-ähnlichen Proteasen gespalten werden (NAGAI et al.
1976; GOTOH et al. 1992). Dies erlaubt dem Virus eine Verbreitung in zahlreichen
Geweben und Zellen des Wirtes und resultiert in einer Schädigung lebenswichtiger
Organe. Nicht virulente Viren werden nur durch Trypsin-ähnliche Proteasen
gespalten und können sich dadurch auch nur in den Geweben vermehren, in denen
diese Enzyme häufig vorkommen, nämlich im Respirations- und Gastrointestinaltrakt
(ALEXANDER u. BELL 2004).
Die Virulenz basiert hauptsächlich auf dem Aminosäuremuster der F0-Spaltstelle,
dem Vorhandensein von basischen Aminosäuren an den Positionen 113, 115 und
116 und Phenylalanin an Position 117 in virulenten NDV-Stämmen. Die Sequenz
lautet häufig: 113 RQK/RR * F 117 , wobei die meisten virulenten Viren auch an Position
112 eine basische Aminosäure besitzen (ALEXANDER u. BELL 2004). Tabelle 1
zeigt die Aminosäuremuster der F0-Spaltstelle von verschiedenen Virusstämmen
(Tabelle 1).

9
Neben der Aminosäurefrequenz der Spaltstelle des F-Proteins ist auch das HN-
Protein eine Virulenzdeterminante. Stämme mit gleicher Aminosäurefrequenz an der
F-Protein-Spaltstelle weisen unterschiedliche Virulenzeigenschaften auf. Eine Studie
von de Leeuw et al. zeigte eine Veränderung in der Virulenz des Virusstammes beim
Austausch der HN-Gene von verschieden virulenten Virusstämmen (DE LEEUW et
al. 2005).
Tabelle 1: Aminosäuresequenzen an der Spaltstelle des F0-Proteins verschiedener
NDV-Stämme
Virusstamm Virulenz Spaltstelle
Aminosäuren 111 bis 117
Herts 33 hoch -G-R-R-Q-R-R*F-
Essex ‘70 hoch -G-R-R-Q-K-R*F-
135/93 hoch -V-R-R-K-K-R*F-
617/83 hoch -G-G-R-Q-K-R*F-
34/90 hoch -G-K-R-Q-K-R*F-
Beaudette C hoch -G-R-R-Q-K-R*F-
La Sota niedrig -G-G-R-Q-G-R*L-
D26 niedrig -G-G-K-Q-G-R*L-
MC110 niedrig -G-E-R-Q-E-R*L-
1154/98 niedrig -G-R-R-Q-G-R*L-
(modifiziert nach Alexander 2008, Diseases of Poultry 11 th edition, * zeigt die
Spaltstelle an; E= Glutaminsäure, F= Phenylalanin, G= Glycin, K= Lysin, L= Leucin,
Q= Glutamin, R= Arginin, V= Valin)

10
2.1.9 Epidemiologie
2.1.9.1 Wirte
Es ist anzunehmen, dass alle Vögel für ND empfänglich sind, jedoch mit
artabhängiger Ausprägung der Krankheit. Hauptsächlich sind jedoch Hühnervögel,
Sperlingsvögel, Tauben, Kormorane, Papageien, Raubvögel und weniger
Wasservögel klinisch betroffen. Auch andere Tiere wie Reptilien und der Mensch
sind empfänglich (LANCASTER 1966). Newcastle Disease Viren wurden regelmäßig
von ziehenden Wasservögeln isoliert. Die meisten Isolate zählten zu den niedrigvirulenten
Varianten und können asymptomatisch- enterischen Pathotypen
zugeordnet werden.
Trotzdem sind auch Ausbrüche der virulenten ND in Wildvögeln zu beobachten, wie
zum Beispiel ein Ausbruch in Nordamerika während der 1990er Jahre, bei dem
Kormorane betroffen waren. (ALEXANDER u. BELL 2004). 1992 fand ein Ausbruch
der Krankheit in der Kormoranpopulation in Westkanada und im Nordwesten der
USA statt, bei dem das Virus auf domestizierte Puten überging (MIXSON u.
PEARSON 1992).
2.1.9.2 Zoonotisches Potential
Das NDV ruft beim Menschen Augeninfektionen hervor mit uni- und bilateralen
Rötungen, Tränenfluss, Augenlidödemen, Konjunktividen und subkonjunktivalen
Blutungen (ALEXANDER 2003). Aber auch Fälle mit Fieber und Kopfschmerzen mit
und ohne Konjunktivitis wurden dokumentiert (CHANG 1981). Die Infektion heilt
schnell ab, die Hornhaut ist nicht betroffen. Meist wurden Infektionen durch direkten
Kontakt mit infizierter Allantoishöhlenflüssigkeit hervorgerufen, welche bei
Laborunfällen ins Auge spritzte, oder durch Einreiben von Viruspartikeln in die Augen
mit kontaminierten Händen, nachdem infizierte Vögel angefasst wurden. Auch bei
Sprayvakzinierung kann durch Aerosol-Augen-Kontakt eine Infektion hervorgerufen
werden (UTTERBACK u. SCHWARTZ 1973; BURRIDGE et al. 1975; JORGENSEN
et al. 2000).

11
Allgemein gilt aber menschlicher Kontakt zu infiziertem Geflügel als wenig risikoreich.
Übertragungen von Mensch zu Mensch sind bis dato nicht dokumentiert
(ALEXANDER 2003).
2.1.9.3 Verbreitung
Die Verbreitung der Newcastle Krankheit hängt von den Eradikationsversuchen und
Kontrollmaßnahmen der jeweiligen Länder ab. Auch die Haltung ist
ausschlaggebend. Länder mit hauptsächlich großen kommerziellen Geflügelherden
haben weniger Probleme mit dem Ausbruch der Krankheit als Länder, in denen
Hühner hauptsächlich in ländlichen Hinterhofherden gehalten werden (ALEXANDER
2003). Als NDV Erregerreservoir gelten einheimische Wild- und Zugvögel, ebenso
kann eine Einschleppung über die Einfuhr von Wildvogelarten aus endemischen
Gebieten erfolgen (DIEL et al. 2012b). Der Einsatz von NDV-Vakzinen beim
Nutzgeflügel rund um den Globus erschwert eine Schätzung der tatsächlichen
Verteilung des NDV. Über serologische Untersuchungen kann nicht zwischen
niedrig- und hoch-virulenten Varianten sowie Impfstoffen unterschieden werden.
Auch können in immunisierten Herden Ausbrüche der Newcastle Disease
vorkommen (ABOLNIK et al. 2004). Eine antigenetische Diversität zwischen
Impfstoffen und Feldviren könnte hierbei eine Rolle spielen (KAPCZYNSKI u. KING
2005; HU et al. 2009; MILLER et al. 2009b), jedoch zeigte eine Studie von Dortmans
et al. von 2012, dass eine klassische Lebendvakzine des Genotyps II, welche sich
antigenetisch von einem virulenten Virusstamm unterscheidet, die gleichen
protektiven Eigenschaften hat, wie eine genotypisch gleiche Lebendvakzine,
gemessen an klinischen Symptomen (DORTMANS et al. 2012). Die Autoren
machten eher schlechte Impfpraxis und Doppelinfektionen mit anderen
immunsuppressiven Krankheitserregern für Ausbrüche in immunisierten Herden
verantwortlich, als eine antigenetische Varianz zwischen Impf- und Feldvirus. Andere
Studien zeigen jedoch auch, dass durch eine Impfung mit einem dem
Belastungsvirus genotypisch gleichen Lebendimpfstoff eine signifikante Reduzierung
der Virusausscheidung bei Hühnern nach einer Belastungsinfektion erreicht werden

12
kann (MILLER et al. 2009b), was ausschlaggebend für die Verbreitung und den
Verlauf der Erkrankung ist. Die Lebendimpfstämme der letzten 50 Jahre gehören
phylogenetisch zu den Genotypen I und II und unterscheiden sich von den
Virusstämmen, welche in den letzten zwei Dekaden verantwortlich für Ausbrüche der
ND waren. Die hierbei hauptsächlich beteiligten Virusstämme aus den USA
stammten von Genotyp V (PEDERSEN et al. 2004), in Europa, Asien und Afrika vom
Genotyp IV (Pigeon Paramyxovirus Type I) und Genotyp VII (YU et al. 2001;
ABOLNIK et al. 2004; LIEN et al. 2007; LIU et al. 2007; IRVINE et al. 2009; KE et al.
2010).
2.1.10 Klinisches Bild
Die klinischen Symptome der ND hängen von verschiedenen Faktoren ab.
Virusstamm, Wirtsspezies, Alter, Immunstatus, Virusdosis und Expositionsweg,
Koinfektion mit anderen Erregern sowie Umwelt- und sozialbedingter Stress spielen
eine ausschlaggebende Rolle. Die Verläufe der ND werden anhand der klinischen
Symptome in fünf Formen eingeteilt: 1. viszerotrope velogene Form (VVND) , 2.
neurotrope velogene Form, 3. mesogene Form, 4. lentogene oder respiratorische
Form und 5. subklinisch enterische Form (ALEXANDER 2003). Bei der schweren
viszerotropen Form der Newcastle Disease kommt es sehr schnell zu extrem hohen
Mortalitätsraten mit wenigen oder ausbleibenden klinischen Symptomen. Das
Krankheitsgeschehen spielt sich im Gastrointestinaltrakt ab, aber auch leichte bis
schwere respiratorische Erscheinungen werden beobachtet. Grünlich-schleimiger Kot
wird häufig bei Vögeln beobachtet, welche nicht in der initialen Phase der Infektion
sterben. Kurz vor dem Tod zeigen sich Muskeltremor, Tortikollis, Opisthotonus sowie
Flügel- und Beinparalysen. In Herden mit voll empfänglichen Hühnern kann die
Mortalität bis zu 100% erreichen (SUSTA et al. 2011). Bei der neurotropen
velogenen Form der ND, welche hauptsächlich in den USA vorkommt, zeigen sich
schwere respiratorische Symptome, gefolgt von neurologischen Symptomen. Die
Legeleistung fällt rapide ab, die Eier sind teilweise dünnschalig bis schalenlos. Die

13
Morbidität kann bis zu 100 % betragen, die Mortalität variiert je nach Alter der Vögel,
bei jungen Vögeln bis zu 90%, bei alten Tieren um die 50% (SUSTA et al. 2011).
Mesogene Stämme verursachen vorwiegend respiratorische Symptome sowie eine
reduzierte Legeleistung, welche ein paar Wochen anhält. Auch neurologische
Symptome können auftreten. Die Mortalität ist niedrig. Lentogene ND-Viren rufen
normalerweise keine Erkrankung in erwachsenen Vögeln hervor. Junge
vollempfängliche Hühner können jedoch mit respiratorischen Symptomen erkranken.
Bei der vierten Pandemie in den späten 1970er Jahren, welche hauptsächlich die
Taubenpopulation betraf und durch eine AMPV-1 Variante, dem PPMV-1
hervorgerufen wurde, zeigten betroffene Tauben grünlichen Durchfall und
neurologische Symptome. Die Tauben fielen durch uni- und bilaterale
Bewegungsstörungen der Flügel und Beine sowie Tortikollis auf (KALETA et al.
1985). Respiratorische Symptomatik wurde hingegen kaum beobachtet.
Puten sind ebenso wie Hühner empfänglich für velogene Newcastle Disease Virus-
Stämme, zeigen aber weniger schwerwiegende klinische Symptome (BOX et al.
1970; ALEXANDER 1999). Enten und Gänse werden als natürliches Virusreservoir
angesehen und sind ebenfalls empfänglich für das Virus, zeigen aber kaum bis keine
klinischen Symptome (ZHANG et al. 2011). Die klinischen Symptome in anderen
Geflügelspezies sind unterschiedlich und von der betroffenen Spezies abhängig.
Nicht geimpfte Fasane sind empfänglich für die ND und zeigen ähnliche klinische
Symptome wie das Huhn (ALDOUS u. ALEXANDER 2008). Je empfänglicher die
Spezies, desto stärker die klinische Ausprägung (ALDOUS et al. 2010). Am
empfänglichsten ist das Huhn, gefolgt von Pute, Taube und Enten (ALDOUS et al.
2010).
2.1.11 Pathologie
Die Ausprägungen der pathologischen Veränderung bei einer AMPV-1 Infektion
variieren ähnlich wie die klinischen Symptome enorm und sind von Virusstamm, Wirt
und Begleitfaktoren abhängig. Bei der Pathologie der Newcastle Disease gibt es
keine pathognomonischen Veränderungen. Velogene viszerotrope Formen der ND

14
sind durch hämorrhagische Läsionen in der Mukosa des Verdauungstraktes der
Hühner vom Proventrikulus bis zum Kolon gekennzeichnet. Diphtheroide
Entzündungen der Peyerschen Platten führen zu nekrotisch ulzerativen Läsionen. Bei
längeren und schwereren Verläufen sind knopfförmige ulzerativ diphtheroide Herde
(„Boutons/Buttons“) in der Darmwand zu finden (MAZUMDER et al. 2012). Im
Drüsenmagen zeigen sich petechiale Blutungen, die Zäkaltonsillen sind
hämorrhagisch verändert (HANSON et al. 1973), was bei der neurotropischen Form
nicht zu beobachten ist. Bei keiner Form der ND zeigen sich makroskopische
Läsionen im Bereich des zentralen Nervensystems. Im Respirationstrakt finden sich
mukosale Blutungen und deutliche Kongestionen in der Trachea.
Luftsackentzündungen können auftreten, welche mit Verdickungen der Luftsäcke und
mit katarrhalischen oder käsigen Exsudaten durch bakterielle Sekundärinfektionen
einhergehen. Als weitere pathologische Veränderungen werden Blutungen im
unteren Augenlid, fokale Nekrosen in der Milz und paratracheales Ödem am
Brustkorbeingang beobachtet.
Bei Infektionen von Hühnern und Puten in der Legeperiode mit velogenem NDV
findet sich gewöhnlich Eidotter in der Bauchhöhle, Blutungen an Ovidukt und Uterus
sowie eine Dislokation dieser Organe (BWALA et al. 2012).
2.1.12 Histologie
Histologische Veränderungen zeigen sich in allen Hirnstrukturen außer im Großhirn.
Eine nicht eitrige Enzephalomyelitis mit neuronaler Degeneration und perivaskulären
lymphozytären Infiltrationen sowie Ansammlungen von Gliazellen und eine
Hypertrophie von Endothelzellen sind in diesen Bereichen zu beobachten (CATTOLI
et al. 2011). Ödeme und Blutungen zeigen sich in Organen in der Nähe von
Blutgefäßen. Die Kapillaren und Arteriolen sind hyalinisiert und weisen nekrotische
Endothelzellen auf. Infektionen mit virulenten Stämmen zeigen einen durch
Blutungen und Nekrosen in schleimhaut-assoziierten Lymphgeweben
gekennzeichneten Verdauungstrakt. In der Trachea finden sich einen Tag nach
Infektion hypertrophierte Becherzellen. Das Trachealepithel zeigt nach ein- bis

15
zweitägigem Infektionsverlauf zilienlose Bereiche hauptsächlich um die
Ausführungsgänge muköser Drüsen, welche mit zunehmendem Krankheitsverlauf
größer werden. Nach vier Tagen zeigen sich kleine Vakuolen mit Lymphozyten und
heterophilen Granulozyten in der Epithelzellschicht (KOTANI et al. 1987). In der
Schleimhaut des oberen Respirationstraktes finden sich zudem Ödeme und
Zellinfiltrationen, welche aus Lymphozyten und Makrophagen bestehen. Die
Reproduktionsorgane sind durch Follikelatresie mit Infiltration von Entzündungszellen
und Formierung von lymphoiden Aggregaten an Follikel und Ovidukt gekennzeichnet.
Selten werden fokale Nekrosen und Einblutungen in Leber, Gallenblase und Herz
beobachtet. Kongestionen und Petechien am Kamm der Tiere sowie Ulzerationen
und Blutungen der Haut treten bei vizerotropen velogenen NDV-Infektionen auf
(CATTOLI et al. 2011).
2.1.13 Diagnose
Zur Bekämpfung der ND muss eine Identifikation und Isolation der jeweiligen
Virusvarianten erfolgen. Eine Unterscheidung zwischen niedrig- und hoch virulenten
Varianten sowie die Unterscheidung zwischen infizierten und nicht-infizierten
Hühnern muss erfolgen, da es keine pathognomonisch-pathologischen
Veränderungen gibt. Zur Isolation des Agens eignen sich Tupfer aus Rachen,
Trachea und Kloake sowie Organproben aus Hirn, Leber, Niere, Milz und
pathologisch veränderten Organen. Das Probenmaterial wird in der Eikultur auf
replizierendes Virus und nachfolgend im HAH-Test weiter differenziert oder zu
weiteren molekularen Untersuchungen herangezogen (OIE 2012). Monoklonale
Antikörper können zur Identifikation von APMV-1 im
Hämagglutinationshemmungstest eingesetzt werden. Es stehen kommerziell
erhältliche RT-PCR/rRT-PCR Systeme zur Detektion von NDV-spezifischen
Genomabschnitten zur Verfügung. Durch Sequenzierung kann zwischen
niedrigpathogenen und hoch pathogenen Varianten des APMV-1 unterschieden
werden (MILLER et al. 2010). Virales Antigen kann direkt durch
immunhistochemische und Immunfluoreszenzuntersuchungen detektiert werden. Als

16
serologische Tests stehen der Hämagglutinationshemmungstest (HAH-Test), der
Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), sowie Multiplex Assays in
Kombination mit einem Luminex Analysesystem zur Verfügung (OIE 2008).
2.1.13.1 Molekulare Techniken zur Diagnose von ND
Bei der Identifikation des Virus wird eine reverse Transkription mit anschließender
PCR durchgeführt, wodurch eine DNA Kopie der Virus-RNA erzeugt wird. Bei der
real Time RT-PCR werden fluorogene Proben in Echtzeit amplifiziert gemessen und
detektiert. Mit gegen das M-Gen gerichteteten Primern wurden oft Viren der Klasse I
nicht detektiert (KIM et al. 2007), weswegen eine multiplex rRT-PCR entwickelt
wurde, bei der Primer zusätzlich gegen das L-Gen eingesetzt wurden (MIA KIM et al.
2008). Eine Identifizierung von virulenten Isolaten ist durch eine rRT-PCR möglich,
welche sich gegen die Spaltstelle des F-Gens richtet (WISE et al. 2004).
2.1.14 Vorbeuge- und Kontrollmaßnahmen
Kontrollstrategien gegen die Newcastle Disease obliegen den jeweiligen Ländern.
Durch Vorgabe der World Organization for Animal Health (OIE) zur internationalen
Seuchenbekämpfung ist die Newcastle Disease in allen industrialisierten Ländern
eine anzeigepflichtige Tierseuche. Bei einem Primärausbruch der ND ist eine
Virusisolation und -identifikation sowie die Einschätzung der Virulenz des Isolats
nötig, um geeignete Bekämpfungsmaßnahmen einzuleiten. Nach Ende eines
Ausbruchs gilt die ND in Deutschland als erloschen, wenn das Geflügel des
betroffenen Bestandes verendet oder getötet und beseitigt wurde, eine Desinfektion
erfolgte und seitdem 30 Tage vergangen sind. Der Verdacht gilt als beseitigt, wenn
die ND nicht durch virologische Untersuchung bestätigt werden kann und die
betroffenen Tiere verendet, getötet und beseitigt wurden (GEFLÜGELPEST-
VERORDNUNG 2007).
Die Kontrolle der Newcastle Disease besteht hauptsächlich aus Optimierung des
Managements der Betriebe, „Biosicherheit“, Hygienemaßnahmen in Kombination mit

17
präventiver Impfung von Herden, in der Verhinderung der Virusverbreitung durch das
Keulen von infizierten oder verdächtigen Tieren sowie der Einrichtung von
Sperrbezirken und Beobachtungsgebieten. Die Verhinderung der Einschleppung der
Krankheit ist in Newcastle Disease-freien Ländern die höchste Priorität. In
Deutschland besteht eine generelle Impfpflicht für Hühner und Puten, welche bei
einem ND-Seuchenausbruch oder -verdacht ausgesetzt wird. Danach ist eine
behördliche Genehmigung zur Impfung erforderlich. Die aktuelle Verordnung zum
Schutz gegen die Geflügelpest (Geflügelpest-Verordnung in der Fassung der
Bekanntmachung vom 8. Mai 2013, BGBl. I S. 1212) weist darauf hin, dass die
Vorschriften der Geflügelpest-Verordnung in der Fassung der Bekanntmachung vom
20. Dezember 2005 (BGBl. I S. 3538) hinsichtlich der Newcastle-Krankheit weiter
anzuwenden sind.
2.2 Impfung gegen die Newcastle Disease
2.2.1 Einleitung
Eine Impfung gegen die ND wird in Ländern durchgeführt, in denen virulente Stämme
der ND endemisch sind. Auch in Ländern ohne Vorkommen von virulenten Stämmen,
in denen aber durch niedrig virulente Stämme signifikante wirtschaftliche Verluste
während der Aufzucht bei Zucht- oder Legehennen oder in der Broilermast
verursacht werden, müssen Impfungen durchgeführt werden (SENNE et al. 2004).
Das Prinzip der Impfung besteht in der Induktion einer immunologischen Antwort
gegen das Virus, ohne eine Erkrankung auszulösen. Inaktivierte Vakzinen sind
abgetötete oder abgeschwächte Viren die dem Vogel direkt injiziert werden. Nicht
virulente oder lentogene Virusstämme können dem Vogel lebend verabreicht werden
und fallen unter die Kategorie Lebendimpfstoffe. Als dritte Kategorie stehen nach
neueren Entwicklungen rekombinante Impfstoffe zur Verfügung, bei denen ein
Trägervirus fremdes genetisches Material exprimiert.

18
2.2.2 Lebendimpfstoffe
Als Lebendvakzinen werden asymptomatische enterische (avirulente), mesogene
oder lentogene Virusstämme verwendet, welche lebend verabreicht werden und sich
im Wirt vermehren können. Ihre Herstellung ist verhältnismäßig einfach und sie
können über das Trinkwasser oder als Spray verabreicht werden. Einzelne Tiere
können über Augentropfen geimpft werden. Mesogene Virusstämme werden
aufgrund ihrer Virulenz nur in ND-endemischen Ländern eingesetzt und
intramuskulär oder über die Wing-Web-Methode verabreicht. Die weltweit am
meisten verwandten und bekanntesten Impfvirusstämme sind der APMV-1 Stamm
LaSota, F und Hitchner B1, welche um 1940 in den USA entwickelt wurden. Seltener
werden die Stämme Ulster und V4 (lentogene Stämme) eingesetzt (SENNE et al.
2004). Die Verabreichungsdosis bei lentogenen Impfstoffen beträgt 10 6.5 EID 50
(ALLAN u. LANCASTER 1978).
Folgende mesogene Stämme werden als Lebendvakzinen genutzt: Roakin,
Komarov, Hertfordshire (H) und Mukteswar (CZEGLEDI et al. 2003). Die Stämme
sind nach der OIE Definition Auslöser der Newcastle Disease, da sie einen
intrazerebralen Pathogenitätsindex von oder über 0,7 aufweisen (OIE 2008).
Mesogene Lebendimpfstoffe sollten nicht bei Tieren unter acht Wochen oder als
Primärimmunisierung eingesetzt werden, da sie schwerwiegende Erkrankungen in
voll empfänglichen Herden hervorrufen können (MEULEMANS 1988).
Der APMV-1 Stamm LaSota ist potenter in der Induktion einer Immunantwort als
Hitchner B1 und dadurch auch virulenter. Deswegen wird der APMV-1 Stamm
LaSota häufig nach einer intitialen B1 Impfung als Booster eingesetzt (SENNE et al.
2004).
Lebendimpfstoffe können auch mit Adjuvantien wie Aluminiumhydroxidgel parenteral
verabreicht werden. Lebendimpfstoffe bieten den Vorteil, dass nicht-geimpfte Tiere
von ausscheidenden Tieren angesteckt werden und somit ebenfalls Impfschutz
erhalten. Sie stimulieren lokale und systemische Immunität und rufen eine schnelle
Protektion hervor. Als nachteilig erweist sich ihr Potential, eine klinische Erkrankung
hervorzurufen. So sollte zum Beispiel der APMV-1 Stamm LaSota nicht als

19
Primärimpfung bei sehr jungen Tieren eingesetzt werden, da nach der Impfung
respiratorische Symptome auftreten können (ALEXANDER u. BELL 2004). Auch
maternale Immunität kann eine ausreichende Immunisierung verhindern. Um einer
virulenten ND-Infektion vorzubeugen, bedarf es mehrerer Lebendvirusimpfungen
oder einer Kombination aus Lebendvirusimpfung mit inaktivierten Öl-Adjuvant
Impfstoffen. Aber jedoch kann selbst ein hoher Antikörpertiter eine ND Infektion und
Virusauscheidung oftmals nicht verhindern (SENNE et al. 2004). Tabelle 2 zeigt die
intrazerebralen Pathogenitätsindices von verschiedenen Impfstämmen.
Tabelle 2 : Virusstämme als Lebendimpfstoffe gegen die Newcastle Disease
Virus Pathotyp ICPI
Queensland V4 avirulent 0
Ulster 2C avirulent 0
VG/GA lentogen 0,03*
Clone 30 lentogen 0,11*
Hitchner B1 lentogen 0,2
F (Asplin) lentogen 0,25
La Sota lentogen 0,4
Mukteswar mesogen 1,4
(modifiziert nach Alexander 2008, Diseases of Poultry 11 th edition, * = (MA et al.
2009))
2.2.3 Inaktivatvakzinen
Inaktivatvakzinen werden aus infektiöser Allantoishöhlenflüssigkeit gewonnen,
nachdem das Virus in embryonierten Eiern angezüchtet wurde. Das Virus wird
hierbei mit Formalin oder β-Propiolacton abgetötet und nachfolgend mit einem
Adjuvans, wie Aluminiumhydroxid oder mit Öl zu einer Emulsion vermischt (STONE
1997). Öl-basierte Inaktivatimpfstoffe sind immunogener als Aluminiumhydroxidbasierte
Inaktivatimpfstoffe (MEULEMANS 1988). Die Applikation erfolgt entweder
subkutan oder intramuskulär. Inaktivierte NDV Impfstoffe werden häufig bei
Elterntieren in Kombination mit Lebendimpfstoffen kurz vor der Eiablage eingesetzt,
um möglichst hohe maternale Antikörpertiter zu erreichen (VAN ECK 1990).

20
Inaktivierte Impfstoffe sind verhältnismäßig teuer in ihrer Herstellung und
umständlicher zu verabreichen, da jedes Tier einzeln geimpft werden muss. Sie
interferieren jedoch nicht so stark mit maternaler Immunität wie Lebendimpfstoffe.
Generell induzieren Inaktivatimpfstoffe keine mukosalen Immunmechanismen,
jedoch zeigte eine Studie von 2008 eine Erhöhung von IgG- Antikörpern in Trachealund
Nasalwaschungen nach Impfung mit einer Inaktivatvakzine (CHIMENO ZOTH et
al. 2008), was mit erhöhten Anti-NDV-IgG-Typ Antikörpertitern in Verbindung stehen
könnte, die durch das Inaktivat induziert werden.
2.2.4 Zukunftsentwicklungen
Alternativen zu herkömmlichen Newcastle Disease Vakzinen, wie die HN-Expression
in transgenen Nicotiana benthamiana- und Reispflanzen (GOMEZ et al. 2009)
(YANG et al. 2007), die Entwicklung von Immune Stimulating Complexes (ISCOMs)
(HOMHUAN et al. 2004) oder Virosomen (KAPCZYNSKI u. TUMPEY 2003) oder
Virus-Like-Particles (MCGINNES et al. 2010) (PANTUA et al. 2006) bieten neue
Ansätze zur Immunisierung. Die in-ovo Impfung zum Zeitpunkt des Überführens der
Eier in den Schlupfbrüter mit ND-Lebendimpfstoffen liefert zurzeit keine
befriedigenden Schlupfresultate (DILAVERIS et al. 2007) (RAMP et al. 2012).
2.2.5 Impfstrategien
Impfprogramme und –zeitpunkte sollten immer folgende Faktoren berücksichtigen:
Maternale Immunität, Gesundheitszustand der Herde, Interferenz mit anderen
Impfstoffen, Größe und Alter der Herde, sowie die aktuelle endemische Lage der
Newcastle Disease in den jeweiligen Gebieten. Die angestrebte Protektion, der
Immunstatus der Tiere, der lokal vorkommende Virustyp, die Verabreichungsart der
Vakzine sowie das Überwachen der Immunantwort sind ebenfalls wichtige Parameter
(ALLAN u. LANCASTER 1978). Ein angestrebtes Ziel bei der Immunisierung einer
Herde ist ein möglichst homogener Antikörpertiter der gesamten Herde. Bei Bezug
von Eiern verschiedener Elterntierherden mit unterschiedlichem Immunstatus der

21
Elterntiere muss auch immer der dadurch resultierende Unterschied in der passivübermittelten
Immunität beachtet werden. Bei unterschiedlich ausgeprägten
Antikörpertitern innerhalb einer Herde kommt es zu keiner homogenen
Immunisierung durch eine Lebendvakzine, da diese unterschiedlich stark durch
maternal-übertragene Antikörper gehemmt wird. Bei einer Newcastle Infektion würde
das zum Beispiel die Krankheitsdauer einer Herde verlängern, da Teile der Herde
während der Erkrankung durch zeitlich versetztes Nachlassen der Antikörpertiter neu
erkranken können (ALLAN 1975).
2.2.5.1 Impfprogramme
Bei Impfprogrammen gegen die ND müssen die Virulenz des Impfvirus sowie die
Immunkompetenz der Tiere aufeinander abgestimmt werden. Auch Impfungen gegen
andere Krankheiten, die in der Herde durchgeführt werden, müssen berücksichtigt
werden (ALLAN 1975).
2.2.5.1.1 Hühner
Legehennen werden generell in den ersten fünf Lebenswochen mit Hitchner B1 über
das Trinkwasser oder über Aerosol erstmalig immunisiert. Eine Revakzination erfolgt
um die 10. Lebenswoche mit dem APMV-1 Stamm LaSota oder bei Legebeginn und
Transfer in die Produktionseinheit entweder mit dem APMV-1 Stamm LaSota oder
einer inaktivierten Vakzine. Abhängig vom Vorkommen der ND in dem Gebiet des
Bestands werden verschiedene Impfstrategien angewandt. Hat die ND eine niedrige
Inzidenz und kommt nur sporadisch mit sehr milden Verläufen in der entsprechenden
Region vor, in der die Herde immunisiert werden soll, so kann eine Impfung am 1.-5.
oder am 18.-21. Tag mit einem milden lentogenen Stamm wie zum Beispiel B1 durch
Aerosol oder über das Trinkwasser verabreicht werden. Der APMV-1 Stamm LaSota
kann ebenfalls am 18.-21. Tag über das Trinkwasser oder am Tag 70 zur
Revakzinierung eingesetzt werden. Als „Point of Lay“ Impfung, also eine Impfung ab
der Legeperiode, kann ebenfalls der APMV-1 Stamm LaSota eingesetzt werden,

22
wobei es gelegentlich zu Legeleistungsdepressionen kommt (ALLAN 1975). In
Gebieten, in denen ND mit schwereren Verläufen endemisch ist, sollte eine
Grundimmunisierung am 1.-5. Tag mit einem milden lentogenen Stamm wie B1 über
Sprayanwendung stattfinden und zusätzlich am 21. und am 35.-42. Lebenstag eine
Revakzinierung mit B1. Nachfolgend kann zur Revakzinierung ab dem 70. Lebenstag
ein mesogener Impfstamm oder ein Inaktivatimpfstoff eingesetzt werden, welcher
auch zu Beginn der Legeperiode genutzt werden kann.
2.2.5.1.2 Broiler und Puten
In der Broilermast ist aufgrund der kurzen Lebensdauer der Tiere ein genaues
Abstimmen des Impfzeitpunkts besonders wichtig. Generell werden Broiler einmal
innerhalb der ersten beiden Lebenswochen entweder über Spray-, Aerosol- oder
über das Trinkwasser mit den APMV-1 Stämmen Hitchner B1 oder LaSota vakziniert.
Die Immunisierung junger Puten erfolgt mit dem APMV-1 Stamm LaSota durch
Augentropfen oder intranasale Instillation, Spray oder Aerosol. Hierbei können
zellproliferative histologische Veränderungen in der Trachea auftreten, welche sich
aber nach vier bis sechs Tagen wieder normalisieren (MEULEMANS 1988).
Eintagsputenküken mit maternaler Immunität können mit APMV-1 Stamm LaSota in
Kombination mit einem Inaktivatimpfstoff erfolgreich immunisiert werden
(MEULEMANS 1988). Eine Revakzinierung kann in der 5. Woche erfolgen (YADIN
1976).
2.2.6 Einschätzen des Impferfolgs
Die Anwesenheit von neutralisierenden Antikörpern gegen NDV schützt vor klinischer
Erkrankung, jedoch wird eine Infektion mit Virusvermehrung und Ausscheidung im
Wirt nicht verhindert (REYNOLDS u. MARAQA 2000a). Zur Einschätzung einer
Immunantwort auf eine ND-Impfung sind der HAH-Test und ELISA geeignete Mittel
(SIEGMANN 1973). Eine Herdenprotektion ist nach einer Studie von van Boven et al.
erst dann erreicht, wenn über 85 Prozent der Herde einen HAH- Antikörpertiter höher

23
gleich 2 3 besitzen (VAN BOVEN et al. 2008). Feldstudien zeigen, dass nur Tiere
einer Herde mit einem Titer von oder über 2 4 eine virulente ND-Infektion überleben
(KAPCZYNSKI u. KING 2005). Frühere Angaben gehen von HAH-Titern über 2 5 oder
höher aus, um eine Herde zu schützen (ALLAN u. LANCASTER 1978). Trotz
nachgewiesener Aktivität von rHVT-ND im HAH-Test (PALYA et al. 2012) kann
dessen Protektivität laut Kapczynski et al. nicht durch Anwesenheit von HAH-
Antikörpern eingeschätzt werden (KAPCZYNSKI et al. 2013). In einer Studie von
Palya et al. (PALYA et al. 2012) stellte sich rHVT-ND jedoch positiv im HAH-Test dar.
Bestimmte ELISA Kits eignen sich zur Erfassung der Impfantwort rekombinanter
Viren ab dem 35. Tag nach subkutaner oder in-ovo Impfung (SLACUM 2012).
Jedoch sind noch weitere Parameter neben systemischer humoraler Immunität
ausschlaggebend für eine Protektivität, wie lokale Immunmechanismen und zellvermittelte
Immunität (CMI). CMI allein, ohne Anwesenheit von neutralisierenden
Antikörpern, schützt nicht vor einer velogenen Newcastle Disease Challenge
(REYNOLDS u. MARAQA 2000b). Jedoch reicht bei hoher CMI ein sehr niedriger
Antikörpertiter, um eine Protektion herbeizuführen (CANNON u. RUSSELL 1986),
wodurch die CMI erheblich zum Immunschutz beiträgt. Systemische Immunität allein
ist ebenfalls nicht protektiv, lokale Immunität trägt grundlegend zur Protektion bei
(MALKINSON u. SMALL 1977).
2.2.7 Rekombinante Impfstoffe
Rekombinante Impfstoffe oder Vektorimpfstoffe sind eine neue Generation von
Impfstoffen, bei denen Fremdgene in das Genom eines Trägervirus (viraler Vektor)
integriert werden. Das Fremdgen wird hierbei in Plasmiden kloniert, von Vektor-DNA
Sequenzen flankiert und in die Zelle transfiziert. Das Plasmid enthält eine
Vektorsequenz, welche durch eine „Expressionskassette“ unterbrochen ist. Diese
Expressionskassette besteht aus einem Promotor des Virusvektors und einer
einmaligen Restriktionsschnittstelle für die Spaltung und Verbindung mit der Vektor-
DNA. Dahinter befindet sich die Fremdgensequenz. Durch DNA Rekombination
während der Virusreplikation in der Zelle wird das Gen in die komplette Vektor-DNA

24
integriert. Die Immunantwort des Wirts richtet sich somit gegen Vektorproteine und
das Fremdantigen. Als Vektoren eignen sich große persistierende DNA- oder RNA-
Viren, wie zum Beispiel Adenoviren, Herpesviren, Pocken- und Paramyxoviren
(MOSS 1991). rHVT-ND kann entweder als selbständig replizierendes Lebendvirus
in-ovo am 18. Bebrütungstag oder am ersten Lebenstag intramuskulär, subkutan,
intraperitoneal oder intravenös verabreicht werden (COCHRAN 1999).
2.2.7.1 Das Putenherpesvirus als Vektor
Die Mareksche Erkrankung oder auch Marek’s Disease (MD) ist eine
lymphoproliferative Erkrankung des Hausgeflügels, welche Veränderungen an
peripheren Nerven und viszeralen Organen verursacht. Sie tritt bei Hühnern ab der
3.-4. Lebenswoche und am häufigsten zwischen der 12. und 30. Lebenswoche auf.
Als klinische Symptome zeigen sich Paralysen der Gliedmaßen mit einhergehender
Vergrößerung der peripheren Nerven (SWAYNE et al. 1989). Virulente MD–
Virusstämme können auch besonders bei Abwesenheit von maternalen Antikörpern
die Mortalität bei Hühnern zwischen der ersten und zweiten Lebenswoche durch
Immunsuppression erhöhen. Abhängig vom beteiligten Virusstamm können
Lymphome in Ovar, Leber, Milz, Nieren, Lunge, Herz und Proventrikulus und Haut
vorkommen. Diese bestehen hauptsächlich aus lymphoiden Zellen (OIE 2010).
Das Mareks Disease Virus (MDV) ist ein zell-assoziiertes Alphaherpesvirus und
gehört zu den DNA-Viren. Die 3 Serotypen werden als Gallid Herpesvirus 2 ( Serotyp
1), Gallid Herpesvirus 3 (Serotyp 2) und Meleagrid Herpesvirus 1 (Serotyp 3) oder
auch Herpesvirus of Turkeys (HVT) bezeichnet (SCHAT 2008). Viren vom Serotyp 1
können onkogene Eigenschaften besitzen, Viren des zweiten und dritten Serotyps
nicht. HVT wird als Impfvektor genutzt, hat ein 160 kbp langes Genom und beinhaltet
über 99 Gene, wovon die meisten homolog mit anderen MD-Viren sind (AFONSO et
al. 2001). HVT Impfstoffe können als zell-assoziiertes oder zell-freies Virus appliziert
werden und induzieren innerhalb von fünf Tagen eine starke zell-vermittelte
Immunantwort gegen virulente MDV-Stämme (SONDERMEIJER et al. 1993).

25
2.2.7.1.1 Konstruktion von rHVT-ND
HVT kann genetisch so modifiziert werden, dass es virusfremde Glykoproteine des
Infektösen Bursitis Virus, des Marek’s Disease Virus, des Newcastle Disease Virus,
des Infektiösen Laryngotracheitis Virus oder des Infektiösen Bronchitis Virus
exprimiert (COCHRAN 1999). Der Vektor für die rekombinante Vakzine rHVT-ND in
diesem Falle ist der HVT PB1-Stamm (CHURCHILL et al. 1973; SONDERMEIJER et
al. 1993). Der Einsatz des Putenherpesvirus (HVT) als Vektor gegen die ND, welcher
das F- oder/und das HN-Protein exprimiert, stellt eine Alternative zu herkömmlichen
ND-Vakzinen dar (MORGAN et al. 1992). Zur Insertion des F-Gens wurde eine
Region auf dem einzigartigen kurzen Sequenzelement/Unique Short Segment (U S )
des Virus ausgewählt, basierend auf der von Igarashi et al. publizierten
Restriktionskarte von HVT (IGARASHI et al. 1987). Das F-Gen des rHVT-ND
befindet sich an der BG/II Restriktionsstelle an Position 138193 des HVT-Genoms.
Das F-Gen stammt von einem aus embryonierten Hühnereiern vermehrtem APMV-1
Clone 30 Stamm. Die HVT Unique Short Region U S und das F-Gen wurden in
Lambda Insertionsvektoren geklont. Anschließend erfolgte ein Co-Transfektion der
Plasmide mit HVT DNA in Hühnerembryo-Fibroblastenkultur. Die Selektion des F-
Protein exprimierenden rekombinanten Virus erfolgte mittels Immunfluoreszenz.
rHVT-ND zeigt eine Viruspersistenz bis zu acht Wochen (REDDY et al. 1996). Die
Expression des F-Genes ist 30 Wochen nach einer Administration von rHVT-ND
noch messbar (COCHRAN 1999). Die Interferenz mit maternalen Antikörpern gegen
das NDV ist bei rHVT-ND nicht so hoch wie bei herkömmlichen Lebendimpfstoffen
(MORGAN et al. 1993). Die Verabreichung ist sicher und hat keinen Einfluss auf die
Schlupfrate oder das Überleben der Tiere, wie in einem Versuch mit in-ovo geimpften
spezifisch-pathogen freien SPF-Hühnern gezeigt wurde (REDDY et al. 1996; PALYA
et al. 2012). Serologische Immunantworten bilden sich langsamer aus als bei
Lebendimpfstoffen und sind erst ab der vierten Woche detektierbar (MORGAN et al.
1992; PALYA et al. 2008).

26
2.3 Immunität gegen die Newcastle Disease
Die Immunität gegen die Newcastle Disease kann in humorale, zellvermittelte und
lokale Immunität eingeteilt werden. Zusätzlich wird zwischen angeborenen und
erworbenen Immunmechanismen unterschieden. Eine Virusanheftung und –
verbreitung wird generell durch gegen F- und HN-Proteine gerichtete
neutralisierende Antikörper eingeschränkt und virusbefallene Zellen werden durch
natürliche Killerzellen (NK-Zellen) und zytotoxische T-Zellen abgetötet
(KAPCZYNSKI et al. 2013).
2.3.1 Angeborene Immunmechanismen
Als angeborene Immunmechanismen werden infektionslimitierende Faktoren
bezeichnet, welche schon vor einem primären Erregerkontakt im Wirt existieren und
auf ein Eindringen von Mikroorganismen reagieren können. Beim Geflügel sind das
physikalischen Barrieren wie Federn, Haut und lokale Schleimproduktion,
phagozytierende Zelltypen wie NK-Zellen und Makrophagen, das
Komplementsystem sowie Zytokine und Interferone (KAPCZYNSKI et al. 2013). In
der initialen Phase der Infektion werden durch Pattern Recognition Receptors (PRR),
Toll-Like Receptors (TLR) oder Nucleotide-Binding Oligomerization Domain Proteins
(NOD) Mikroben anhand ihrer spezifischen Muster, den PAMPs (Pathogen-
Associated Molecular Patterns) erkannt. Diese induzieren intrazelluläre Signale,
welche Gene für proinflammatorische Zytokine, anti-apoptotische Faktoren und
antimikrobielle Peptide aktivieren (KAPCZYNSKI et al. 2013). Bei einer NDV-
Infektion produzieren periphere mononukleare Blutlymphozyten und heterophile
Granulozyten Stickoxid. Eine Hochregulation von Interferon-α und Interferon-β mRNA
kann in Makrophagen, Interferon-γ mRNA in peripheren mononukleären
Blutmonozyten detektiert werden (CRIPPEN et al. 2003; AHMED et al. 2007).
Interferon-γ wird später von NK-Zellen gebildet, welche auch direkt virusinfizierte
Zellen töten, und aktiviert einen Tag nach Infektion die zellulär-vermittelte Immunität
(CMI) (LOWENTHAL et al. 1995; REYNOLDS u. MARAQA 2000a, b).

27
2.3.2 Zellvermittelte Immunität
Zellvermittelte Immunität (CMI) bedeutet eine spezifisch erworbene, durch T-Zellen
(CD4+ T-Helferzellen und CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten) erzeugte Immunität,
welche einen wichtigen Faktor zur Entwicklung einer Protektion gegen eine NDV
Infektion darstellt und zur lokalen Virusreduktion durch Abtöten von infizierten Zellen
beiträgt (RUSSELL et al. 1997; REYNOLDS u. MARAQA 2000b). Ebenfalls findet
eine Aktivierung von B-Zellen und Makrophagen statt. Die CMI allein reicht nicht aus,
um den Wirt vor einer ND Belastungsinfektion zu schützen, jedoch spielt die Menge
der IFN-γ-Bildung, welches von NK-Zellen und T-Zellen gebildet wird, in der
Reduktion der Mortalität und Morbidität einer ND Erkrankung eine Rolle (SUSTA et
al. 2013). Ein Zusammenspiel von CMI und antikörpervermittelter Immunität ist
essentiell für den Schutz vor ND. Beispielsweise verstärkt das von T-Zellen gebildete
Interleukin-4 die humorale Immunantwort (SAWANT et al. 2011). Ebenso werden bei
einer ND höhere Antikörpertiter bei höheren Werten von durch Markophagen
gebildetem Stickoxid beobachtet (GUIMARAES et al. 2011).
2.3.3 Humorale Immunität
Antikörper sind die Schlüsselregulatoren zur Bekämpfung einer NDV-Infektion
(KAPCZYNSKI et al. 2013). Sie können mittels des
Hämagglutinationshemmungstestes (HAH), des Enzyme-Linked Immunosorbent
Assays (ELISA) oder des Virusneutralisationstestes (VNT) bestimmt werden.
Humorale Immunantworten sind normalerweise sechs bis zehn Tage nach
Impfung/Infektion lokal sowie systemisch im Blut messbar. Nach NDV Kontakt
differenzieren B-Lymphozyten zu Plasmazellen, welche 3 Typen von
antigenspezifischen neutralisierenden Antikörpern bilden: IgG (=IgY), IgM und IgA.
Das Hühner-Aquivalent zum IgG der Säugetiere wird auch als IgY bezeichnet und
weist einige strukturelle Unterschiede auf. Als erstes wird IgM produziert und ist vier
Tage nach NDV-Infektion nachweisbar. IgY und IgA werden 7 Tage nach Infektion
gebildet (AL-GARIB et al. 2003).

28
2.3.4 Maternal vermittelte Immunität
Elterntiere mit NDV Antikörpern übertragen diese über den Dottersack an ihre
Nachkommen (HELLER et al. 1977). Im Eidotter finden sich hauptsächlich IgG-
Immunglobuline, wohingegen im Eiweiß IgA und IgM als Resultat mukosaler
Sekretion des Oviduktes dominieren (ROSE et al. 1974; HAMAL et al. 2006). Der
Transfer von IgG von dem Elterntier in das Hühnerei läuft folgendermaßen ab: IgG
wird aus dem Blut der Henne in das Eigelb übertragen (CUTTING u. ROTH 1973)
und findet dann über den embryonalen Kreislauf in das Küken. Die Menge an
Antikörpern, welche durch den Dottersack resorbiert wird, ist proportional zur
maternalen IgG Serum Konzentration (AL-NATOUR et al. 2004).
2.3.5 Lokale Immunität
Schleimhautoberflächen des Respirations-, Gastrointestinal- und Urogenitaltraktes
sind Haupteingangspforten für Pathogene. Die den Schleimhautoberflächen
zugrunde liegenden lymphoiden Gewebe werden in ihrer Gesamtheit als mucosaassociated
lymphoid tissues (MALTs) bezeichnet. Das MALT kann in gut associated
lymphoid tissue (GALT), bronchus-associated lymphoid tissue (BALT), headassociated
lymphoid tissue (HALT) und conjunctiva-associated lymphoid tissue
(CALT) unterteilt werden. Die Schleimhautoberflächen sind stark mit Immunzellen
besiedelt, deren Plasmazellanteil lokal hauptsächlich IgA produziert. IgG und IgM
sind jedoch auch in den lymphoiden Geweben zu finden (JEURISSEN et al. 1989).
Die lymphoiden Elemente des MALTs liegen entweder organisiert vor und bilden
mukosale Lymphfollikel, welche für die Induktionsphase der Immunantwort
verantwortlich sind oder unorganisiert diffus, wobei sich Leukozyten im ganzen
Epithel und dessen Lamina propria verteilen und die Effektorstelle bilden (MONTILLA
2004). Dadurch, dass Hühner keine Lymphknoten wie Säugetiere besitzen, ist das
MALT beim Huhn sehr umfangreich (JEURISSEN et al. 1989).
Lokale Immunität kann anhand des IgA Gehaltes in Tränenflüssigkeit,
Trachealspülungen und Gallenflüssigkeit nach intranasaler Verabreichung oder
Augentropfen von ND-Lebendimpfstoffen eingeschätzt werden. Die IgA-Antikörper

29
sind verantwortlich für die Neutralisierung freier Virionen (RUSSELL u. EZEIFEKA
1995; PEROZO et al. 2008). Auch IgM-Antikörper werden lokal produziert. IgG findet
sich gleichfalls lokal, eine Transsudation aus dem Blut kann hier als mögliche
Ursache gesehen werden (AL-GARIB et al. 2003).
Eine Messung der lokalen Immunität kann auch durch die Bestimmung lokaler
Immunzellpopulationen erfolgen (DUMRONGSOONTORNCHAI 1999). Nach
Newcastle Disease Impfung/Infektion finden sich vermehrt lokale T- und B-
Zellpopulationen und Makrophagen im oberen Respirationstrakt, welche eine lokale
Protektion gegen die ND erzeugen (RUSSELL et al. 1997;
DUMRONGSOONTORNCHAI 1999).
2.3.5.1 Lokale Immunität im Bereich der Harderschen Drüse
Die Hardersche Drüse (Glandula membranae nictitans) oder auch Nickhautdrüse
sitzt hinter beiden Augäpfeln retrobulbär ventral und medial zum interorbitalen
Septum und produziert hauptsächlich Tränenflüssigkeit sowie ein mukoides
lipidhaltiges Sekret, welches die Nickhaut und Kornea befeuchtet und sauber hält
und zudem auch immunogene Faktoren enthält (BUZZELL 1996). Beim Huhn ist die
Drüse verhältnismäßig groß, exokrin und tubuloazinös. Sie selbst besitzt kein
Schleimhautgewebe und keine spezifisch funktionellen Abwehrmechanismen wie ein
dichtes Lymphepithel, hochendotheliale Venolen oder follikelartige Ansammlungen
von intraepithelialen Lymphozyten (BANG u. BANG 1968). B-, T-Lymphozyten sowie
Plasmazellen befinden sich im interstitiellen Gewebe. Das IgA-haltige Sekret der
Harderschen Drüse gelangt in den Bereich des Augenlids und von dort aus über den
Tränennasenkanal in den oberen Respirationstrakt. Daher sind die Hardersche
Drüse sowie auch das Konjunktiva-assoziierte Lymphgewebe (CALT) beim Huhn
funktionelle Organe der lokalen Immunität des Respirationstrakts, obwohl sie
anatomisch nicht dazugehören (SMIALEK et al. 2011). Bei einer NDV Infektion
steigen B- und T-Zellpopulationen in der Harderschen Drüse an (RUSSELL et al.
1997), wobei der höchste Anstieg bei CD8+ Zellen zu verzeichnen ist. Bei lokaler

30
Virusreplikation einer ND steigen lakrimale Immunglobuline aller Klassen an
(RUSSELL 1993).
2.3.5.2 Lokale Immunität im Bereich des Konjunktiva-assoziierten
lymphoiden Gewebes/Conjunctiva-associated lymphoid tissue
(CALT)
Das Konjunktiva-assoziierte Lymphgewebe befindet sich in den Falten des oberen
und unteren Augenlids und bildet zusammen mit der Harderschen Drüse die
wichtigsten paraokularen Immunstrukturen (VAN GINKEL et al. 2012). Eine Woche
nach dem Schlupf ist im unteren Augenlid eine heterogene Lymphoyzytenpopulation
mit Lymphoblasten und Makrophagen zu finden. Nach 4 Wochen befinden sich dort
Plasmazellen und B-Zell Keimzentren (FIX u. ARP 1991). Im erwachsenen Vogel
befinden sich B-Zellen, T-Helfer- und zytotoxische T-Zellen mit einer ähnlichen
Verteilung wie die Lymphozytenpopulationen in der Harderschen Drüse im CALT
(VAN GINKEL et al. 2012). T-Lymphozyten umranden die B-Zellreichen
Keimzentren, wobei CD3+ T-Lymphozyten in der vierten Lebenswoche dominieren.
CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten-Konzentrationen steigen ab der ersten bis zur
vierten Lebenswoche an, was die Spekulation zulässt, dass das CALT circa vier
Wochen zur Reifung braucht (VAN GINKEL et al. 2012).
2.3.5.3 Lokale Immunität im Bereich der Trachea
Ein weiterer Bestandteil der lokalen Immunität des oberen Respirationstraktes ist die
Schleimhaut der Trachea, welche allerdings kein funktionelles Lymphgewebe besitzt.
In zwei Wochen alten Hühnern befinden sich IgM+, IgG+ und IgA+ Plasmazellen
unterhalb des Trachealepithels (JEURISSEN et al. 1989). Die Schleimhaut reagiert
im Falle einer experimentellen Mykoplasma gallisepticum-Infektion mit B-
Zellinfiltrationen und der Entstehung von sekundären Lymphfollikeln aus B-Zellen,
welche mit CD4+ Zellen umrandet sind (GAUNSON et al. 2006). Bei einer Newcastle

31
Disease verliert das Epithel seine Zilien und Lymphozyten sowie heterophile
Granulozyten wandern in die Epithelschicht ein (KOTANI et al. 1987).
2.3.5.4 Bronchus-assoziiertes Lymphgewebe/Bronchus Associated
Lymphoid Tissue (BALT)
Bienenstock et al. beschrieben 1973 das erste Mal organisierte lymphoide
Zellansammlungen und Strukturen in der Bronchialschleimhaut von Hühnerlungen
(BIENENSTOCK et al. 1973), welche sich an den Verbindungen von primären zu
sekundären Bronchien sowie an den Ostien zu den Luftsäcken befinden (MYERS u.
ARP 1987; VAN ALSTINE u. ARP 1988; FAGERLAND u. ARP 1993b). Das
Bronchus-assoziierte lymphoide Gewebe (BALT) besteht aus lymphozytären
Ansammlungen, welche durch eine deutliche Lymph-Epithelzellschicht, dem
sogenannten Lymphothel oder Follikel-assoziiertem Epithel (FAE), abgedeckt sind
(FAGERLAND u. ARP 1993a).
In sechs bis acht Wochen alten Hühnern befinden sich Keimzentren in den meisten
Lymphfollikeln des BALTs sowie Plasmazellen, Makrophagen und heterophile
Granulozyten (FAGERLAND u. ARP 1993b).
2.3.5.5 Lokale Immunität im Bereich der Zäkaltonsille
Die Zäkaltonsille ist Teil des darmassoziierten lymphatischen Gewebes (GALT)
(LILLEHOJ u. TROUT 1996). Sie besteht aus großen lymphoiden Zellansammlungen
in der Zellwand der Zäka an ihrem Eingang in das Rektum (CASTELEYN et al.
2010). Die Zellansammlungen bilden tonsillenartige Einheiten, welche durch
bindegewebige Septen voneinander getrennt sind, mit einer zentral gelegenen
Furche, welche sich in Krypten aufzweigt und direkten Kontakt zum Lumen des
Zäkums hat. Die Krypten besitzen auf ihrer Oberfläche ein hochprismatisches Epithel
mit integrierten M-Zellen. Die schon embryonal vorhandenen Zäkaltonsillen
entwickeln sich direkt nach dem Schlupf. Am ersten Tag können bereits B- und T-
Lymphozyten in der Zäkaltonsille nachgewiesen werden, wobei T-Lymphozyten

32
überwiegen. Nach sechs Wochen steigt die Anzahl der B-Lymphozyten signifikant
gegenüber den T-Lymphozyten an (GOMEZ DEL MORAL et al. 1998).
Die genaue Funktion der Zäkaltonsillen ist nicht geklärt. Nach Kitawa et al. (1998)
wird vermutet, dass sie zur Neutralisierung der Antigene beitragen, welche durch den
Harnsäurereflux in das Zäkum getragen werden (KITAGAWA et al. 1998).
Lerner et al. (1971) spekulieren hingegen, dass die Zäkaltonsille Bursa cloacalisähnliche
Eigenschaften besitzt, da Hühner bei einer Zerstörung der Bursa immer
noch spezifische Antikörper bilden können (LERNER et al. 1971). Die Zäkaltonsille
könnte daher eine Rolle bei der Differenzierung von Stammzellen zu funktionalen B-
Lymphozyten spielen (BEFUS et al. 1980; CASTELEYN et al. 2010).
Im Falle einer experimentellen Newcastle Disease Infektion konnten Gohm et al. vier
Wochen nach Infektion Blutungen und Nekrosen in der Zäkaltonsille feststellen
(GOHM et al. 2000). Bei einer intranasalen Newcastle Disease Impfung in SPF-
Hühnern in Kombination mit immunstimulatorischen CpG-Oligodeoxynucleotiden
zeigten Zhang et al. signifikant höhere IgA-Antikörpergehalte in intestinalen
Waschungen und Kot von geimpften Tieren im Vergleich zu ungeimpften Tieren
(ZHANG et al. 2008).
Nach einer Newcastle Disease Augentropfenimpfung zeigte sich eine signifikante
Erhöhung von IgG+ Zellen im Vergleich zu IgA+ und IgM+ Zellen in Zäkaltonsillen 14
und 28 Tage nach der Impfung (NASRIN et al. 2013). Da die Zäkaltonsillen einen
Hauptanteil des GALT darstellen, einen hohen Anteil an Lymphozyten besitzen
(JANARDHANA et al. 2009) und sich bei einer Newcastle Disease im
Krankheitsgeschehen verändert zeigen, könnten sie eine wesentliche Rolle in der
Bildung der lokalen Immunität gegen NDV spielen.

33
3 Fragestellung der eigenen Untersuchung
Die Interferenz mit maternalen Antikörpern ist oft von entscheidender Bedeutung für
einen Impferfolg einer Lebendvakzine gegen die Newcastle Disease (ND).
Rekombinante Impfstoffe wie ein rekombinantes Putenherpesvirus, welches das F-
Protein des NDV exprimiert, werden nicht durch maternale Antikörper gegen die ND
in der Ausbildung einer Immunität inhibiert und bieten daher eine interessante
Alternative zu herkömmlichen ND Lebendimpfstoffen. Die Möglichkeit zur in-ovo
Applikation der bivalenten Vakzine bietet zusätzlich Vorteile. rHVT-ND erzeugt
geringere Antikörpertiter als eine herkömmliche Lebendvakzine, bietet aber Schutz
vor einer ND Infektion. Eine Kombination von rHVT-ND mit einer Lebendvakzine
erzeugt eine länger anhaltende klinische Protektion als die alleinige Verabreichung
einer Lebendvakzine (PALYA et al. 2008). Die genauen Mechanismen dieser
Protektion sind jedoch nicht geklärt. Ob rHVT-ND lokale Immunmechanismen im
Bereich des oberen Respirationstrakts, der Haupteingangspforte von NDV induziert,
wie sie bei der Verabreichung von Lebendimpfstoffen beobachtet werden, ist unklar,
und ob sich eine Kombination von rHVT-ND und einem Lebendimpfstoff eventuell
synergistisch oder additiv auch auf diesen Bereich auswirkt, ist nicht bekannt.
In dieser Studie wurde die Wirkung eines rekombinanten Putenherpesvirus gegen
die ND (rHVT-ND) alleine und in Kombination mit einer ND-Lebendvakzine auf die
lokale und systemische Immunität sowie auf die lokale Virusausscheidung des
Respirationstrakts untersucht.
Es wurden zwei Tierversuche mit spezifisch pathogen-freien Hühnern und
kommerziellen Broilern durchgeführt, um diesbezüglich eine Nutzungslinienvergleichende
Aussage treffen zu können. Die lokale Virusausscheidung, die
Stimulation von lokalen Immunzellpopulationen und die Höhe des serologischen Anti-
NDV Antikörpertiters wurden nach Impfung und Belastungsinfektion untersucht. T-
und B-Immunzellpopulationen sowie Makrophagen wurden in Harderscher Drüse,
der Konjunktiva, der Lunge und der Zäkaltonsille an verschiedenen Tagen nach
Impfung dargestellt. Die Virusausscheidung und -übertragung wurden nach einer

34
Challenge mit dem lentogenen APMV-1 Stamm LaSota durch Real-Time PCR in
Trachea und im zweiten Versuch zusätzlich in der Kloake detektiert. Ebenfalls
wurden im zweiten Versuch der Anti-ND IgG-Antikörpergehalt in der
Tränenflüssigkeit sowie Milzzellen- und periphere Blut- und
Lymphozytenpopulationen untersucht.

35
4 Material und Methoden
4.1 Tiere
Es wurden 220 Eier (VALO SPF flock Nos. 10704) von SPF-Hühnern vom Legetyp
der Lohmann Tierzucht GmBH (Cuxhaven) bezogen. Diese wurden vom ersten bis
zum 17. Tag bei 37,8-38,0° C und 50 – 60% Luftfeuchtigkeit in einem Brutschrank
(Firma Grumbach, Asslar) vorbebrütet. Davon schlüpften 171 Küken, nachdem sie
drei Tage zuvor in den klinikeigenen Schlupfbrüter verbracht wurden, in der Klinik für
Geflügel, bei 37°C Temperatur und 70 % Luftfeuchtigkeit. 100 nicht geimpfte
kommerzielle Broiler-Eintagsküken vom Ross-308 Typ (Weser Ems Brüterei,
Rechterfeld) beiden Geschlechts wurden in die Stallungen der Klinik für Geflügel
verbracht. Die SPF-Hühner wurden mit einem Alleinfuttermittel für Legehennen „allmash
L“ (Firma Deuka) gefüttert. Die Broiler bekamen Landkornstarter (Firma Deuka)
in den ersten Tagen, danach Landkornmast (Firma Deuka). Futter und Wasser
wurden ad libitum bereitgestellt.
4.2 Impfstoffe
Für den ersten Versuch wurden rHVT-ND (Innovax®-ND, 4000 Dosen, Lot-Nr.:
91790017, Verfallsdatum: 05-2012) und eine auf dem FC126-Stamm basierende
HVT Vakzine (Nobilis® Marexine CA 126, 1000 Dosen, Lot-Nr: A267B,
Verfallsdatum: 04-2012) von der Firma MSD Tiergesundheit (Boxmeer, Niederlande)
zur Verfügung gestellt, in flüssigem Stickstoff transportiert und gelagert. rHVT-ND
wurde dann in einem vorgewärmten Wasserbad ca. 95 sec. bei 25°C aufgetaut und
so mit Nobilis Diluent CA (MSD Animal Health, 200 ml, Lot: LC 140) verdünnt, dass
eine Dosis 200µl enstprach. Eine Dosis enthielt 6180 Plaque Forming Units
(PFU/Dose (NDV-F)).
Der Impfstoff Clone 30 wurde in 35 Millilitern eines wässrigen Lösungsmittels (für
1000 Dosen, Diluent Oculo Nasal, B408A01, Verfallsdatum 06-2013, MSD

36
Tiergesundheit) verdünnt. Ein Tropfen entsprach einer Impfdosis von mind. 6,0 log 10
Embryo-infektiöse Dosis 50 % (EID 50 ). Der APMV-1 Stamm LaSota (Charge: A002D;
Code:027908, MSD Tiergesundheit) fungierte als Belastungsinfektionsvirus und
wurde ebenfalls mit einem wässrigen Lösungsmittel (für 1000 Dosen, Diluent Oculo
Nasal, B408A01, Verfallsdatum 06-2013, (MSD Tiergesundheit) verdünnt (1 Dosis:
mind. 6,0 log 10 EID 50 ).
Im zweiten Versuch wurde rHVT-ND (Innovax®-ND, 4000 Dosen, Lot-Nr.: 91790024,
Verfallsdatum: 01-2013 (MSD Tiergesundheit) mit 6945 PFU/Dose (200 µl)
eingesetzt. Der Titrationsstandard HVT CA 126 (Nobilis® Marexine CA 126, 1000
Dosen, Lot-Nr.: A267B, MSD Tiergesundheit) wurde als Kontrolle bei der rHVT-ND-
Impftitrierung verwendet. Der APMV-1 Stamm Lasota (Nobilis® ND LaSota, 1000
doses, Lot-Nr.: A002D, MSD Tiergesundheit) fungierte mit einer Dosis von mind. 6,0
log 10 EID 50 als Belastungsvirus. ND Clone 30 (Nobilis® ND Clone 30, 1000 Dosen,
MSD Tiergesundheit) wurde mit einer Dosis (mind. 6,0 log 10 EID 50 , ein Augentropfen
pro Tier) als Lebendvakzine per Augentropfen verwendet.
4.2.1 Titration des Impfvirus
Zur Bestätigung des Titers und Quantifizierung des Virusgehalts wurde rHVT-ND auf
sekundären Hühnerembryofibroblasten (0,3 -0,4 x 10 6 Zellen/ml, M6B8 (MSD Animal
Health)) Medium (199/F10, MSD Animal Health/Medium+0,1% NPPT (v/v)
(Neomycin, Polymyxin, Pimafucin, Tylosin)) mit 1% bovinem Kälberserum (FCS) als
Erhaltungsmedium und 5% im Nährmedium in Polystyrene Zellkulturplatten (Corning
Cell Culture Dish, 430196, mit 2 mm Zählgitter oder Costar, cat. No. 3060 mit 2mm
Zählgitter) angezüchtet. Der Virusgehalt wurde im Plaquetest nach serienmäßiger
Verdünnung der Ausgangsimpfvirussupension unter einem flüssigen Overlay-
Medium (M6B8 (MSD Animal Health) zweimal konzentriert mit 0,2% NPPT plus
Bactoagar 2,25 % und 5% NaHCO 3 ) bestimmt. 24 Stunden nach der Infektion wurde
das Medium gewechselt und das Agaroverlay für drei Tage hinzugefügt. Die Platten
wurden jeden Tag kontrolliert und bei Ablösen der Fibroblasten sofort für eine Stunde
mit 96% Ethanol fixiert und für 24 Stunden bei Raumtemperatur getrocknet. Jede

37
infizierte Zelle ruft im Zellmonolayer einen Plaque hervor. Die Anzahl der Plaques
wurde gezählt, zusätzlich wurde ein Titrationsstandard mit bekanntem Titer, hier mit
dem Marekimpfstoff Marexine CA, durchgeführt.
Die Titrationen werden für zwei Verdünnungen (1:50 und 1:500) jeweils im
Doppelansatz ausgeführt. Der Titer wird als Plaque Forming Units pro Milliliter
(PFU/ml) angegeben und folgendermaßen kalkuliert:
Titer pro Milliliter (log 10 ) =
Durchschnitt gezählter Plaques x
x
4.2.1.1 rHVT-Detektion mittels Immunfluoreszenztest
Replizierendes rHVT-ND wurde am 10. Tag nach rHVT-ND Impfung aus Milzzellen in
Cokultivierung mit Hühnerembryofibroblasten nach dem oben genannten Protokoll
von MSD Tiergesundheit nachgewiesen. Sekundäre Hühnerembryofibroblasten
wurden mit 37° C warmen, 1% FCS-haltigen M6B8 (MSD Animal Health)
Erhaltungsmedium in Polystyrene Zellkulturplatten (Corning Cell Culture Dish,
430196, mit 2 mm Zählgitter oder Costar, cat. No. 3060 mit 2mm Zählgitter) für 24
Stunden mit Milzzellen der geimpften Tiere cokultiviert. Bei der Milzentnahme wurde
die Milzkapsel entfernt, die Milz mechanisch zerkleinert und zertrennt, mit phosphatgepufferter
Salzlösung (PBS 0,01M, Na 2 HPO 4 2,9 g, NaCl 8g, KCl 2g, KH 2 PO 4 0,2 g,
pH 7,4) durch einen 100 µm Filter (BD Falcon, Heidelberg) in ein Falcon Tube (50 ml
Röhre, 114 x28 mm, PP, lot. 3040401, Sarstedt AG & Co, Nümbrecht, Deutschland)
überführt und in Zellkulturmedium M6B8 (MSD Animal Health) mit 5%FCS gelöst.
Anschließend wurden die restlichen Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS
0,01 s.o.) aus dem Filter gewaschen. Dann wurden die Zellen für 10 Minuten bei
1500 rpm und 4°C zentrifugiert, der Überstand verworfen, das Zellpellet in zwei
Milliliter Medium (M6B8 (MSD Animal Health, 5% FCS)) resuspendiert und eine
Zellkonzentration von 5 x 10 6 Zellen pro Milliliter hergestellt (Neubauer Zählkammer).
Ein Milliliter dieser Zelllösung (5 x 10 6 Zellen) wurde dann auf die Platten mit
konfluenten Monolayern aus sekundären Hühnerembryofibroblasten, welche fünf

38
Milliliter frisches Erhaltungsmedium (1% FCS, 37°C) enthielten, gegeben. Die Zellen
wurden drei Tage unter warmen Erhaltungsmedium (37° C, 1% FCS) belassen und
jeden Tag kontrolliert. Nach drei Tagen wurden die Plaques nach einstündiger
Ethanol-Fixierung (96%) und 24-stündiger Raumtemperatur-Lufttrocknung mit einem
monoklonalen Antikörper gegen das F-Protein (MCA NDV-F, lot. MAB040226DM,
exp. MAB-0320-102D, MSD Tiergesundheit) und einem fluoreszierenden
Zweitantikörper (Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG (H+L), Lot: 861163,
Invitrogen TM Eugene, Oregon, USA) sichtbar gemacht. Anschließend wurde unter
einem Inversmikroskop bei 25-facher Vergrößerung ausgezählt (Inverses Mikroskop
IM 35, Carl Zeiss, Göttingen, Deutschland). Zytopathische Effekte (Plaques) wurden
mikroskopisch detektiert und die Anzahl der positiven immunfluoreszierenden
Plaques gezählt. Die positiven Plaques wurden drei Tage nach Inkubation gezählt,
die Durchschnittsanzahl der Plaque Forming Units (PFU) pro Tier und pro Tiergruppe
angegeben (Daten nicht gezeigt).
4.3 Versuchsaufbau
Es wurden zwei Tierversuche mit SPF-Hühnern und kommerziellen Broilern
durchgeführt (Abbildungen 1 und 2). Im ersten Versuch wurden Eier von SPF-
Hühnern in der Klinik für Geflügel in Hannover ausgebrütet. Die Tiere wurden per
Zufall in vier verschiedene Gruppen eingeteilt und gegen die Newcastle Disease
geimpft. Die erste Gruppe wurde ungeimpft als Kontrollgruppe belassen. Der dritten
und vierten Gruppe wurde die ND-Lebendvakzine per Augentropfen verabreicht.
rHVT-ND wurde der zweiten sowie vierten Gruppe subkutan im Nackenbereich
appliziert. Am 10. und 35. Tag nach der Impfung wurden 7 Tiere pro Gruppe durch
Kopfschlag betäubt, durch Blutentzug getötet und anschließend seziert. HVT wurde
am 10. Tag nach Impfung durch Co-Kultivierung der Milzellen in
Hühnerembryofibroblasten detektiert. Hardersche Drüse, Konjunktiva, Trachea,
Lunge und Zäkaltonsille wurden zur immunhistochemischen Analyse auf
verschiedene Immunzellpopulationen entnommen. Ebenfalls wurden Proben zur
histologischen Untersuchung von Lunge, Trachea und Harderschen Drüsen am 10.

39
Tag entnommen. Die Belastungsinfektion fand am 35. Tag nach dem Schlupf mit
einer Impfdosis mit dem APMV-1 Stamm LaSota statt. Die Tiere (n=5-10) wurden zur
Belastungsinfektion und im Zeitraum danach in Isolationseinheiten vom Horsfall-
Bauer Typ verbracht und gehalten, die restlichen Tiere (n=5) verblieben ohne
Belastungsinfektion in den Ställen. Am 35. Tag nach der Impfung vor der APMV-1
Stamm LaSota Inokulation wurden Trachealtupferproben entnommen (7/Gruppe),
pro Gruppe zusammengelegt und auf APMV-1 mittels qRT-PCR untersucht. Am 36.
und 40. Tag nach dem Schlupf (einen und fünf Tage nach der APMV-1 Stamm
LaSota Challenge) wurden Kontaktsentineltiere (5/Gruppe) zu den
belastungsinfizierten Tieren hinzugesetzt. Die zweite Gruppe Sentinels wurde fünf
Tage nach Belastungsinfektion für fünf Tage hinzugesetzt, nachdem die erste
entfernt worden war. Die Tiere wurden jeden Tag auf klinische Symptome
untersucht, Trachealtupfer wurden am 3., 5., 7. und 10. Tag nach Challenge
gesammelt, um NDV durch qRT-PCR zu detektieren. Serumproben wurden am 36.
und am 43. Tag (sowie im zweiten Versuch am 46. Tag von nicht
belastungsinfizierten Tieren) nach dem Schlupf entnommen (5-7/Gruppe), um sie
mittels ELISA und HAH-Test auf NDV spezifische Antikörper zu untersuchen. Am 46.
Tag nach der Impfung wurden alle Vögel durch Kopfschlag betäubt, durch Blutentzug
getötet und seziert.
Der zweite Versuch hatte neben einigen Abweichungen den gleichen
Versuchsaufbau wie der erste und wurde mit kommerziellen Broilern durchgeführt
(Abb. 2). Zusätzlich zum ersten Versuch wurden anstelle von sieben Tieren fünf
Tiere pro Gruppe eingesetzt. Am 35. Tag nach der Impfung wurden drei bis vier
Vögel pro Gruppe getötet und seziert. Auch wurden Milz und Blutlymphozyten am
sechsten, 11. und 36. Tag des Versuchs entnommen und auf verschiedene
Immunzellpopulationen wie bei der Immunhistochemie in der Durchflusszytometrie
untersucht. Tränenflüssigkeitsproben wurden am Tag der Challenge entnommen (35
Tage nach der Impfung), welche im ELISA auf APMV-1 Antikörper untersucht
wurden. Die PCR Untersuchung auf rHVT-ND fand ebenfalls nur im zweiten Versuch
statt und wurde mit Milzzellen vom 36. Versuchstag durchgeführt.

40
*= zu den grau-unterlegten Zeitpunkten befanden sich die Tiere in Isolationseinheiten
vom Horsfall-Bauer Typ
Abbildung 1: Versuchsdurchführung des ersten Versuchs

41
*= zu den grau-unterlegten Zeitpunkten befanden sich die Tiere in Isolationseinheiten
vom Horsfall-Bauer Typ
=Tränenflüssigkeitsentnahme zur Anti-NDV Bestimmung
=Milzentnahme zur durchflusszytometrischen Analyse von Splenozyten
=Blutentnahme zur durchflusszytometrischen Analyse von peripheren
Blutleukozyten
Abbildung 2: Versuchsdurchführung des zweiten Versuchs

42
4.4 Untersuchungsmethoden
4.4.1 Serologische Untersuchungen
4.4.1.1 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Zur Bestimmung des Antikörpertiters wurden folgende, kommerziell erhältliche Test-
Kits von BioCheck® („(NDV) Newcastle Disease Antibody Test Kit“, Product Code:
CK 116, Smart Veterinary Diagnostics, Niederlande) und von IDEXX Laboratories®,
Inc. (IDEXX® FlockChek, „Newcastle Disease Virus Antibody Test Kit“, Product Code
5080.00, Maine, USA) untereinander verglichen. Das zu untersuchende Serum
wurde 1: 500 verdünnt und mit den mitgelieferten Positiv- und Negativkontrollen in
den Vertiefungen der mitgelieferten Mikrotiterplatten für 30 Minuten bei
Raumtemperatur belassen, sodass die NDV Antikörper an die mit Virusantigen
beschichteten Wellböden binden konnten. Nach den folgenden Waschschritten
wurde das Konjugat (BioCheck®: Anti-Huhn: Konjugiert mit Alkalischer Phosphatase
in Tris-Puffer mit Proteinstabilisatoren, IDEXX®: Ziege Anti-Huhn, konjugiert mit
Meerrettichperoxidase und Zusatz von Proteinstabilisatoren) für 30 Minuten bei
Raumtemperatur in den Vertiefungen der Mikrotiterplatten belassen. Nach erneuten
Waschschritten wurde das TMB (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin)-Substrat für 15
Minuten bei Raumtemperatur zugegeben und anschließend eine Stop-Lösung
(Natriumhydroxid in Diaethanolaminpuffer) zugegeben. Der entstandene
Farbumschlag wurde mittels OD-Wertmessung bei einer Wellenlänge von 405 nm
(BioCeck®) und 650 nm (IDEXX®) mit dem Spektrometer Tecan Sunrise (Tecan
Group AG, Österreich) gemessen. Zur Auswertung wurde das Programm Magellan TM
(V6.5, Tecan Austria GmbH) genutzt. Die Titer wurden folgendermaßen berechnet:
Log 10 Titer = 1,0(Log(P/PK)+3,52 (BioCheck®)* 1
Log 10 Titer = 1,09(log 10 S/P)+3,36 (IDEXX®)* 2
Proben mit Titer ≥ 396 (BioCheck®) und ≥ 1159 (IDEXX®) wurden als positiv
betrachtet.
* 1 = P = Probe; PK = Positivkontrolle = BioCheck®
* 2 = S = Probe; P = Positivkontrolle =IDEXX®

43
4.4.1.2 Hämagglutinations-Hemmungstest
Durch die Neutralisation der Viren durch NDV-Antikörper kann die durch APMV-1
verursachte Erythrozytenagglutination gehemmt werden und somit der NDV-
Antikörpergehalt in Seren nach Erstellen einer Verdünnungsreihe (log 2-Verdünnung)
bestimmt werden. Der Hämagglutinations-Hemmungstest (HAH-Test) wurde nach
den Richtlinien der Welttiergesundheitsorganisation (OIE 2008) in Mikrotiterplatten
mit rundem Boden durchgeführt. Anstelle von phosphatgepufferter Salzlösung wurde
sterile Kochsalzlösung (9 g/L) verwendet. Der HAH-Test wurde mit einer
Antigenkonzentration von vier hämagglutinierenden Einheiten (HAU) des APMV-1
Stammes LaSota durchgeführt. Die Serumproben wurden mit der Antigenlösung in
Kochsalzlösung 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde eine
1%ige Hühnererythrozyten-Suspension für 30 Minuten in jede Reaktionsvertiefung
gegeben. Als Hemmtiter gilt die höchste Antiserumverdünnung, die vier
Viruseinheiten vollständig hemmt. Die Nummer der letzten Vertiefung, bei dem eine
Hämagglutinationshemmung vorliegt, ist die Titerkennzahl. Der Titer ist dargestellt
als 2er Potenz.
4.4.2 Klinischer Score
Der klinische Score für respiratorische klinische Symptome wurde nach dem Scoring
System von Jones et al. (JONES et al. 1992) durchgeführt. Er wurde jeden Tag für
10 Tage nach der Belastungsinfektion erhoben. Score 0 = keine klinischen
Symptome; Score 1 = klares nasales Exsudat; Score 2 = trübes nasales Exsudat;
Score 3 = Schwellung des Sinus Infraorbitalis.
4.4.3 Histologische Untersuchungen
Histologische Proben von Harderscher Drüse, Trachea und Lunge wurden sofort
nach ihrer Entnahme in 4 %igem gepuffertem Formalin fixiert, in Paraffinwachs
eingebettet und nach herkömmlichen Methoden bearbeitet
(DUMRONGSOONTORNCHAI 1999). Hierbei wurden die Proben in einer

44
aufsteigenden Alkoholreihe (Isopropanol 50 %, 70 %, 80%, 90%, 100% für jeweils 60
min 2x, Isopropanol/Azeton 1:1 für 90 min, Aceton für 60 min, 2x) entwässert und
anschließend in Paraffinblöcke eingebettet. Die Paraffinblöcke wurden über Nacht im
Kühlschrank (4°C) gelagert und anschließend mit einem Mikrotom (Model 2040
Autocut (Reichert-Jung, Cambridge Instrument GmbH, Nußloch) mit einer
Schnittdicke von 2 µm geschnitten. Die Gewebeschnitte wurden in ein 40°C warmes
Wasserbad überführt und anschließend von dort aus auf mit Serum-Glycerin
(Waldeck GmbH, Division Chroma, Münster, Deutschland) beschichtete
Glasobjektträger verbracht. Im Anschluss erfolgte eine Trocknung für eine Stunde bei
Raumtemperatur. Anschließend wurden die Schnitte mittels Hämatoxylin-Eosin
(H&E) gefärbt. Hierbei wurde zuerst eine Deparaffinierung und Rehydratation der
Schnitte mit absteigender Alkoholreihe durchgeführt. Anschließend wurden die
Objektträger in Hämatoxylin- und Eosin (1%)- Lösungen gefärbt. Die Schnitte wurden
danach mit DePEx Mounting Medium (BDH Laboratory Supplies, England)
überschichtet und mit einem Deckglas abgedeckt. Danach erfolgte die
mikroskopische Begutachtung und wurde nach folgendem Score, angelehnt an die
histopathologischen Veränderung nach NDV-Infektion (CATTOLI et al. 2011),
bewertet: Score 0 - keine Veränderung; Score 1 - milde lymphozytäre oder
heterophilzellige Infiltrationen in Epithelschicht oder lamina propria und ein oder
mehrere lymphoide Zellansammlungen; Score 2 - massive Infiltration von
Entzündungszellen in Epithelschicht oder Lamina propria, fokal oder diffus,
Hypertrophie von mukösen Drüsen; Score 3 - massive fokale und diffuse Infiltration
von Entzündungszellen im Epithel oder in der Lamina propria und Ablösung des
zilientragenden Epithels.
4.4.4 Immunhistochemische Untersuchungen
Hardersche Drüse, Konjunktiva, Trachea, Lunge und Zäkaltonsille wurden den
Tieren während der Sektion entnommen, mit Einbettmedium für Gefrierschnitte
(Jung, Leica Microsystems Nussloch GmBH, Heidelberg, Batch-Nr.:03655539) auf
herkömmlichem Papier fixiert, in flüssigem Stickstoff gefroren und anschließend bei

45
-70 °C gelagert. Die tiefgefrorenen Organe wurden mit einem Kryostaten (Model
2800 Frigocut (Reichert-Jung, Leica GmbH, Beasheim)) mit einer Schnittdicke von 5
µm bei -22°C geschnitten und auf Glasobjektträger (Thermo Scientific, Superfrost
Ultra Plus ®, Objektträger, geschliffen, Braunschweig, Deutschland) überführt. Die
Kryostatschnitte wurden in einem Exsikkator bei Raumtemperatur für 24 Stunden
getrocknet. Danach wurden die Schnitte in -20°C kaltem Aceton für 10 Minuten bei
Raumtemperatur fixiert und bei Raumtemperatur getrocknet. Diese Azeton-fixierten
Schnitte können für 6 Monate in einem Exsikkator bei Raumtemperatur gelagert oder
direkt bearbeitet werden. Zwischen jedem der nun folgenden Arbeitsschritte erfolgte
eine kurze (10 Sekunden) und eine lange Waschung (fünf Minuten) der Schnitte mit
phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, 0,01M, Na 2 HPO 4 2,9 g, NaCl 8g, KCl 2g,
KH 2 PO 4 0,2 g, pH 7,4) in einer Glaskammer. Pro Objekträger wurden 500 µl der
jeweiligen Lösungen aufgetragen. Nach dem Fixierungsschritt wurden alle Schnitte
zur Inaktivierung von endogenen Peroxidaseaktivitäten der Organe bei 0,03 % H 2 O 2
für 15 Minuten in einer Glasküvette belassen. Danach wurde ein Blocking Antikörper
(Pferdeserum in PBS verdünnt, Vectastain ®, Vector Laboratories, Inc., Burlingame.
USA plus Avidin D) für 20 Minuten auf den Schnitten belassen, um freie
Proteinstrukturen, welche unspezifische Bindungen hervorrufen können, zu
blockieren. Nach diesem Schritt erfolgte die Zugabe der primären Antikörper, welche
für eine Stunde bei 37°C inkubiert wurden. Die Erstantikörper wurden von der Firma
Southern Biotech (Alabama, USA) über Biozol Diagnostica Vertrieb GmbH (Eching,
Deutschland) bezogen: CD4+ ,CD8+ (T-Zellen), BU-1+ (unreife und reife B-Zellen,
keine Plasmazellen (HOUSSAINT et al. 1989) , KUL01+ (Hühner Monozyten und
Makrophagen sowie interdigitierende dendritische Zellen und aktivierte
Mikrogliazellen) und IgA+ Zellen wurden mit den in Tabelle 3 gelisteten primären
Antikörpern markiert (Tabelle 3).

46
Tabelle 3: Antikörper zur immunhistochemischen Detektion von verschiedenen
Immunzellpopulationen
Antikörper Cat.No.* µg/ml
Mouse Anti-Chicken CD 4 8210-01 1
Mouse Anti-Chicken CD 8β 8280-01 1
Mouse Anti-Chicken BU-1 8395-01 1
Mouse Anti-Chicken KUL01 8420-01 1
Mouse Anti-Chicken IgA 8330-01 0,05
(*=Cat.No., Southern Biotechnology Associates, Inc. (Alabama, USA))
Alle Antikörper außer Mouse Anti-Chicken IgA wurden 1:500 in PBS verdünnt und
mit Biotin versetzt (Vectastain ®, Vector Laboratories, Inc., Burlingame. USA). Mouse
Anti-Chicken IgA wurde 1:10000 in PBS verdünnt. Nach einem Waschschritt wurde
der biotinylierte Zweitantikörper für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf die
Objektträger gegeben. Als Zweitantikörper wurde ein biotinylierter Antikörper aus
dem Vectastain ABC Kit (Mouse IgG, PK-6102, Vectastain ®, Vector Laboratories,
Inc., Burlingame, USA) verwendet. Danach wurde das ABC Konjugat für 30 Minunten
auf die Schnitte gegeben. Dieses besteht aus einem Avidin und biotinyliertem
Enzymkomplex (Horseradisch Peroxidase=HRP), welcher sich durch die hohe
Affinität von Avidin zu Biotin irreversibel an den Zweitantikörper bindet. Die Färbung
erfolgte mittels DAB (3,3'-Diaminobenzidin) als Enzymsubstrat, welches nach
Reaktion mit der HRP des Enzym-Avidinkomplexes ein braunes Endprodukt erzeugt
und somit positive Zellen braun darstellt. Anschließend wurde noch eine
Gegenfärbung mit Hämatoxylin für 10 Sekunden durchgeführt und die Schnitte unter
fließendem Wasser für zwei Minuten gespült. Dann wurden die Objektträger mit drei
bis vier Tropfen eines wässrigen Eindeckmittels (Aquatex ®, Merck KGaA,
Darmstadt, Deutschland) und Deckgläßchen (24 x 60 Millimeter) abgedeckt und für
einen Tag zum Trocknen bei Raumtemperatur belassen.
Die positiv markierten Zellen wurden bei 400-facher Vergrößerung in drei bis fünf
Feldern mikroskopisch ausgezählt und ein Mittelwert pro Tier gebildet. Aus den

47
Einzelwerten/Tier wurde ein Mittelwert pro Gruppe gebildet, welche miteinander
verglichen wurden.
Bei Zellpopulationsbestimmungen in Konjunktiva-assoziertem lymphoiden Gewebe
und in der Zäkaltonsille wurde aufgrund der hohen Zellzahlen ein alternatives
Scoring System angewandt. Dieses basierte auf dem Score von McDonald und
Pilgram (MCDONALD u. PILGRAM 1999), bei dem bei 200-facher mikroskopischer
Vergrößerung Zellvorkommen prozentual eingeschätzt wurden: Score 0 = 0% der
Zellen im mikroskopischen Sichtfeld sind bräunlich gefärbt; Score 1 = weniger als 25
% der Zellen im mikroskopischen Sichtfeld sind bräunlich gefärbt; Score 2 = weniger
als 50 % der Zellen im mikroskopischen Sichtfeld sind bräunlich gefärbt; Score 3 =
mehr als 50 % der Zellen im mikroskopischen Sichtfeld sind bräunlich gefärbt.
4.4.5 Virus-RNA Isolierung
Gesamt-RNA wurde von Tracheal- und Kloakal-Tupferproben mit peqGOLD
TriFast (peqlab, Erlangen, Deutschland) entsprechend den Angaben des
Herstellers isoliert. Die RNA in den Tupferproben wurde mit Chloroform, Isopropanol
und Ethanol (75%) isoliert und anschließend in 30 µl RNAse/DNAse-freiem Wasser
gelöst. Die Probe wurde daraufhin mit einem Spektrophotometer auf den RNA-
Gehalt und ihre Qualität untersucht und entweder bei -80°C gelagert oder direkt
untersucht.
4.4.6 Nachweis von APMV-1 mittels qRT-PCR (quantitative Reverse
Transcription Polymerase Chain Reaction)
Vermehrungsfähige und inaktive Viruspartikel des APMV-1 können mit der qRT-PCR
nachgewiesen werden. Bei der APMV-1 One-Step Real-Time PCR wird eine
Gensequenz auf dem Polymerase L-Gen über mehrere Vervielfältigungszyklen
amplifiziert und durch Fluoreszenzfärbung sichtbar gemacht. Hierbei ist ein
qualitativer und quantitativer Nachweis des Virus möglich. Der Cycle threshold (Ct)
gibt den Zyklus an, bei dem die Fluoreszenz signifikant über das

48
Hintergrundfarbsignal steigt. Die Fluoreszenz stammt von sogenannten
Reporterfarbstoffen, die mit der Sonde gekoppelt sind. FAM ist der Fluoreszenz-
Farbstoff, welcher synchron sequenzspezifisch mit der Anreicherung der PCR-
Produkte (142 bp) ansteigt. Nicht korrekt gebundene und daher nicht durch die
Polymerase hydrolisierte Sonden werden durch einen sogenannten Quencher
(BHQ1) daran gehindert, zu fluoreszieren. Als Reference Dye, also ein weiterer
Reporterfarbstoff, welcher ebenfalls eingesetzt wird, um nicht PCR-bedingte
Variationen in der Fluoreszenz auszugleichen, wurde ROX eingesetzt. Alle Proben
bis auf die Kontrollen wurden im Doppelansatz untersucht. Es wurde das PCR Kit
Ambion Ag Path-ID One-Step RT-PCR Kit verwendet.
Pro PCR-Mix (25 µl) wurden 3 µl RNase-freies Wasser, 12,5 µl Reaktionsmix (2x RT-
PCR Buffer), 1,875 µl des Vorwärtsprimers (NDF; 10 pmol/µl), 0,625 µl des
Rückwärtsprimers (NDR; 10pmol/µl), je 0,5 µl jeder Sonde (NDpro1, NDpro2; 1,25
pmol/µl), 1 µl Enzym-Mix (25x RT-PCR Enzyme Mix) und 5 µl der Proben-RNS
verwendet. Die Primersequenzen lauten wie folgt:
NDforward primer: GAGCTAATGAACATTCTTTC, Position 12679-12696;
NDreverse primer: AATAGGCGGACCACATCTG, Position 12820-12838;
ND-probe 1: [FAM]TCATTCTTTATAGAGGTATCTTCATCATA[BHQ1],
Position 12738-12766;
ND-probe 2: [FAM]TCATACACTATTATGGCGTCATTCTT[BHQ1],
Position 12759-12784.
Zur APMV-1 rRT-PCR wurde das real time PCR-Gerät Stratagene MX 3005P
(Stratagene, La Jolla, CA) eingesetzt. Das Thermalprofil wurde mit einem Zyklus bei
45°C für 10 Minuten, einem Zyklus bei 95°C für weitere 10 Minuten, 40 Zyklen bei
95°C für 15 Sekunden und 55°C für 45 Sekunden eingestellt. Insgesamt wurden 40
Zyklen durchgeführt. Sobald die Fluoreszenz der Probe 0,018 Fluorescence dRn
(delta Rn = normalisiertes Reportersignal) überschritt, wurde die Probe als positiv
bewertet.

49
4.4.7 PCR (Polymerase Chain Reaction) des Impfvirus
Aufgrund technischer Schwierigkeiten beim Nachweis von replizierendem rHVT-ND
wurde im zweiten Versuch parallel zum rHVT-Plaquetest eine HVT-PCR
durchgeführt. HVT-DNA wurde aus Milzzellen isoliert, welche am 36. Tag nach
Schlupf entnommen wurden. Hierbei wurde nach Angaben des Herstellers
vorgegangen. Zur Isolation wurde das InnuPrep DNA Minikit (Analytik Jena Bio
Solutions, Lot-Nr.: 016-08) benutzt. Die Primer wurden nach Becker et al. (1992)
modifiziert (BECKER et al. 1992) und mithilfe des Programms Primer3 (v. 0.4.0;
http://primer3.wi.mit.edu/) erstellt.
Forward Primer: CGTCGATACCCATCATATCC (20 mer);
Reverse Primer: ACATTCTTTTCGTTGGCGTGGTAT (24mer);
Die Herstellung und Lieferung der Primer erfolgte durch die Firma Eurofins MWG
Operon (Ebersberg; Germany). Das Takara ExTaq PCR Kit® (Takara BioInc, Japan,
Lot-Nr.: KA5501EA) wurde mit folgenden Mastermixkonzentrationen eingesetzt:

50
ExTaq Polymerase 0,25 µl
ExTaq 10x Buffer 5,00 µl
dNTPmix 4,00 µl
HVT-F 2,00 µl
HVT-R 2,00 µl
H 2 0 31,75 µl
DNA
5,00 µl (200 ng/µl)
Die folgenden PCR Zyklen wurden mit dem SensoQuest Labcycler (Biomedizinische
Elektronik, Göttingen, Germany) durchgeführt: Ein Zyklus bei 94 °C für 240
Sekunden, 45 Zyklen für 94°C für 15 Sekunden, 56°C für 60 Sekunden, 72°C für 95
Sekunden und anschließend ein Zyklus bei 72°C für 120 Sekunden.
4.4.8 Zellzählung
Die Zellen wurden mithilfe einer Neubauer Zählkammer gezählt. Jede Probe wurde
1:10 in Trypan Blau Farbe 0,4% (Gibco, Invitrogen cooperation, Darmstadt) verdünnt
und die Zellen unter dem Lichtmikroskop gezählt. Die Zellzahl wurde unter einem
Großquadrat (Volumen 0,1 µl) ermittelt und auf 1 ml hochgerechnet (Faktor 10 4 ).
4.4.9 Durchflusszytometrie
Im zweiten Versuch wurden am sechsten und am 36. Tag nach dem Schlupf die Milz,
am 11. und 36. Tag nach dem Schlupf Blutproben in heparinisierten
Reagenzröhrchen zur durchflusszytometrischen Analyse nach bekannter Methode
(SCHWARZ et al. 2011) entnommen. Bei der Milzentnahme wurde die Milzkapsel
entfernt, die Milz zerkleinert und zerteilt mit und Phosphat-gepufferter Salzlösung
(PBS 0,01M) durch einen 70 µm Filter (BD Falcon, Heidelberg) in ein Falcon Tube
(50 ml Röhre, 114 x28 mm, PP, lot. 3040401, Sarstedt AG & Co, Nümbrecht,
Deutschland) überführt. Anschließend wurde die frisch gewonnene Zellsupsension
bei 1500 rpm für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Die folgenden Antikörper der Firma
Southern Biotech (Alabama, USA), bezogen über Biozol Diagnostica Vertrieb GmbH

51
(Eching, Deutschland) wurden verwendet: Maus-Anti-CD4; CD4/αβ; CD4/δγ;
CD8/αβ; CD8/γδ; CD8; BU-1; KUL01; IgA. Die Antikörper waren alle bis auf CD4
(PE), CD8β und IgA FITC markiert. CD4 war PE-markiert, CD8β und IgA wurden
Spectral Red konjugiert (Antikörper: Konjugat-Verhältnis = 2:1). Alle Antikörper
wurden 1:100 verdünnt. Diese optimale Verdünnungstufe wurde mittels einer
Titration der Antikörper mit Milzzellen im Vorversuch ermittelt. Vor dem Färben der
Zellen wurden die isolierten Milzzellen auf eine Zellkonzentration von 1 x 10 6 Zellen
eingestellt und davon 100 µl pro Well auf eine 96-well Platte gegeben. Die Zellen
wurden für vier Minuten bei 4 °C mit 2000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde
verworfen und das Zell-Pellet mit 100 µl FACS-Puffer (1% Bovines Serumalbumin in
PBS) mit den darin gelösten Antikörpern für 30 Minuten bei 4 °C in Dunkelheit
inkubiert. Anschließend wurden die Zellen wieder mit 100 µl FACS-Buffer bei 2000
rpm für 5 Minuten gewaschen.
4.4.9.1 Durchflusszytometrische Analyse
Die gefärbten Zellen wurden mit dem Beckman Coulter Epics XL Flow Zytometer
(Beckman Coulter, Krefeld) gemessen und mit Hilfe des EXPO 32 ADC Programmes
analysiert. Die Lymphozyten wurden nach Größe und Granularität mittels ihrer
Foward- und Sideward-Laser Streuung zugeordnet. Ungefärbte Zellen und einzelgefärbte
Zellen dienten als Kontrollen. Eine Kompensation fand jedes Mal vor den
Messungen mithilfe dieser Kontrollen statt. Bei Milz sowie auch Blutzellen wurden
10000 Einheiten für 180 Sekunden gemessen.
4.5 Statistische Analyse
Die statistische Analyse wurde mit der SAS-Software (SAS 9.3) für die Tracheal-
Tupfer Ergebnisse und mit der Statistix® 9 Software für alle anderen Ergebnisse
durchgeführt. Für die Tracheal-Tupferproben wurde der Fishers Exact Test
angewendet. Bei der Bewertung der Ergebnisse der Serologie, Durchflusszytometrie
und Immunhistochemie wurde die Kruskal-Wallis One-Way AOV mit anschließendem

52
paarweisem Vergleich durchgeführt. Bei einem p-Wert

53
5 Ergebnisse
Die Ergebnisse der Versuche 1 (SPF-Hühner) und 2 (Broiler) werden vergleichend
dargestellt. In beiden Tierversuchen wurden die lokale und systemische
Immunantwort nach Newcastle Disease Impfung untersucht. Es wurden lokale T- und
B-Zellpopulationen sowie Makrophagen in Harderscher Drüse, CALT, Trachea,
Lunge und Zäkaltonsille sowie lokale Virusausscheidung aus der Trachea
untersucht. Lokale und systemische Antikörperbildung sowie ein Impfvirusnachweis
wurden ebenfalls durchgeführt. Eine rHVT-ND vakzinierte Gruppe und eine mit
Lebendimpfstoff vakzinierte Gruppe als auch eine mit beiden Impfstoffen geimpfte
Gruppe wurden mit einer ungeimpften Kontrollgruppe und untereinander verglichen.
5.1 Titration des Impfvirus
Die Titer der rHVT-ND Vakzine stimmten in beiden Versuchen annähernd mit den
Angaben des Herstellers überein. Die Impfstoffe wurden auf Zellkulturplatten mit
sekundären Hühnerembryofibroblasten gegeben. Im ersten Versuch wurde der Titer
der Vakzine vom Hersteller mit 7,3 log 10 PFU/ml angegeben. Die direkt im Anschluss
erfolgende Titration ergab einen Titer von 6,9 log 10 PFU/ml. Im zweiten Versuch
wurde der Titer vom Hersteller mit 7,0 log 10 PFU/ml angegeben. Nach Verdünnung
und Impfung wurde der Impfstoff einen Tag später (24 h) titriert und wies den
gleichen Titer von 7,0 log 10 PFU/ml auf.
5.2 Nachweis des rHVT-ND nach Impfung durch Anzucht in vitro
(Exp. 1) oder mittels Polymerase Kettenreaktion (Exp. 2)
Im ersten Versuch wurde replizierendes rHVT-ND aus Milzzellen nach Cokultivierung
mit sekundären Hühnerembryofibroblasten in der Zellkultur nachgewiesen. Jedoch
konnten nicht alle Platten ausgewertet werden, da eine vorzeitige Ablösung der
Hühnerembryofibroblasten von den Zellkulturböden das Auszählen der Plaques
verhinderte. Beide Gruppen der mit rHVT-ND geimpften Tiere zeigten HVT-

54
spezifische Plaques, welche mit einem monoklonalen Antikörper, der gegen das ND-
F-Protein gerichtet war, angefärbt und ausgezählt werden (Daten nicht gezeigt). Im
zweiten Versuch konnten bei drei von drei Tieren aus der rHVT-ND geimpften
Gruppe und bei drei von vier Tieren aus der rHVT-
ND/Lebendimpfstoffkombinationsgruppe rHVT-ND mittels PCR nachgewiesen
werden. Die restlichen Tiere verblieben negativ auf rHVT-ND.
5.3 Immunhistochemische Untersuchungen von
Immunzellpopulationen
Bei den SPF-Hühnern in Versuch 1 wurden die immunhistochemischen
Untersuchungen der Immunzellpopulationen am 10. Tag nach der Impfung (post
vaccination=pv) durchgeführt, bei Broilern am fünften und 10. Tag pv. Die Ergebnisse
vom 10. Tag pv der SPF-Hühner und Broiler werden vergleichend dargestellt (Abb. 7,
9, 11, 12) während die Ergebnisse des fünften Tages pv nur für den Broilerversuch
dargestellt werden. Es wurden lokale T- und B- Zellpopulationen sowie Makrophagen
in Harderscher Drüse, Konjunktiva, Lunge und Zäkaltonsille 10 Tage pv in
Experiment 1 dargestellt. Im zweiten Experiment wurden am fünften sowie 10. Tag
pv die gleichen Zellpopulationen bei Broilern in Harderscher Drüse, Konjunktiva,
Lunge und Zäkaltonsille dargestellt.

55
5.4 Immunzellpopulationen 5 Tage nach der Impfung bei Broilern
Abb. 3a: CD4+ Zellen bei Broilern 5 Tage nach ND-Impfung
A
B
C
D
Abb. 3b: CD8+ Zellen bei Broilern 5 Tage nach ND-Impfung
E
F
G
H

56
Abbildung 3 a,b (A-H): Immunhistochemische Detektion von CD4+ Zellen (A-D) und
CD8+ Zellen (E-H) in verschiedenen Organen (Hardersche Drüse, CALT, Lunge,
Zäkaltonsille) von kommerziellen Broilern am 5. Tag nach ND-Impfung.
Dargestellt ist der jeweilige Durchschnitt der Anzahl (A, C, E, G) bzw. der Scores (B,
D, F, H) der unterschiedlichen Immunzellpopulationen pro Gruppe und Organ. Es
wurden 3-5 Blickfelder pro Tier bei 400x (Score 200x) Vergrößerung evaluiert.
Unterschiedlich kleine Buchstaben (a, b) über den Säulen kennzeichnen Gruppen,
die sich signifikant voneinander unterscheiden (p

57
A
B
C
D
Abbildung 4 (A-D): Immunhistochemische Detektion von CD4+ Zellen bei 200-facher
Vergrößerung in Harderschen Drüsen von Broilern am fünften Tag nach ND-Impfung.
A - ungeimpfte Kontrollgruppe, B - rHVT-ND geimpfte Gruppe, C - mit
Lebendimpfstoff geimpfte Gruppe, D - mit rHVT-ND und Lebendimpfstoff geimpfte
Gruppe. CD4+ Zellen stellen sich braun dar.
Generell zeigten sich im interstitiellen Gewebe, um den Hauptausführungsgang und
um die Nebenausführungsgänge der Harderschen Drüse erhöhte Zellzahlen in NDvakzinierten
Tieren im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abbildung 4 A-D).

58
Abb. 5a: Bu-1+ Zellen bei Broilern 5 Tage nach ND-Impfung
A
B
C
Abb. 5b: KUL01+ Zellen bei Broilern 5 Tage nach ND-Impfung
D
E
F
G
H

59
Abbildung 5 a, b (A-H): Immunhistochemische Detektion von Bu-1+ Zellen (A-D) und
KUL01+ Zellen (E-H) in verschiedenen Organen (Hardersche Drüse, CALT, Lunge,
Zäkaltonsille) von kommerziellen Broilern am 5. Tag nach ND-Impfung.
Dargestellt ist der jeweilige Durchschnitt der Anzahl (A, C, E, G) bzw. Scores (B, D,
F, H) der unterschiedlichen Immunzellpopulationen pro Gruppe und Organ. Es
wurden 3-5 Blickfelder pro Tier bei 400x (Score 200x) Vergrößerung evaluiert.
Unterschiedlich kleine Buchstaben (a, b) über den Säulen kennzeichnen Gruppen,
die sich signifikant voneinander unterscheiden (p

60
Abb. 6: IgA+ Zellen bei Broilern 5 Tage nach ND-Impfung
A
B
C
D
Abbildung 6 (A-D): Immunhistochemische Detektion von IgA+ Zellen (A-D) in
verschiedenen Organen (Hardersche Drüse, CALT, Lunge, Zäkaltonsille) von
kommerziellen Broilern am fünften Tag nach ND-Impfung.
Dargestellt ist der jeweilige Durchschnitt der Anzahl (A, C) bzw. Scores (B, D) der
unterschiedlichen Immunzellpopulationen pro Gruppe und Organ. Es wurden 3-5
Blickfelder pro Tier bei 400x (Score 200x) Vergrößerung evaluiert. Unterschiedlich
kleine Buchstaben (a, b) über den Säulen kennzeichnen Gruppen, die sich signifikant
voneinander unterscheiden (p

61
In der Lunge zeigen sich IgA+ Zellen in der Kombinationsgruppe signifikant erhöht zu
den restlichen Gruppen (p

62
Abb. 7: Verschiedene Immunzellpopulationen in Harderschen Drüsen am 10. Tag
nach ND-Impfung
A
B
C
D
E
F
G
H

63
Abb. 7: Fortsetzung: Verschiedene Immunzellpopulationen in Harderschen Drüsen
am 10. Tag nach ND-Impfung
I
J
Abbildung 7 (A-J): Immunhistochemische Detektion von verschiedene
Immunzelltypen in Harderschen Drüsen von SPF-Hühnern (A, C, E, G, I) und
Broilern (B, D, F, H, J) am 10. Tag nach ND-Impfung.
Dargestellt ist der jeweilige Durchschnitt der Anzahl der unterschiedlichen
Immunzellpopulationen pro Gruppe und Organ. Es wurden 3-5 Blickfelder pro Tier
bei 400x Vergrößerung evaluiert. Unterschiedlich kleine Buchstaben (a, b) über den
Säulen kennzeichnen Gruppen, die sich signifikant voneinander unterscheiden
(p

64
A
B
C
D
Abbildung 8 (A-D): Immunhistochemische Detektion von CD4+ Zellen bei 200-facher
Vergrößerung in Harderschen Drüsen von SPF-Hühnern am 10. Tag nach ND-
Impfung.
A - ungeimpfte Kontrollgruppe, B - rHVT-ND geimpfte Gruppe, C - mit
Lebendimpfstoff geimpfte Gruppe, D - mit rHVT-ND und Lebendimpfstoff geimpfte
Gruppe. CD4+ Zellen stellen sich bräunlich dar.
Es wurde eine Erhöhung der CD4+ Zellzahlen im Interstitium der Drüse und um den
Ausführungsgang bei SPF-Hühnern aus ND-geimpften Gruppen beobachtet (Abb.8
B, C, D).

65
Abb. 9: Verschiedene Immunzellpopulationen in Lungen am 10. Tag nach ND-
Impfung
A
B
C
D
E
F
G
H

66
Abb. 9: Fortsetzung: Verschiedene Immunzellpopulationen in Lungen am 10. Tag
nach ND-Impfung
I
J
Abbildung 9 (A-J): Immunhistochemische Detektion von verschiedenen
Immunzelltypen in Lungen in Nähe eines Parabronchus unter einem lateroventralen
sekundären Bronchus von SPF-Hühnern (A, C, E, G, I) und Broilern (B, D, F, H, J)
am 10. Tag nach ND-Impfung.
Dargestellt ist der jeweilige Durchschnitt der Anzahl der unterschiedlichen
Immunzellpopulationen pro Gruppe und Organ. Es wurden 3-5 Blickfelder pro Tier
bei 400x Vergrößerung evaluiert. Unterschiedlich kleine Buchstaben (a, b) über den
Säulen kennzeichnen Gruppen, die sich signifikant voneinander unterscheiden
(p

67
Im immunhistochemischen Schnitt stellen sich positiv gefärbte Zellen braun dar. Abb.
10 (A-D) zeigt CD4+ gefärbte Zellen um einen Parabronchus in den verschiedenen
Gruppen.
A
B
C
D
Abbildung 10 (A-D): Immunhistochemische Detektion von CD4+ Zellen bei 200-
facher Vergrößerung eines Parabronchus ventral eines lateroventralen sekundären
Bronchus in Lungen von SPF-Hühnern am 10. Tag nach ND-Impfung.
A - ungeimpfte Kontrollgruppe, B - rHVT-ND geimpfte Gruppe, C - mit
Lebendimpfstoff geimpfte Gruppe, D - mit rHVT-ND und Lebendimpfstoff geimpfte
Gruppe. CD4+ Zellen stellen sich braun dar.

68
Abb. 11: Verschiedene Immunzellpopulationen des Konjunktiva-assoziierten
lymphatischen Gewebes am 10. Tag nach ND-Impfung
A
B
C
D
E
Abbildung 11 (A-E): Immunhistochemische Detektion von verschiedenen
Immunzelltypen im Konjunktiva-assoziierten lymphatischem Gewebe (CALT) von
Broilern am 10. Tag nach ND-Impfung.
Dargestellt sind die jeweiligen Scores der unterschiedlichen Immunzellpopulationen
pro Gruppe und Organ. Es wurden 3-5 Blickfelder pro Tier bei 200x Vergrößerung
evaluiert.

69
Die Immunzellen in Konjunktiva-assoziierten lymphoiden Geweben von Broilern
wiesen am 10.Tag nach Impfung keine signifikanten Unterschiede zwischen den
einzelnen Gruppen auf (Abb.11 A-E) (p

70
Abb. 12:
Verschiedene Immunzellpopulationen in Zäkaltonsillen am 10. Tag nach ND-Impfung
A
B
C
D
E
F
G
H

71
Abb. 12: Fortsetzung: Verschiedene Immunzellpopulationen in Zäkaltonsillen am 10.
Tag nach ND-Impfung
I
J
Abbildung 12 (A-J): Immunhistochemische Detektion von verschiedenen
Immunzelltypen in Zäkaltonsillen von SPF-Hühnern (A, C, E, G, I) und Broilern (B, D,
F, H, J) am 10. Tag nach ND-Impfung.
Dargestellt sind die jeweiligen Scores der unterschiedlichen Immunzellpopulationen
pro Gruppe und Organ. Es wurden 3-5 Blickfelder pro Tier bei 200x Vergrößerung
evaluiert.
Bei SPF-Hühnern zeigten CD4+ Zellzahlen in Zäkaltonsillen am 10. Tag nach
Impfung eine Verringerung in der kombiniert geimpften Gruppe im Vergleich zu der
Kontrollgruppe (Abb. 12 A). Die CD8+ Zellzahlen erhöhten sich nach rHVT-ND
Impfung verglichen mit den Zellzahlen der restlichen Gruppen (Abb. 12 B). BU-1+
Zellen waren in ND-geimpften Gruppen niedriger als in der Kontrollgruppe (Abb.12
E). Eine Erhöhung fand im Bereich der KUL-01+ Zellen beider mit Lebendimpfstoff
geimpfter Gruppen statt (Abb. 12 G). IgA+ Zellzahlen zeigten eine Reduktion in der
rHVT-ND geimpften Gruppe im Vergleich zu den restlichen Gruppen (Abb. 12 I).
Bei Broilern wurde eine Erhöhung von Bu-1+ Zellen in den ND-geimpften Gruppen im
Vergleich zur Kontrollgruppe beobachtet (Abb. 12 F). KUL01+ Zellen waren in der
Gruppe erhöht, welche nur mit dem ND-Lebendimpfstoff geimpft wurde (Abb. 12 H).

72
5.6 Virusdetektion von Tracheal- und Kloakaltupfern durch qRT-
PCR
Im ersten und zweiten Versuch wurde bei SPF-Hühnern und kommerziellen Broilern
die Virusausscheidung aus der Trachea nach Belastungsinfektion mit dem APMV-1
Stamm LaSota mittels qRT-PCR detektiert. Im zweiten Versuch wurde zusätzlich die
Virusausscheidung aus der Kloake durch qRT-PCR von Tupferproben untersucht.
Am 35. Tag nach der Impfung wurden vor der Belastungsinfektion im ersten und
zweiten Versuch Trachealtupfer von sieben Tieren pro Gruppe entnommen.
Fünf Sentineltiere wurden jeweils einen Tag nach der Belastungsinfektion zu den
Tieren hinzugegeben und fünf Tage später entfernt. An dem Tag, an dem die erste
Gruppe der Sentineltiere entfernt wurde, wurde eine neue Gruppe von fünf Sentinels
für fünf weitere Tage hinzugesetzt. Am dritten, fünften, siebten und zehnten Tag
nach der Belastungsinfektion wurden Trachealtupfer der belastungsinfizierten SPF-
Hühner und Sentinels entnommen, sowie an den gleichen Tagen zusätzlich
Kloakentupfer der Broiler.
Am 35. Tag nach Impfung wurde bei keinem Tier Virus in der qRT-PCR detektiert
(Tabelle 4). Alle SPF-Hühner der Kontrollgruppe schieden den APMV-1 Virusstamm
LaSota bis zum siebten Tag nach der Belastungsinfektion aus. Am 10. Tag nach der
Belastungsinfektion war nur noch ein Tier aus der Kontrollgruppe positiv (Tabelle 4).
Alle Tiere der rHVT-ND geimpften Gruppe schieden Virus bis zum siebten Tag nach
der Belastungsinfektion aus. Am 10. Tag nach Belastungsinfektion war keines dieser
Tiere mehr Paramyxovirus Serotyp 1-positiv in der qRT-PCR. In der ersten
Sentinelgruppe der rHVT-ND Gruppe wurde bei keinem Tier rHVT-ND detektiert.
Diese Sentinelgruppe unterschied sich signifikant in der Virusausscheidung von der
ersten Sentinelgruppe der ungeimpften Gruppe, wo fünf von fünf Tieren das
Belastungsvirus ausschieden (p

73
Tag nach der Belastungsinfektion schieden vier bis fünf Tiere der insgesamt fünf
belastungsinfizierten Tiere und Sentinels der Kontrollgruppe und rHVT-ND geimpften
Gruppe Belastungsvirus aus. Tiere aus der dritten und vierten Gruppe, welche mit
dem Lebendimpfstoff immunisiert worden waren, zeigten nur ein positives Tier aus
der vierten Gruppe am dritten Tag nach der Belastungsinfektion. In der dritten
Gruppe (Lebend ND) schieden am dritten Tag nach der Belastungsinfektion drei von
fünf Sentinels den APMV-1 Stamm LaSota aus, aus der vierten Gruppe (rHVT-
ND/Lebend ND) drei von fünf Tieren am dritten Tag nach Belastungsinfektion und
zwei von fünf Tieren am fünften Tag nach Belastungsinfektion.
APMV-1 wurde auch aus Kloakaltupferproben bei jeweils einem von fünf Tieren am
dritten und fünften und zehnten Tag nach der Belastungsinfektion in nicht geimpften
Tieren nachgewiesen (Tabelle 5). Am dritten Tag nach der Belastungsinfektion
wurde bei einem Tier von fünf aus der rHVT-ND/Lebend ND Gruppe APMV-1
nachgewiesen. Keines der Sentineltiere schied APMV-1 über die Kloake aus (Tabelle
5).
5.6.1 Virusanzucht im embryonierten Hühnerei
Bei der Lebendvirusdetektion wurden Tracheal- und Kloakaltupfer der
belastungsinfizierten Broiler aus dem zweiten Versuch entnommen und mittels
Eianzucht auf APMV-1 untersucht.
Aus Trachealtupfern konnte in der ungeimpften Gruppe infektiöses APMV-1 am
dritten und fünften Tag nach der Belastungsinfektion nachgewiesen werden sowie
am dritten Tag nach der Belastungsinfektion aus der rHVT-ND Gruppe (Tabelle 4).
Aus Kloakaltupfern konnte nur am fünften und siebten Tag nach Belastungsinfektion
APMV-1 in der ungeimpften Gruppe nachgewiesen werden (Tabelle 5).

74
Tabelle 4: Virusausscheidung über die Trachea nach Belastungsinfektion mit dem APMV-1 Stamm LaSota am 35. Tag
nach Impfung.
Tierart Tage nach Challenge ungeimpft Sentinels rHVT-ND Sentinels Lebend ND Sentinels rHVT-ND/ Sentinels
1 2 1 2 1 2 Lebend ND 1 2
SPF 0 0/7 0/7 0/7 0/7
3 5/5 a 5/5 a 5/5 a 0/5 b 0/5 b 0/5 b 0/5 b 0/5 b
5 5/5 a 3/5 a 5/5 a 2/5 a 0/5 b 0/5 b 0/5 b 0/5
7 5/5 a 2/5 5/5 a 1/5 0/5 b 0/5 0/5 b 0/5
10 1/5 1/5 0/5 1/5 0/5 0/5 0/5 0/5
Broiler 0 0/7 0/7 0/7 0/7
3 5/5 a (+) 5/5 4/5 ac (+) 5/5 0/5 b (-) 3/5 1/5 bc (-) 3/5
5 5/5 a (+) 5/5 a 5/5 a (-) 5/5 a 0/5 b (-) 0/5 b 0/5 b (-) 2/5
7 1/5 ab (-) 3/5 4/5 a (-) 1/5 0/5 b (-) 0/5 0/5 b (-) 0/5
10 0/5 (-) 5/5 a 0/5 (-) 4/5 a 0/5 (-) 0/5 b 0/5 (-) 0/5 b
Sentinels 1 – zugesetzte Gruppe von Sentinels (n=5) am 36. Tag nach Impfung. Sentinels 2 – zugesetzte Gruppe von
Sentinels (n=5) am 41. Tag nach Impfung. Mit qRT-PCR wurde APMV-1 aus Trachealtupfern von spezifisch-pathogenen
Hühnern (SPF) und Broilern nach Belastungsinfektion (Challenge) detektiert. „/“ trennt die Anzahl positiver Tiere von der
an diesem Versuchstag getesteten Gesamtzahl. Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen Gruppen und Sentinels, die
sich innerhalb einer Zeile signifikant voneinander unterscheiden (Fisher’s Exact Test; p

75
Tabelle 5: Virusausscheidung über die Kloake nach Belastungsinfektion mit dem APMV-1 Stamm LaSota am 35. Tag nach
Impfung
Tierart Tage nach Challenge ungeimpft Sentinels rHVT-ND Sentinels Lebend ND Sentinels rHVT-ND/ Sentinels
1 2 1 2 1 2 Lebend ND 1 2
Broiler 3 1/5 (-) 0/5 0/5 (-) 0/5 0/5 (-) 0/5 1/5 (-) 0/5
5 1/5 (+) 0/5 0/5 (-) 0/5 0/5 (-) 0/5 0/5 (-) 0/5
7 0/5 (+) 0/5 0/5 (-) 0/5 0/5 (-) 0/5 0/5 (-) 0/5
10 1/5 (-) 0/5 0/5 (-) 0/5 0/5 (-) 0/5 0/5 (-) 0/5
Sentinels 1 – zugesetzte Gruppe von Sentinels (n=5) am 35. Tag nach Impfung. Sentinels 2 – zugesetzte Gruppe von
Sentinels (n=5) am 41. Tag nach Impfung. Mit qRT-PCR wurde APMV-1 aus Kloakaltupfern von Broilern nach
Belastungsinfektion (Challenge) detektiert. „/“ trennt die Anzahl positiver Tiere von der an diesem Versuchstag getesteten
Gesamtzahl. Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen Gruppen und Sentinels, die sich innerhalb einer Zeile signifikant
voneinander unterscheiden (Fisher’s Exact Test; p

76
5.7 Serologische Untersuchungen - humorale Immunantwort
Für die Versuche 1 und 2 wurden von den SPF-Hühnern und den kommerziellen
Broilern am 36. und 43. Tag nach dem Schlupf Blutproben entnommen und der
Antikörperspiegel mit Hilfe eines NDV-Antikörper ELISAs und
Hämagglutinationshemmungstests (HAH) zu den zwei Zeitpunkten (am Tag der
Challenge und sieben Tage nach der Challenge) bestimmt. Bei Broilern wurden
zusätzlich die Titer von nicht belastungsinfizierten Tieren vom 45. Tag nach Impfung
im Säulendiagramm mit aufgeführt (Abb. 14 A, C).
Im ersten Versuch mit SPF-Hühnern zeigten alle Tiere aus geimpften Gruppen
höhere APMV-1 Antikörpertiter als Tiere aus der ungeimpften Kontrollgruppe (Abb.
13 A, B, C). Die Titer beider Gruppen, welche mit dem ND Lebendimpfstoff inokuliert
wurden, zeigten signifikant erhöhte Titer im Vergleich zur Kontrollgruppe (p

77
Im HAH-Test zeigten sich am Tag der Belastungsinfektion die Titer der
Lebendimpfstoffgruppe und die der rHVT-ND/Lebendimpfstoff Kombinationsgruppe
signifikant erhöht zu dem der Kontrollgruppe (p

78
Abb. 13
A
B
C
Abbildung 13 (A-C): Serum-NDV-Antikörpertiter im BioCheck®-ELISA (A), IDEXX®-
ELISA (B) und HAH-Test (C) aus Seren von SPF-Hühnern nach ND Impfung, null
und sieben Tage nach Belastungsinfektion (35 und 42 Tage nach ND Impfung).

79
Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen Gruppen, die sich signifikant
unterscheiden (p

80
Abb. 14
A
B
C
Abbildung 14 (A-C): Serum-NDV-Antikörpertiter im BioCheck®-ELISA (A), IDEXX®-
ELISA (B) und HAH-Test (C) aus Seren von Broilern nach ND Impfung, null und
sieben Tage und 10 Tage nach Belastungsinfektion (=Challenge).

81
Bei den am 10. Tag nach Challenge beprobten Tieren handelte es sich um nichtbelastungsinfizierte
Tiere. Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen Gruppen, die
sich signifikant unterscheiden (p

82
5.8 Durchflusszytometrische Untersuchungen
Abb. 16: Detektion von verschiedenen Milz- (linke Spalte) und peripheren
Blutleukozyten (rechte Spalte) von Broilern mittels Durchflusszytometrie.
A
B
C
D
E
F
G
H

83
Abb. 16: Fortsetzung: Detektion von verschiedenen Milz- (linke Spalte) und
peripheren Blutleukozyten (rechte Spalte) von Broilern mittels Durchflusszytometrie.
I
J
K
L
M
N
O
P

84
Abb. 16: Fortsetzung: Detektion von verschiedenen Milz- (linke Spalte) und
peripheren Blutleukozyten (rechte Spalte) mittels Durchflusszytometrie von Broilern.
Q
R
Abbildung 16 (A-R): Detektion von verschiedenen Milz- (linke Spalte) und peripheren
Blutleukozyten (rechte Spalte) von Broilern mittels Durchflusszytometrie zu
verschiedenen Zeitpunkten nach der ND-Impfung.
Unterschiedlich kleine Buchstaben (a, b) kennzeichnen Gruppen, die sich signifikant
unterscheiden (p

85
geimpften Gruppen im Vergleich zur ungeimpften Gruppe am zehnten Tag pv
detektiert (Abb. 16 B, D, H, J, L, R).
Am 35. Tag pv wurden bei peripheren Blutleukozyten höhere Bu-1+, CD4/γδ+, IgA+
und KUL01+ Zellzahlen in der rHVT-ND Gruppe detektiert (Abb 16 B, H, P, R).
Bei peripheren Blutleukozyten zeigte sich am zehnten Tag nach Impfung zusätzlich
eine signifikante Erhöhung der CD4+ Zellen in der mit beiden Impfstoffen geimpften
Gruppe im Vergleich zur rHVT-ND geimpften Gruppe (p

86
6 Diskussion
6.1 Zielsetzung der Studie
Die ständige Gefahr einer NDV-Infektion erfordert neben umfangreichen Hygieneund
Abschirmungsmaßnahmen eine möglichst frühe protektive Immunität. ND-
Lebendvakzinen sind dafür bekannt, eine gute Immunantwort zu generieren, doch
können sie je nach verwendetem Virusstamm und Zeitpunkt der Anwendung auch
mit klinischen Symptomen und Leistungsdepression einhergehen. Das Ziel einer
Impfung sollte neben der Stimulation von spezifischen und unspezifischen
Immunantworten die Induzierung einer systemischen und lokalen Immunantwort
sein.
ND-Lebendvakzinen können bei einer frühen Applikation durch maternale Antikörper
neutralisiert werden und somit bei der Ausbildung einer protektiven Immunität
gehemmt werden (WESTBURY et al. 1984; BELL et al. 1991; CZIFRA et al. 1998).
Rekombinante HVT-Impfstoffe bieten die Möglichkeit einer sehr frühen Applikation inovo
oder am ersten Lebenstag und weisen eine geringere Interferenz als ND-
Lebendimpfstoffe mit maternalen Antikörpern auf (MORGAN et al. 1992; MORGAN
et al. 1993). Tierversuche, in denen klinische Protektion und Virusausscheidung nach
einer Belastungsinfektion untersucht wurden, zeigten, dass durch eine in-ovo rHVT-
ND Impfung eine verbesserte klinische Protektion und eine signifikante Verringerung
der Virusausscheidung im Vergleich zu den Kontrollgruppen ermöglicht wurde
(PALYA et al. 2012). Fünf Wochen nach Impfung konnten vergleichbare
Antikörpertiter (IgG) in Tränenflüssigkeiten nach Impfung mit rHVT-ND und einem
ND-Lebendimpfstoff gemessen werden (RAUW et al. 2010). Eine Kombination der
rHVT-ND Vakzine mit einer ND-Lebendvakzine erhöht die klinische Protektion
(RAUW et al. 2010). Ob nach einer Applikation von rHVT-ND auch eine lokale
zellvermittelte Immunität an der Haupteintrittsspforte des APMV-1, dem oberen
Respirationstrakt erzeugt wird, wie bei einer Lebendvakzine, ist unklar.
Untersuchungen zur möglichen Vermehrung von lokalen Immunzellzahlpopulationen

87
in Organen des oberen Respirationstraktes sowie der Lunge und Zäkaltonsille als
weitere ND-Zielorgane liegen nicht vor.
In unserer Studie wurde der Vektorimpfstoff rHVT-ND mit der ND-Lebendvakzine
„Clone 30“, basierend auf dem lentogenen APMV-1 Clone 30 Stamm, hinsichtlich der
Induktion unterschiedlicher Immunparameter verglichen und auch kombininert
getestet. Es wurde die Induktion von lokalen und systemischen Immunreaktionen
nach subkutaner rHVT-ND und Augentropfen-Lebendimpfstoff-Applikation sowohl bei
SPF-Hühnern als auch bei kommerziellen Broilern festgestellt. Im Vergleich zu einer
ND-Lebendvakzine fielen die lokalen, humoralen und zell-vermittelten
Immunantworten bei einer rHVT-ND-Impfung niedriger aus. Die Kombination beider
Impfstoffe führte jedoch bei einigen Immunparametern zu einer noch höheren
Immunantwort als die alleinige Applikation der Lebendvakzine. Diese Effekte stellten
sich bei SPF-Hühnern deutlicher dar als bei Broilern.
6.2 Klinisches Bild nach Impfung mit rHVT-ND und ND-
Lebendimpfstoff sowie nach APMV-1 Stamm LaSota
Belastungsinfektion
Bei einer Impfung mit HVT zeigen Hühner normalerweise keine klinischen
Symptome, da HVT für Hühner apathogen ist (SONDERMEIJER et al. 1993). In
unseren Versuchen wurden nach alleiniger subkutaner rHVT-ND-Applikation sowie
auch in Kombination mit dem ND-Lebendimpfstoff keine klinischen Symptome nach
der Impfung beobachtet. Unter Feldbedingungen mit höherem Infektionsdruck und
zusätzlichen Stressfaktoren für die Tiere können sich nach einer sehr frühen ND-
Lebendimpfung jedoch durchaus auch gelegentlich milde respiratorische Symptome
entwickeln und je nach Infektionsdruck komplizieren (NAKAMURA et al. 1994). Es
können hierbei auch pathologische und histopathologische Veränderungen auftreten.
Respiratorische Symptome nach einer ND-Lebendimpfung werden zum Beispiel bei
einer Mycoplasma gallisepticum Co-Infektion beschrieben (SATO et al. 1970).

88
Die Belastungsinfektion mit dem APMV-1 Stamm LaSota fand am 35. Tag nach der
Impfung statt. Wie erwartet, wurden keine klinischen Symptome beobachtet.
6.3 Pathologische und histopathologische Läsionen nach ND-
Impfung
Es konnten bei keinem der untersuchten Tiere pathologisch-anatomische Läsionen,
weder nach Impfung noch nach Belastungsinfektion, detektiert werden. Zehn Tage
nach der ND-Lebendimpfung wurden geringgradige histopathologische
Veränderungen bei SPF-Hühnern beobachtet. Bei okularer, intranasaler oder
Sprayverabreichung von lentogenen ND-Lebendvakzinen werden häufig zu frühen
Zeitpunkten milde respiratorische Symptome beobachtet (ALLAN u. LANCASTER
1978). Auch milde histopathologische Veränderungen im Respirationstrakt, wie sie
hier beobachtet wurden, können nach Impfung auftreten (KOTANI et al. 1987).
Nach rHVT-ND- oder ND-Lebendimpfung von kommerziellen Broilern wurden in
dieser Studie keine histopathologischen Veränderungen beobachtet.
HVT gelangt nach Applikation über die Lunge in den Organismus. Hierbei wird es
von phagozytierenden Zellen aufgenommen, bleibt ab diesem Zeitpunkt strikt
intrazellulär und wird zu lymphoiden Geweben transportiert, wo es zuerst B-
Lymphozyten und dann aktivierte T-Lymphozyten infiziert (HOLLAND et al. 1998;
DAVISON 2004a). Diese Phase dauert etwa sieben Tage an. Danach wird die
Latenzphase eingeleitet, in der das Virus hauptsächlich in CD4+ T-Lymphozyten und
anderen Lymphozytenpopulationen persistiert. Während dieser Phasen führte HVT
zu keinen pathologischen oder zytolytischen Veränderungen in lymphoiden Organen
(FABRICANT et al. 1982). Auch kommt es zu keinen immunsuppressiven Einflüssen
oder zu Beeinträchtigungen der Integrität der mukosalen Oberflächen (FRIEDMAN et
al. 1992).

89
6.4 Einfluss von rHVT-ND und dem ND-Lebendimpfstoff auf
Immunparameter
6.4.1 Systemische Immunparameter
6.4.1.1 Humorale Immunparameter
rHVT-ND und die ND-Lebendvakzine induzierten sowohl bei den SPF-Hühnern als
auch bei Broilern messbare APMV-1 Serum-Antikörpertiter, welche sich fünf Wochen
nach der Impfung im HAH-Test und ELISA nachweisen ließen. Der durch rHVT-ND
induzierte Antikörpertiter ist niedriger als der der Lebendvakzine. Nach einer
Belastungsinfektion erhöhten sich die Serum-Antikörpertiter in allen Gruppen (Abb.
13+14).
Der von rHVT-ND induzierte Antikörpertiter war vermutlich niedriger als der der
Lebendvakzine, da rHVT-ND nur das F-Protein exprimierte. Neben weiteren
Faktoren, wie der unterschiedlichen Verteilung und Replikationsrate der beiden
Impfstoffe, könnte die Tatsache, dass bei einer ND-Lebendimpfung Antikörper gegen
weitere APMV-1 spezifische virale Polypeptide gebildet werden, eine Ursache für die
unterschiedlichen Höhen der Antikörpertiter sein (REYNOLDS u. MARAQA 2000a).
Die Anti-F-Antikörper gegen rHVT-ND stellten sich in unserer Studie auch durch den
HAH-Test detektierbar dar. Auch Palya et al. zeigten in ihrer Studie von 2012, dass
die durch rHVT-ND induzierten, gegen das APMV-1 F-Protein gerichteten Antikörper
HAH-Eigenschaften besitzen. Palya et al. (2012) spekulierten, dass hierfür eine
sterische Hinderung der Virusanhaftung an die Erythrozyten durch die gegen das F-
Protein gerichteten Antikörper verantwortlich sein könnte (PALYA et al. 2012).
Im Gegensatz dazu wurden in einer Studie von Morgan et al. von 1992 praktisch
keine Antikörper im HAH-Test und ELISA nach einer rHVT-ND Impfung bei Hühnern
detektiert (MORGAN et al. 1992). Jedoch ist der detektierbare Antikörpertiter auch
abhängig vom eingesetzten ELISA Kit, bzw. der Antigenkonzentration im HAH-Test.
In unserer Studie zeigte ein sensitiveres ELISA Test-Kit durchaus messbare
Antikörpertiter, wohingegen sich in einem anderen ELISA Test-Kit die Antikörpertiter
generell niedriger darstellten (Abb. 13+14). Morgan et al. setzten eine

90
Antigenkonzentration von zehn hämagglutinierenden Einheiten (HAU) ein (MORGAN
et al. 1992), während in unserer Studie vier HAUs genutzt wurden. In einem
Übersichtsartikel von 2013 bewerteten Kapczynski et al. die durch rHVT-ND
induzierten HAH- und ELISA-Antikörpertiter als nicht geeignetes Mittel, um für diese
Vakzine eine Aussage über die Immunität zu treffen, da diese häufig zu niedrig
ausfallen (KAPCZYNSKI et al. 2013). Dies ist jedoch abhängig von der
angewendeten serologischen Untersuchungsmethode.
Die Titer der SPF-Hühner, welche mit beiden Impfstoffen vakziniert wurden, waren
höher als die Titer der Tiere, welche nur eine Vakzine erhalten hatten (Abb. 13 A, B,
C). Bei SPF-Hühnern waren alle ND-Antikörper-Titer der Kombinationsgruppen zu
beiden Probezeitpunkten signifikant erhöht im Vergleich zu der Kontrollgruppe, außer
im IDEXX® ELISA Test Kit (Abb.13). Bei Broilern zeigten sich diese signifikanten
Unterschiede der mit beiden Impfstoffen geimpften Gruppe nur in einem ELISA-Test
Kit (Abb. 14 B).
Im zweiten Versuch wurden zusätzlich die ND-Antikörpertiter aus Tränenflüssigkeiten
im ELISA Test-Kit bestimmt. Fünf Wochen nach Impfung konnte ein erhöhter Gehalt
an ELISA-IgG-Antikörpern in Tränenflüssigkeiten in allen geimpften Gruppen gezeigt
werden. Am höchsten waren diese Titer in der Kombinationsgruppe. Unsere
Ergebnisse bestätigen die auch von Rauw et al. gezeigten Ergebnisse. Hier zeigten
ebenfalls die mit rHVT-ND in Kombination mit einem Lebendimpfstoff geimpften
Gruppen die höchsten ND-Antikörpertiter in Tränenflüssigkeiten im Vergleich zu
einzeln geimpften Gruppen (RAUW et al. 2010).
Sieben Tage nach der Belastungsinfektion mit dem APMV-1 Stamm LaSota zeigten
sich sowohl im ELISA- als auch im HAH-Titer deutliche Boostereffekte (MAJIYAGBE
u. HITCHNER 1977). Dieser Boostereffekt entsteht, wenn sich nach einem primären
Antigenkontakt Gedächtnis B-Zellen im ganzen Körper verteilt haben und diese
Zellen auf einen wiederholten Antigenkontakt mit einer erneuten und schnelleren
Immunantwort als bei primärem Antigenkontakt reagieren (JEURISSEN et al. 2000).
Dadurch werden schnellere humorale und lokale Immunantworten ermöglicht. Dieser
Effekt zeigte sich im ELISA sowie im HAH-Test in beiden Versuchen.

91
Bei SPF-Tieren wurden fünf Wochen nach der Impfung deutlich höhere Titer in den
Lebendimpfstoffgruppen detektiert als bei kommerziellen Broilern, welche maternale
Antikörper besaßen. Die Hemmung des ND-Lebendimpfstoffes durch maternale
Antikörper ist hier vermutlich ausgeprägter als die des rHVT-ND. Diese durch
maternale Antikörper induzierte Hemmung einer Lebendvakzine wurde auch in
anderen Studien gezeigt (MORGAN et al. 1993). Bei rHVT-ND beeinträchtigt die
Hemmung durch maternale Antikörper, welche gegen den Vektor oder das
Fremdantigen gerichtet sein können, die Replikationsrate des Virus und somit die
Ausbildung einer Protektivität nur unwesentlich (MORGAN et al. 1993).
Die Kombination von rHVT-ND mit dem Lebendimpfstoff induzierte in unserer Studie
die höchsten Antikörpertiter. Dies konnte auch bei einer Kombination von einem ND-
Lebendimpfstoff mit einem inaktivierten Impfstoff beobachtet werden (FOLITSE et al.
1998).
Es kann spekuliert werden, dass durch den Lebendimpfstoff ein „Priming“ des
Immunsystems stattfindet, bei dem eine spezifische Immunität gebildet wird. Bei
einer parallelen rHVT-ND Applikation befindet sich rHVT-ND etwa ab dem siebten
Tag nach Impfung in der Latenzphase, wodurch eine kontinuierliche
beziehungsweise wiederholende Stimulation des Immunsystems aufrechterhalten
bleibt.
Am 45. Tag nach der Impfung registrierten wir in nicht belastungsinfizierten Tieren
einen Rückgang der Antikörperproduktion, welcher bei der lebendgeimpften Gruppe
deutlicher ausfiel als bei der Kombinationsgruppe (Abb. 14 A,C).
6.4.1.2 Zell-vermittelte Immunität
Eine durchflusszytometrische Untersuchung erlaubt eine Messung der relativen
Zahlen von Immunzellpopulationen und ermöglicht somit einen Hinweis auf eine
Impfstoff-induzierte Stimulation des Immunsystems. In Experiment 2 dieser Studie
wurden periphere Blut-Leukozyten zehn und 35 Tage nach Impfung und Milzzellen
fünf und 35 Tage nach der Impfung auf CD4+, CD8+, BU-1+, KUL01 und IgA+ Zellen
sowie auf die αβ- und γδ- T-Zellsubpopulationen untersucht.

92
Zwischen den beiden Zeitpunkten war ein Unterschied in den relativen Zellzahlen der
ungeimpften und geimpften Gruppen zu erkennen. Diese zeigten sich am 35. Tag
nach der Impfung bis auf einige Ausnahmen prozentual erhöht. Bei peripheren
Blutleukozyten waren diese Unterschiede deutlicher als bei den Milzzellen. Diese
Zellzahlerhöhungen an einem späteren Zeitpunkt nach der ND-Impfung könnten auf
einen altersbedingten Unterschied in den relativen Zellzahlen hindeuten, da sich die
gleichen Unterschiede auch in den nicht geimpften Gruppen außer bei BU-1+
Milzzellen zeigen. Hier befanden sich die Zellzahlen der ungeimpften Tiere an beiden
Zeitpunkten auf einer Höhe.
In Milzen zeigte sich am fünften Tag nach der Impfung eine Erhöhung des relativen
Anteils von CD4+ Zellen in geimpften Gruppen. Diese Erhöhung fiel noch deutlicher
in der dual-vakzinierten Gruppe aus, was in Zusammenhang mit der Kombination
von rHVT-ND mit dem Lebendimpfstoff stehen kann und auf einen additiven Effekt
der beiden Impfstoffe hindeutet (Abb. 16 C). In diesem Experiment wurde rHVT-ND
am 10. Tag nach Applikation in Milzen von SPF-Hühnern nachgewiesen. In anderen
Studien konnte HVT vier bis 14 Tage nach Einbringung in den Organismus in der
Milz nachgewiesen werden (FABRICANT et al. 1982). Eine Replikation von rHVT-ND
in der Milz könnte hier in Zusammenhang mit dem erhöhten CD4+ Zellanteil stehen.
Eine Erhöhung fand sich auch am fünften Tag bei CD4+/αβ+, CD4+/γδ und
CD8+/αβ+ Milzzellen in rHVT-ND geimpften Gruppen.
35 Tage nach der Impfung zeigten sich deutlichere Erhöhungen in der rHVT-ND
Gruppe im Vergleich zu der Kontrollgruppe bei Bu-1+, CD4+, CD4+/γδ+, CD8+,
CD8+/αβ+ und CD8+/γδ+ Milzzellen. Die Erhöhung dieser Zellzahlparameter könnte
ebenfalls mit einer rHVT-ND Replikation in Verbindung stehen.
Der prozentuale Anteil von KUL01+ Zellen zeigte sich hier in zirkulierenden
Blutleukozyten 10 Tage nach rHVT-ND Impfung, aber auch nach ND-
Lebendimpfung, erhöht. Der Transport von HVT von der Lunge in die lymphoiden
Organe erfolgte durch Makrophagen, was eine Erhöhung dieser Zellzahlen
verursachen könnte (DAVISON 2004b).

93
Eine antivirale Immunität gegen Herpesviren wird prinzipiell durch CD8αβ+
zytotoxische T-Lymphozyten und CD4+ Helferzellen eingeleitet (DAVISON 2004a).
CD4+ und CD4/γδ+ Zellzahlen zeigten Erhöhungen in Milzen in rHVT-ND geimpften
Gruppen an beiden Zeitpunkten. Eine deutliche Erhöhung von CD8αβ+ in Milz und
PBL konnte jedoch nicht in rHVT-ND geimpften Gruppen beobachtet werden.
CD4+ periphere Blut-Leukozyten zeigten am zehnten Tag nach der Impfung eine
Erhöhung in den mit Lebendimpfstoff geimpften Gruppen im Vergleich zur
ungeimpften und rHVT-ND Gruppe. Dies bestätigt die Studie von Dalgaard et al. von
2010, wo durch eine ND-Lebendimpfung oder -Infektion eine antigenspezifische
Proliferation von zirkulierenden CD4+ und CD8+ T-Zellen hervorgerufen wurde
(DALGAARD et al. 2010). Diese am zehnten Tag pv erfolgte Erhöhung in den mit
Lebendimpfstoff geimpften Gruppen zeigte sich nicht am 35. Tag pv.
6.4.2 Lokale Immunität
6.4.2.1 Effekt auf lokale Immunzellpopulationen
Die erste zelluläre Immunantwort gegen virale Erreger erfolgt durch natürliche
Killerzellen (NK-Zellen), Granulozyten und Makrophagen. Sobald APMV-1 die
Barrieren der angeborenen Immunität überwunden hat, wird eine weitere, pathogenspezifische
Immunantwort durch T- und B-Zellen eingeleitet, welche sich in lokaler
Erhöhung dieser Zellzahlen äußert. In Abbildung 17 und 18 sind die signifikanten
Anstiege von Immunzellpopulationen in den einzelnen Organen nach ND-Impfung
von SPF-Hühnern und Broilern des Ergebnisteils zusammengefasst.
Interstitielle CD8+ und CD4+ Zellpopulationen wurden rund um die
Ausführungsgänge der Harderschen Drüse bereits am ersten Tag nach dem Schlupf
gefunden und stiegen bei ungeimpften Tieren dann bis zur achten Lebenswoche an
(DUMRONGSOONTORNCHAI 1999). Nach ND-Lebendimpfung zeigten sich in
dieser Studie jedoch schon früher erhöhte T- und B-Zellpopulationen in Harderschen
Drüsen.

94
Bei SPF-Hühnern zeigte sich zehn Tage nach der ND-Lebendimpfung ein Anstieg
von CD4+, CD8+, BU-1+, KUL01+ und IgA+ Zellen in der Harderschen Drüse im
Vergleich zur Kontrollgruppe. Dieses Ergebnis steht in Zusammenhang mit dem
Lebendimpfstoff, welcher die Erhöhung dieser Zellzahlen induziert (RUSSELL et al.
1997). CD8+ Zellen tragen zur viralen Clearance bei, da sie lokal APMV-1-befallene
Zellen töten (AL-GARIB 2003).
Bei Broilern zeigten sich am fünften Tag nach Lebendimpfung CD4+, CD8+, Bu-1+,
KUL01+ und IgA+ Zellen in Harderschen Drüsen ebenfalls erhöht. Bei CD4+, CD8+,
Bu-1+ und KUL01+ Zellen fielen diese Erhöhungen signifikant im Vergleich zur nicht
geimpften Gruppe aus (Abb 18).
Bei SPF-Tieren zeigten sich in der Harderschen Drüse am zehnten Tag nach rHVT-
ND Impfung ebenfalls Anstiege in der zweiten Gruppe von CD4+, CD8+, Bu-1+ und
KUL01+ Zellen in der Harderschen Drüse im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abb. 7 A,
C, E, G). Falls rHVT-ND die Hardersche Drüse erreicht, könnte dies mit einer
Herpesvirus-spezifischen Zellabwehr in Verbindung stehen (DAVISON 2004a).
Bei SPF-Hühnern wurde ein signifikanter Anstieg von BU-1+ Zellen in Harderschen
Drüsen im Vergleich zur ungeimpften Gruppe am zehnten Tag pv in der mit dem ND-
Lebendimpfstoff allein geimpften Gruppe festgestellt. Bei Broilern zeigte sich ein
signifikanter Anstieg von B-Zellen fünf Tage nach der ND-Impfung bei beiden mit ND-
Lebendimpfstoff geimpften Gruppen, am zehnten Tag stiegen nur Bu-1+ Zellen der
dual-vakzinierten Gruppe an, jedoch nicht signifikant. Der BU-1 Marker wird auf jeder
B-Zelle, außer auf Plasmazellen, detektiert (HOUSSAINT et al. 1987). Nach einer
konjunktivalen Impfung mit einer ND Lebendvakzine stiegen BU-1 Zellpopulationen
in der Harderschen Drüse um das Zweifache an (RUSSELL et al. 1997). Dies konnte
in unserer Studie nach ND-Lebendimpfung bei SPF-Tieren bestätigt werden.
In der rHVT-ND einzeln geimpften Gruppe zeigten sich erkennbare, aber nicht
signifikante Anstiege von Bu-1+ Zellen bei Broilern fünf Tage nach der Impfung und
bei SPF-Hühnern zehn Tage nach der Impfung in der Harderschen Drüse.
Die Hardersche Drüse bei Hühnern besitzt interstitielle Plasmazellpopulationen,
welche bis zur vierten Lebenswoche prozentual ansteigen und von dem Zeitpunkt an

95
ein Plateau erreichen (DUMRONGSOONTORNCHAI 1999). IgA+ Zellen können
bereits einen Tag nach dem Schlupf in den Harderschen Drüsen von nicht-geimpften
Broilern detektiert werden (DUMRONGSOONTORNCHAI 1999). Durch ND-
Lebendimpfung erfolgte eine Erhöhung dieser Zellen in dieser Studie.
Bei der Untersuchung von Zellzahlen in der Lunge war eine serienmäßige
Anfertigung und Auswertung von Anschnitten des Bronchus-assoziierten lymphoiden
Gewebes (BALT) aufgrund der Kleinheit der BALT-Areale nicht möglich. Es wurden
stattdessen Lungenparenchymbereiche um Parabronchien in unmittelbarer Nähe der
BALT-Areale ventral der Ausmündungen der Sekundärbronchien untersucht und
bewertet. Diese Bereiche eigneten sich gut zur Auszählung von Immunzellen und
erlauben durch ihre Nähe zu den Sekundärbronchien eine Bewertung von lokalen
Immunreaktionen.
In dieser Studie wurden Anstiege von T-Zellpopulationen im Lungenparenchym bei
SPF-Hühnern und Broilern registriert, was mit einer Virusreplikation in Verbindung
stehen könnte. Hierbei wurde eine signifikante Erhöhung von CD4+ Zellen im
Vergleich zur Kontrollgruppe in dual vakzinierten SPF-Tieren festgestellt (Abb. 17).
Bei Broilern zeigten sich signifikante Anstiege der CD4+ Zellzahlen am fünften Tag
nach Impfung in der rHVT-ND geimpften Gruppe (Abb. 18).
HVT sowie rekombinante Varianten von HVT replizieren lokal in der Lunge (GIMENO
et al. 2011). In dieser Studie wurden Anstiege von CD4+ und CD8+ Zellpopulationen
in Lungen von SPF-Hühnern und Broilern detektiert, was mit der lokalen
Virusreplikation in Verbindung stehen könnte. rHVT persistiert und zirkuliert für
mindestens 30 Wochen in lokalen Lymphozyten und peripheren Blutleukozyten
(TSUKAMOTO et al. 2002). Diese dringen in lymphoide Gewebe des Respirationsund
Gastrointestinal-Traktes ein, wo lokal Fremdantigene präsentiert werden
(TSUKAMOTO et al. 2002). Es ist bekannt, dass Marek’s Disease Herpesviren in der
zytolytischen Phase der Erkrankung von Makrophagen aus den Lungen in den
Blutkreislauf transportiert werden und von dort aus strikt zell-assoziiert über
lymphoide Zellen in die lymphoiden Gewebe gelangen. Virales MDV-Genom kann in
der Milz, dem GALT, der Zäkaltonsille, der Harderschen Drüse und dem CALT vom
zweiten bis zum siebten Infektionstag nachgewiesen werden (BARROW et al. 2003;

96
DAVISON 2004b). Inwieweit rHVT-ND bei einer subkutanen oder in-ovo Applikation
diese Gewebe erreicht, ist nicht bekannt.
In der Zäkaltonsille konnte ein Anstieg von CD8+ Zellen in der rHVT-ND einzeln
geimpften Gruppe bei SPF-Tieren festgestellt werden (Abb. 12 C). KUL01+ Zellen
zeigten sich in den beiden mit ND-Lebendimpfstoff geimpften Gruppen zu diesem
Zeitpunkt ebenfalls erhöht (Abb 12 G). Bei Broilern konnte in Zäkaltonsillen in allen
geimpften Gruppen am fünften Tag pv leicht erhöhte CD4+ Zellzahlen detektiert
werden (Abb. 3 D) und zehn Tage nach Impfung leicht erhöhte B-Zellzahlen (Abb. 12
F). CD8+ Zellen zeigen sich bei SPF-Tieren 10 Tage pv in der rHVT-ND Gruppe
erhöht (Abb. 12 C). Wenn rHVT-ND die Zäkaltonsille erreicht, könnte auch hier eine
Herpesvirus spezifische CD8-T-Zellabwehr eine Erklärung für die erhöhten CD8+
Zellen sein (DAVISON 2004a), jedoch findet sich hier keine Erhöhung von CD8+
Zellen in der rHVT-ND mit Lebendimpstoff kombinierten Gruppe (Abb. 12 C).
Die Erhöhung von KUL01+ Zellen bei SPF-Tieren am zehnten Tag nach ND-
Lebendimpfung in Zäkaltonsillen könnte mit einer APMV-1 Replikation in Verbindung
stehen, jedoch repliziert der hier beteiligte APMV-1 Stamm LaSota-Klon „Clone 30“
normalerweise nur im Respirationstrakt (WAKAMATSU et al. 2006).
Bei der Auswertung des Konjunktiva-assoziierten lymphatischen Gewebes(CALT)
konnten im ersten Versuch bei SPF-Hühnern aufgrund der aufrechten Einbettung der
Augenlider auf dem Papier zu wenige BALT-Areale serienmäßig angeschnitten
werden, um eine statistische Beurteilung durchzuführen. Im zweiten Versuch wurde
das Augenlid flach mit der Rückseite auf das Filterpapier gelegt. Somit waren
serienmäßige Anschnitte möglich. Bei Broilern zeigten sich Anstiege von CD4+ und
CD8+ Zellzahlen in ND-lebendgeimpften Gruppen, welche vermutlich durch eine
lokale APMV-1 Virusreplikation des Impfvirus Clone 30 hervorgerufen wurden
(RUSSELL et al. 1997).
Zusammengefasst zeigte sich in Harderschen Drüsen nach einer rHVT-ND Impfung
eine Erhöhung von CD4+, CD8+, Bu-1+ und KUL01+ Zellen und eine Erhöhung
dieser Zellen in der Lunge am zehnten Tag nach Impfung von SPF-Hühnern. In der

97
Lunge von Broilern wurde ein signifikanter Anstieg von CD4+ T-Zellen am fünften
Tag nach rHVT-ND Impfung festgestellt (Abb. 18). Der ND-Lebendimpfstoff erzeugt
in Harderschen Drüsen von SPF-Hühnern eine signifikante Erhöhung von CD4+, Bu-
1+ und KUL01+ Zellen im Vergleich zur ungeimpften Gruppe (Abb. 17).
In der Harderschen Drüse von Broilern sind die signifikanten Unterschiede zur
ungeimpften Gruppe am fünften Tag nach ND-Lebendimpfung bei CD4+, CD8+, Bu-
1+ und KUL01+ Zellen detektiert worden (Abb. 18). In der Lunge zeigten sich bei
Broilern fünf Tage nach ND-Lebendimpfung erhöhte CD4+ und CD8+ Zellzahlen.
Diese Zellinfiltrate interferieren lokal mit der Virusreplikation und bieten somit Schutz
vor einer NDV-Infektion (AL-GARIB 2003). rHVT-ND erhöht lokale
Immunzellpopulationen in Harderscher Drüse und Lunge. Diese sind niedriger als
nach einer Impfung mit der Lebendvakzine.

98
SPF
Zelltypen
Hardersche Drüse Lunge
Zäkaltonsille
R L R+L R L R+L R L R+L
CD4+
CD8+
Bu-1+
KUL01+
IgA+
Abbildung 17: Übersicht über signifikant erhöhte Immunzellparameter von SPF-
Hühnern am zehnten Tag nach ND-Impfung (p

99
Schwarzer Pfeil: signifikant erhöhte Immunzellzahlen im Vergleich zur ungeimpften
Gruppe am fünften Tag nach Impfung;
R= rHVT-ND-geimpfte Gruppen; L = Lebendimpfstoff-geimpfte Gruppen; R+L = mit
rHVT-ND und Lebendimpfstoff-geimpfte Gruppen; CALT= Konjunktiva-assoziiertes
lymphatisches Gewebe
6.4.2.2 Antikörper in Tränenflüssigkeiten
Lokale Anti-APMV-1 IgG Antikörper wurden im zweiten Versuch nach Impfung von
kommerziellen Broilern aus Tränenflüssigkeiten am 36. Versuchstag bestimmt. Eine
Studie von Rauw et al. von 2010 (RAUW et al. 2010) zeigte eine lokale, gegen
APMV-1 gerichtete IgG-Antikörper-Antwort in Tränenflüssigkeiten von Hühnern fünf
Wochen nach Impfung mit rHVT-ND. Dort zeigten Gruppen, welche mit einer
Lebendvakzine geimpft worden waren, erhöhte lokale IgG-Titer in
Tränenflüssigkeiten. Dies wurde auch durch unsere Studie bestätigt. Die Höhen der
lokalen IgG-Titer korrelierten hierbei mit den Antikörper-Serumwerten. Die mit beiden
Impfstoffen vakzinierten Gruppen zeigten eine signifikante Erhöhung der Titer und
den höchsten Titer aller Gruppen in Tränenflüssigkeiten im Vergleich zur
Kontrollgruppe, ähnlich wie bei den Serumtitern.
Eine mögliche Ursache für das Vorkommen dieser IgG-Antikörper in und auf den
Schleimhäuten kann eine partielle Transsudation aus dem Blut in lokale lymphoide
Gewebe sein (AL-GARIB et al. 2003). Jedoch werden IgG-Antikörper auch lokal in
der Submukosa produziert (KAETZEL et al. 1994). Ein ähnliches Phänomen kann
nach Impfung mit inaktivierten ND-Vakzinen beobachtet werden, welche bei
parenteraler Applikation hauptsächlich eine humorale Immunantwort generieren.
Diese Vakzinen erzeugen einen sehr hohen und langanhaltenden humoralen Titer
durch lange Antigenpräsentation. Auch hier können lokale Anstiege in
Tränenflüssigkeiten und trachealen Waschungen von spezifischen Anti-APMV-1
Antikörpern beobachtet werden, wie eine Studie von Zoth et al. von 2008 zeigte
(CHIMENO ZOTH et al. 2008). Al-Garib et al. zeigten 2003 in ihrer Studie, dass
sowohl spezifische IgM als auch IgG, aber nicht IgA nach Impfung mit einer

100
inaktivierten Vakzine in Trachealflüssigkeiten anstiegen (AL-GARIB et al. 2003). Die
in unserer Studie detektierten IgG-Antikörper aus den Tränenflüssigkeiten sind daher
Bestandteil der lokalen Immunität, aber wahrscheinlich hauptsächlich systemischen
Ursprungs. Diese Antikörper tragen durch Neutralisierung der Viren und
Verhinderung der initialen Replikation lokal an den Eingangspforten des APMV-1 zur
protektiven Immunität gegen die ND bei.
6.5 Virusausscheidung
Eine Infektion, Ausscheidung und Übertragung von APMV-1 kann ohne klinische
Erkrankung stattfinden. Impfprogramme reduzieren die klinische Erkrankung und
Mortalität während eines Newcastle Disease Ausbruches, die Virusausscheidung
und Übertragung wird aber nicht in jedem Fall reduziert, sodass sich die Erkrankung
endemisch ausbreiten kann (DORTMANS et al. 2012). APMV-1 wird über
oropharyngeale Sekrete und auch über Faeces ausgeschieden. Immunisierte Hühner
scheiden APMV-1 normalerweise für sechs bis acht Tage nach einer
Belastungsinfektion aus (KAPCZYNSKI u. KING 2005).
rHVT-ND bietet vollen klinischen Schutz nach in-ovo und subkutan- Applikation
gegen eine Newcastle Disease Virus Belastungsinfektion (Stamm TEXAS G.B./48)
(REDDY et al. 1996). Bei Untersuchungen zur lokalen respiratorischen Immunität in
diesem Versuch wurde eine Virusausscheidung jedoch nicht verhindert. Das
Belastungsvirus konnte fünf Tage nach einer in der vierten Lebenswoche
stattgefundenen Belastungsinfektion aus Tracheen fast aller Tiere isoliert werden,
was bei einer in diesem Experiment verwandten Lebendvakzine nicht der Fall war
(REDDY et al. 1996). Die Erhöhung der rHVT-ND Impfdosis hatte in dem Versuch
von Reddy et al. keinen Einfluss auf die lokale Virusausscheidung. Ebenfalls wurde
in jener Studie spekuliert, dass die unterschiedlichen Ausbreitungswege der beiden
Vakzinen einen unterschiedlichen Einfluss auf die Immunität haben. Herkömmliche
respirotrope Lebendvakzinen replizieren vermehrt lokal, infizieren den
Respirationstrakt und erzeugen dort eine lokale Immunität, wohingegen rHVT-ND
zell-assoziiert repliziert und sich systemisch verbreitet.

101
Klinische Ausbrüche der ND können jedoch auch nach ND-Impfung stattfinden (KE
et al. 2010). Eine antigenetische und/oder phylogenetische Variation zwischen Impfund
Feldvirus kann als mögliche Ursache für eine ungenügende Immunisierung und
dadurch resultierende Feld-Virusausscheidung in Frage kommen. Die heutzutage
gängigsten Lebendimpsftoffe basieren auf APMV-1 Virusstämmen, welche
phylogenetisch zu den Genotypen I und II gehören. APMV-1 Virusstämme, welche in
den letzen zwei Jahrzehnten verantwortlich für Ausbrüche der ND waren, gehörten
zu Genotyp IV, V und VII (YU et al. 2001; ABOLNIK et al. 2004; PEDERSEN et al.
2004; LIEN et al. 2007; LIU et al. 2007; IRVINE et al. 2009; KE et al. 2010).
Eine genetische Übereinstimmung von Impf- und Feldviren, kann, muss aber nicht
mit einer besseren Protektion in Verbindung stehen (KAPCZYNSKI u. KING 2005;
MILLER et al. 2007; HU et al. 2009; MILLER et al. 2009a). Genotypisch
unterschiedliche Impfstoffe besitzen in einer von Dortmans et al. gezeigten Studie die
gleichen protektiven Eigenschaften wie eine Lebendvakzine des gleichen Genotyps
(DORTMANS et al. 2012). Für einen Impferfolg sind gute Impfpraxis, Hygiene- und
Stallmanagement ebenso ausschlaggebend wie die Wahl des richtigen
Impfprogrammes. Ein möglichst hoher homogener Antikörpertiter innerhalb der
Herde sowie eine möglichst geringe Virusausscheidung sind Hauptziele einer ND-
Immunisierung. Eine Lebenvakzine kann neben Anpassung an phylogenetische und
antigenetische Gegebenheiten auch mit inaktivierten Impfstoffen gegen die ND
kombiniert werden, um eine stärkere humorale Immunantwort herbeizuführen
(GIAMBRONE u. CLAY 1986; FOLITSE et al. 1998). Eine Kombination von rHVT-ND
mit einem Lebendimpfstoff ist eine Alternative zu gängigen Lebendimpfstoff-Inaktivat
Kombinationen.
In unserem Versuch war bei SPF-Hühnern die Virusausscheidung in der rHVT-ND
Gruppe und in der Kontrollgruppe am dritten, fünften und siebten Tag vergleichbar
hoch. In der rHVT-ND-Gruppe fand somit keine signifikante Reduzierung der
Virusausscheidung statt, wie in ND-Lebendgeimpften Gruppen. Die Virusübertragung
auf die Kontaktsentinels war in der rHVT-ND Gruppe jedoch im Vergleich zur
Kontrollgruppe signifikant verringert. rHVT-ND induzierte also eine Teilimmunität, die
zu einer Reduktion der Virusübertragung nach Belastungsinfektion führte. Die

102
Lebendimpfstoffgruppe und die Kombinationsgruppe zeigten protektive
respiratorische Immunität, kein Tier schied Virus nach Belastungsinfektion aus.
Bei kommerziellen Broilern wurde die bei SPF-Tieren beschriebene Teilimmunität
nicht beobachtet, in der rHVT-ND Gruppe fand eine volle Virusausscheidung und
Übertragung statt. Die Lebendvakzine zeigte eine signifikante Reduzierung der
trachealen Virusausscheidung im Vergleich zu ungeimpften Tieren. Bei SPF-Tieren
stellte sich eine signifikante Reduzierung der Übertragung von Belastungsvirus auf
naive Empfängertiere in der rHVT-ND Gruppe dar, was bei Broilern nicht
beobachetet wurde. Weiterführende Untersuchungen mit unterschiedlichen
Belastungsvirusstämmen von unterschiedlicher Virulenz könnten hilfreich sein, um
die Protektivität von rHVT-ND zu prüfen.
6.6 Vergleich von SPF-Hühnern und Broilern
Aufgrund genetischer Selektion unterscheiden sich Broiler und Hühner vom Legetyp
in ihren immunologischen Eigenschaften (KOENEN et al. 2002). Humorale und
zelluläre Immunantworten fallen bei Legehennen generell höher aus als bei Broilern,
welche wahrscheinlich aufgrund der gezielten Selektion auf Körpergewicht und
Futterverwertung immunologische Nachteile besitzen (KOENEN et al. 2002). So
reagierten Legehennen beispielsweise nach intravenöser Applikation von 2,4,6-
Trinitrophenyl mit einer höheren IgG-Antwort als Broiler (KOENEN et al. 2002).
Diese linienbedingten Unterschiede konnten auch in dieser Studie beobachtet
werden. Humoral systemische Immunantworten fielen in dieser Studie bei SPF-
Hühnern vom Legetyp höher aus als bei kommerziellen Broilern. Die lokal zellulären
Immunantworten fielen in diesem Versuch auch bei SPF-Hühnern höher aus, außer
bei Harderschen Drüsen, bei denen die gezählten Zellzahlen der Broiler am elften
Versuchstag höher waren als bei SPF-Hühnern (Abb.7).
Die APMV-1-Antikörperfreiheit bei SPF-Hühnern spielt ebenfalls in der Ausbildung
der Immunität eine große Rolle. Die ND-Lebenvakzine wird hierbei nicht von
maternalen Antikörpern gehemmt, was zu einer ausgeprägteren Immunantwort führt,

103
als bei Broilern. Auch zeigte eine Studie mit dem Hitchner B1-Stamm bei SPF-
Hühnern einen besseren Schutz vor einer Belastungsinfektion als bei Broilern
(MORGAN et al. 1993). Bei kommerziellen Broilern interferieren maternale Antikörper
mit den Impfstoffen und verhindern somit die Ausbildung einer vollen Immunität. Die
Immunantworten verliefen aber in unserer Studie tendenziell ähnlich im Vergleich zu
SPF-Hühnern.
6.7 Weiterführende Untersuchungen
Ob eine lokale rHVT-ND Replikation in Verbindung mit erhöhten
Immunzellpopulationen steht, könnten immunhistochemische Untersuchungen nach
rHVT-ND Antigenen in der Lunge und weiteren Organen klären. Ein Nachweis von
rHVT-ND in der Harderschen Drüse und dem CALT des Augenlids könnten
beispielweise klären, inwieweit rHVT-ND in diese lymphatischen Gewebe vordringt.
Auch könnte die Konstruktion eines neuen rHVT-ND Vektors mit mehreren F-Genen
eine Verbesserung des Schutzes vor einer Belastungsinfektion erwirken, wie es eine
Studie mit einem rekombinanten HVT gegen die Infektiöse Bursitis des Huhns zeigte,
wo sich die Menge des exprimierten Antigens weitaus mehr auf die Immunität
auswirkte als die Replikationsrate des Vektors (TSUKAMOTO et al. 2002).
Impfstoffe, welche sero- und genotypisch an den Feldstamm angepasst sind,
könnten die Virusausscheidung effizienter verringern als nicht-homologe Impfstoffe
(SUAREZ et al. 2006; VAN BOVEN et al. 2008). Der APMV-1 Stamm LaSota,
welcher hier als Challengevirus fungierte, ist, wie auch der APMV-1 Stamm Clone
30, vom Genotyp II. Das F-Protein, welches hier in den Vektor integriert wurde,
wurde ebenfalls vom APMV-1 Stamm Clone 30 kloniert. Die Vakzinen und das
Belastungsvirus stimmten in unserem Versuch geno- sowie serotypisch überein.
Weiterführende Untersuchungen mit einem genotypisch unterschiedlichen
Belastungsvirus könnten Aufschluss über die Wirksamkeit von rHVT-ND im Feld mit
verschieden Virustypen geben. Untersuchungen mit einem velogenen Virusstamm
könnten weitere Erkenntnisse über die klinische Protektion und Virusausscheidung
geben.

104
6.8 Fazit
In dieser Studie wurde erstmals der Einfluss eines rekombinanten Putenherpesvirus,
welches das F-Protein des APMV-1 exprimiert, auf die zell-vermittelte lokale
Immunität nachgewiesen. Hierbei wurde eine Einzelapplikation und eine Kombination
mit einer Lebendvakzine untersucht.
Wir konnten zeigen, dass es bei einer rHVT-ND Immunisierung zu einer lokalen
respiratorischen Teilimmunität kommt. Die mit APMV-1 Stamm LaSota belasteten
Tiere schieden das Belastungsvirus nach rHVT Impfung zwar aus, jedoch wurde es
bei SPF-Tieren signifikant reduziert auf naive Empfängertiere übertragen. Dies war
bei Broilern nicht der Fall. Lokale Immunzellpopulationen zeigten sich nach rHVT-
ND-Impfung im Vergleich zur Kontrollgruppe leicht erhöht. rHVT-ND induziert einen
durch HAH und ELISA messbaren Antikörper-Titer. Bei einer Kombination von rHVT-
ND mit einer Lebendvakzine zeigten sich stärkere Immunantworten als bei
Applikation der einzelnen Vakzinen allein. Die Antikörpertiter waren in der dualvakzinierten
Gruppe immer höher als in den restlichen Gruppen. Eine Kombination
beider Vakzinen bietet somit neben der Erhöhung und Verlängerung der
Immunantwort weitere Vorteile, wie die in-ovo Applikation, eine geringere Interferenz
mit maternalen Antikörpern und längere Expression des Antigens, sowie einem
additiven, wenn nicht sogar synergistischen Effekt aus Priming der Lebendvakzine
und parallel stattfindend anhaltender Antigenexprimierung des latenten rHVT-ND.
Die Kombination von rHVT-ND mit einer Lebendvakzine bietet eine
zukunftsweisende Alternative zur ansonsten üblichen Kombination eines
Lebendimpfstoffes und einer Inaktivatvakzine, da rHVT-ND eine lokale Teilimmunität
induziert und einen Boosterfeffekt durch eine lange Latenzzeit mit langer
Antigenexprimierung herbeiführt. Auch ist durch die in-ovo Methode und
Verabreichung des Lebendimpfstoffs über das Trinkwasser eine Massenapplikation
dieser Kombination möglich (RAUW et al. 2010).

105
7 Zusammenfassung
Jens-Christian Cors (2013):
Untersuchungen zu lokalen Immunreaktionen nach Impfung gegen das
Newcastle Disease Virus mit einem rekombinanten Putenherpesvirus und einer
herkömmlichen Lebendvakzine
Die Newcastle Disease (ND) wird durch das aviäre Paramyxovirus Serotyp 1 (APMV-
1) verursacht. Bei Huhn und Pute kann die Erkrankung in Abhängigkeit von der
Virulenz des APMV-1 Stammes vom perakuten Tod bis zur subklinischen
Erkrankung variieren. Trotz umfangreicher Impfprogramme und Schutzmaßnahmen
werden durch die Erkrankung weltweit erhebliche wirtschaftliche Verluste verursacht.
Herkömmliche Impfprogramme induzieren lokale und systemische Immunität, jedoch
gehen sie teilweise mit Impfreaktionen einher und verhindern nicht in allen Fällen
eine Erkrankung und Virussauscheidung.
Rekombinante Vakzinen auf der Basis eines Putenherpesvirus (HVT), welche das F-
Protein des APMV-1 exprimieren (rHVT-ND), stellen eine interessante Alternative zu
herkömmlichen Impfstoffen dar. Durch rHVT-ND kann eine Immunität sowohl gegen
die Newcastle Disease als auch die Marek’s Disease erzeugt werden.
In dieser Arbeit wurde die Wirkung einer rHVT-ND-Vakzine auf systemische sowie
lokale Immunreaktionen des oberen Respirationstraktes, der Lunge und der
Zäkaltonsillen untersucht. Die Effekte wurden bei spezifisch pathogen-freien Hühnern
(Experiment 1) und kommerziellen Broilern (Experiment 2) untersucht und mit der
Wirkung einer herkömmlichen Lebendvakzine verglichen. rHVT-ND wurde zusätzlich
mit dieser Lebendvakzine kombiniert, um eine mögliche Steigerung der Immunität zu
untersuchen.
Folgende Parameter wurden zwischen ungeimpften, rHVT-ND-, ND-Lebend- und
rHVT-ND+ND-Lebend-geimpften Gruppen verglichen: 1) Die Anzahl zirkulierender
sowie lokaler B-, T-Zell- und Makrophagenpopulationen in Harderscher Drüse, in
Konjunktiva-assoziiertem lymphatischem Gewebe, in Lunge und in Zäkaltonsille. 2)

106
Die systemische und lokale ND-Antikörperproduktion. 3) Die tracheale und kloakale
Virusauscheidung nach einer Belastungsinfektion.
In dieser Studie waren nach einer rHVT-ND Impfung lokale Immunzellpopulationen
im Vergleich zur Kontrollgruppe leicht erhöht. Bei Broilern wurde eine signifikante
Erhöhung von CD4+ Zellen in Lungen fünf Tage nach rHVT-ND Impfung beobachtet
(p

107
8 Summary
Jens-Christian Cors (2013):
Investigations of local immunity following vaccination with a recombinant
Herpesvirus of turkeys against Newcastle Disease (rHVT-ND) and a commercial
Newcastle Disease-live vaccine
Newcastle Disease (ND), caused by the Avian Paramyxovirus Serotype 1 (APMV-1),
is responsible for severe damages and economical losses in the poultry industry
worldwide. The development of clinical disease is dependent on the virulence of the
involved AMPV-1 strain, the host species and the immune status of the host.
Symptoms may vary from subclinical infection to peracute death with high mortality in
a flock. Conventional vaccination regimes stimulate local and systemic immunity and
may provide clinical protection in most cases, but viral shedding and spreading of
disease still may occur. Therefore, optimisation of existing vaccination strategies is
required. New generation vaccines like a recombinant herpesvirus of turkeys
expressing the F-protein of APMV-1 are interesting alternatives to conventional
vaccines. If and to what extent they may induce local immunity, and reduce or
prevent viral shedding in the upper respiratory tract is not clear.
In this study, we investigated the effect of rHVT-ND on systemic as well as local
immunity in the upper respiratory tract, the lung and cecal tonsils.
The following parameters were compared between non-vaccinated, rHVT-ND-, live
ND- and rHVT-ND + live ND-vaccinated SPF-chickens (experiment 1) and
commercial broilers (experiment 2): 1) Circulating as well as local B-, T-cell and
macrophage populations in the Harderian gland, in the conjunctiva-associated
lymphoid tissue, in lung and cecal tonsil. 2) Local and systemic antibody production.
3) Tracheal and cloacal virus shedding after a challenge infection.
The study has shown that local immune cell populations were raised slightly in rHVT-
ND groups compared to the control group. CD4+ cells were raised significantly in the
lung on day five post rHVT-ND vaccination in broilers (p

108
rHVT-vaccination alone induced partial local respiratory immunity. After challenge
with APMV-1 strain LaSota SPF-chickens from the rHVT-ND vaccinated group shed
virus comparable to the control group, but spreading to naive sentinels was reduced
significantly (p

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Plos One 6, e25000

133
10 Anhang
10.1 SPF-Liste
Die folgenden Tests wurden gemäß den Vorgaben der "European Pharmacopoiea"
durchgeführt.
Erreger Testmethode Ergebnis
Aviäre Adenoviren, Gruppe 1 AGP N
Aviäre Adenoviren, Gruppe 3, EDS HAH N
Aviäre Leukoseviren/RSV ELISA N
Aviäre Orthoreoviren ELISA N
Aviäres Metapneumovirus (TRT) ELISA N
Aviäres Nephritis Virus ELISA N
Hühnerpockenvirus KU/PM N
Inluenzavirus Typ A AGP N
Marek’s Disease Virus AGP N
Mycobacterium avium KU/PM N
Mycoplasma gallisepticum AGG N
Mycoplasma synoviae AGG N
Newcastle Disease Virus HAH N
Reticuloendotheliose-Virus ELISA N
Salmonella pullorum AGG N
Salmonella spp. BU N
Virus der aviären Enzephalomyelitits ELISA N
Virus der Infektiösen Bronchitits ELISA N
Virus der Infektiösen Bursitis Serotyp 1 ELISA N
Virus der Infektiösen Bursitis Serotyp 2 VN N
Virus der Infektiösen Laryngotracheitis ELISA N
Virus der Infektösen Kükenanämie (CAV) ELISA N
N = Negativ
NT = nicht getestet
HAH = Hämagglutinationshemmungstest
AGP = Agar-Gel-Präzipitationstest
AGG = Agglutinations-Test
BU = bakteriologische Untersuchung
P = Positiv
KU = klinische Untersuchung
PM = post mortem
FAT = Fluoreszenz Antikörper Test
VN = Virus-Neutralisationstest
ELISA = Enzyme Linked Immunosorbent Assay

134
10.2 Lösungen, Puffer, Medien
Phosphat-Puffer (PBS) 0,01 M
NaCL 8 g 137 mM
KCl 0,2 g 2,7 mM
Na 2 HPO 4 2,17 g 10 mM (0,01 M)
KH 2 PO 4 0,2 g 2 mM
Aqua bidest.
ad 1000 ml
pH 7,4
gepuffertes Formalin
Na 2 HPO 4 6,5 g
Na 2 HPO 4 *H 2 O 4,0 g
Aqua bidest. Ad 900 ml
Formaldehyd 37% (entsäuert) 100 ml
pH 7,0
Eosin-Stammlösung
Eosin 1 g
Aqua bidest. 100 ml
Eosin-Gebrauchslösung
Eosin-Stammlösung 80 ml
Aqua bidest. 160 ml
Thymolkristalle
einige kleine Kristalle

135
Hämalaun-Stammlösung
Lösung A
Hämatoxylin-Kristalle 1 g
Aqua bidest. 400 ml
Lösung B
KAl(SO 4 )2*12 H 2 O 59 g
NaJO 3 0,2 g
Aqua bidest. 600 ml
Hämalaun-Gebrauchslösung
Lösung C
Chloralhydrat-Kristalle 50 g
Zirtonensäure-Kristalle 1 g
Aqua bidest. 100 ml
200 ml Hämalaun Stammlösung (A+B) mit 10 ml Lösung C vermischen und vor
Gebrauch mindestens 24 Stunden ruhen lassen.
Leibowitz/McCoy Medium
Leibwotz/McCoy Medium (Biochrom AG, Berlin) 1:1
Antibiotikum (Penicillin (100 U/ml)/Streptomycin (100 µg / ml))
Biochrom AG, Berlin)
Fetales Bovines Serum (Biochrom AG, Berlin) 1%
M6B8 Medium
CaCl 2 (wasserfrei)
CaCl 2 *2H 2 O
Fe(NO 3 ) 3 *9H2O
MgSO 4 (wasserfrei)
KCl

136
NaCl
NaHCO 3
NaH 2 PO 4 (wasserfrei)
NaH 2 PO 4 *H 2 O
L-Alanin
L-Arginin HCl
L-Asparagin H 2 O
L- Asparaginsäure
L-Cystein HCI*H 2 O
L-Cystin 2HCl
L-Glutaminsäure
L-Glutamin
Glycin
L-Histidin HCI*H 2 O
L-Isoleucin
L-Leucin
L-Lysin HCl
L-Methionin
L-Phenylalanin
L-Prolin
L-Serin
L-Threonin
L-Tryptophan
L-Tryosin 2Na*2H 2 O
L-Valin
D-Ca Pantothenat
Cholinchlorid
Folsäure
Myo-Inositol
Nicotinamid
Pyridoxal HCl
Riboflavin
Thiamin HCl
D-Glukose

137
Phenol Rot
Natriumpyruvat
TPB 8.3% (w/v) TC
Tryptose 10% (w/v) TC
Lactalbumin Hydrolysat 12% (w/v)
TAE-Puffer
(für Gelelektrophorese)
Stocklösung 50x:
Tris-Base
Eisessig
EDTA (0,5 mM pH 8,0)
242 g
57,1 ml
100 ml
Herstellen der Gebrauchslösung: 10 ml TAE 50x in 490 ml Aqua bidest.
TAE Gebrauchslösung = 40mM Tris-Acetat, 1mM EDTA
Agargelelektrophorese 2% mit Biozym LE Agarose

138
11 Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die mich bei der Durchführung
dieser Arbeit hilfreich unterstützt haben.
Ich möchte mich recht herzlich bei meiner Betreuerin Prof. Dr. Silke Rautenschlein
für die sehr gute Betreuung bedanken.
Großer Dank gilt auch der Firma MSD Animal Health, speziell Aris Malo, Rik
Koopman, Sigrid Spies, Gerdy ten Dam, Sandra Vogels, Maaike Bekkers, Ennie
Willems und Ans Peters.
Ebenfalls möchte ich mich bei Christine Haase für die Einarbeitung und Hilfe bei
meinem Projekt bedanken.
Vielen Dank an Sonja Bernhard, Sabrina Techel und Katja Stolpe, welche mich bei
der Tierhaltung unterstützt haben.
Dank gilt auch Herrn Dr. Martin Ryll und Hans Bertram, welche bei technischen
Arbeiten unterstützten.
Vielen Dank an meine Kollegen Henning Petersen, Colin Pielsticker, Lydia Teske,
Sandra Hartmann, Annette Kaiser, Tamiru Alkie Negash, Diana Petzoldt, Samuel
Fischer, Arne Jung, Andreas Stamm, Martina Hesse, Hicham Sid und Zifeng Han
welche mich in meinem Projekt mit tatkräftiger Hilfe und fachlichem Rat unterstützt
haben.
Vielen Dank an meine Eltern und meinen Bruder, die mich während meiner
Dissertationszeit unterstützt haben.