Molekulare Methoden in der mikrobiologischen ... - BIOspektrum

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746 WISSENSCHAFT · SPECIAL: MOLEKULARE DIAGNOSTIK ˚ Abb. 1: Real-Time-PCR einer logarithmischen Verdünnungsreihe einer Probe. Die einzelnen Kurven stellen die jeweilige Fluoreszenzzunahme während der Real-Time-PCR und damit die spezifische DNA-Amplifikation dar. Der CT-Wert ist ein Maß für die Menge der DNA in der Ausgangsprobe und lässt die Bestimmung der Erregermenge zu. Niedrige CT-Werte repräsentieren höhere DNA-Konzentrationen bzw. Erregermengen. sen. Durch die zyklenlose Amplifikation und direkte Detektion sind die Analysezeiten sehr kurz. Allerdings ist das Verfahren relativ komplex und durch den primären Ein - satz von RNA hauptsächlich zum Nachweis von RNA-Viren oder mRNA-Transkripten geeignet. Die Instabilität von RNA in der Probe und die Komplexität der relativ teuren Methode haben eine weitere Verbreitung behindert. Die Ligasekettenreaktion (ligase chain reaction, LCR) basiert auf vier komplementären Nukleotiden als Primer. Die Sequenzen befinden sich genau nebeneinander auf der Ziel- DNA, sodass im Falle der Bindung jeweils zwei der Primer miteinander kovalent verbunden werden. Die anderen zwei Primer sind dazu komplementär und werden im nächsten Zyklus verbunden, sobald sie nebeneinander an die in vorheriger Reaktion verbundenen Fragmente binden. Da keine Amplifikation erfolgt, sind die Zykluszeiten sehr kurz. Ein Problem stellt die Detektion des kurzen Amplifikats dar. Es werden daher markierte Oligonukleotide verwendet, deren Ligationsprodukte in ELISA-artigen Systemen detektiert werden können. Hybridisierungen basieren wie PCR- Verfahren auf spezifischer komplementärer Bindung zwischen Nukleotidsonden und Nukleinsäure-Zielstrukturen. Die Detektion erfolgt aber ohne enzymatische Nukleinsäure-Amplifikation. Die Mikroarray-Technik basiert auf immobilisierten spezifischen Oligonukleotiden, die auf einer Festkörperoberfläche fixiert sind. Die DNA des Probenmaterials wird zunächst extrahiert, dann amplifiziert und dabei markiert. Die Bindung an die immobilisierten Sequenzen auf dem Array erfolgt unter möglichst stringenten Bedingungen und ermöglicht so maximale Spezifität. Nach der Hybridisierung werden automatisiert die Positionen auf dem Array detektiert, an die die markierten Amplifikate gebunden haben. Aus der Kombination der detektierten DNA-Fragmente können Rückschlüsse auf die Art des Erregers oder dessen Eigenschaften gezogen werden. Der Hauptvorteil der Mikroarray-Technik ist, dass eine große Menge spezifischer Nachweisreaktionen mit überschaubarem Aufwand parallel durchgeführt werden kann. Die Kosten für Material und Geräte sind jedoch relativ hoch. Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) ist eine Technik, die ihre Spezifität ebenfalls aus der komplementären Basenpaarung der Sonde mit dem Erreger erreicht. Es kann dabei sowohl DNA als auch RNA nachgewiesen werden [9]. Voraussetzung für die Hybridisierung ist die Fixierung und Permeabilisierung der Erreger. Die Untersuchungsprobe wird mit fluoreszenzmarkierten Sonden inkubiert und fluoreszenzmikroskopisch ausgewertet. Gemischte Proben und Direktmaterial können analysiert werden, da sich die einzelnen Erreger räumlich trennen lassen und jeweils als positiv oder negativ dargestellt werden können. Um eine ausreichende Signalstärke für mikroskopische Analysen zu erreichen, wird meist eine Zielstruktur in der Zelle gewählt, die mehrfach vorhanden ist, wie ribosomale RNA (rRNA). Da die Erreger fixiert werden, ist eine Lebend/Tot-Unterscheidung kaum möglich. Ausgebildetes Personal kann Proben binnen einer halben Stunde ohne großen Materialaufwand vorbereiten und analysieren. Die Technik der reversen Line-Blot-Hybridisierung ist dem Mikroarray ähnlich. DNA oder RNA wird aus der Probe isoliert, mit einer PCR-Reaktion amplifiziert und dabei markiert. Danach wird die entstandene Mischung aus DNA-Molekülen chemisch in einzelsträngige DNA denaturiert und mit immobilisierter DNA auf der Membran des Blotstreifens hybridisiert. Spezifische Bindungen werden enzymatisch detektiert und bewirken einen Farbumschlag. So kann einfach eine Vielzahl an Gensequenzen in einer Probe spezifisch nachgewiesen werden. Es ist neben der Speziesidentifikation auch der Nachweis von Resistenzgenen möglich. Der Arbeitsaufwand ist bei hohen Probenzahlen vergleichsweise hoch, so eignet sich die Methode vor allem dort, wo bei wenigen Proben verschiedene DNA-Zielstrukturen detektiert werden sollen (z. B. Tuberkulose-Diagnostik). Die MALDI-TOF(matrix-assisted laser de - sorption/ionization-time of flight)-Massenspektrometrie hat sich in den letzten Jahren zur bakteriellen Identifikation durchgesetzt und andere Verfahren weitgehend verdrängt. Sie basiert auf der Analyse ribosomaler Proteinspektren von Reinkulturen und ist von der DNA der Erreger unabhängig [10]. Neue MS-basierte diagnostische Systeme bauen auf eine Kombination von PCR und massenspektrometrischer Analyse der DNA- Amplifikate mittels Elektronenspray-Ionisations-time of flight-Massenspektrometrie (ESI- TOF-MS). Damit ist eine Bestimmung der Sequenz der Amplifikate in Grenzen möglich. Die Analysen werden im Mikrotiterplattenformat durchgeführt und beinhalten verschiedene PCR-Reaktionen. Ein computergestütztes Auswertesystem kann aus den Kombinationen der Messungen neben der Keim - identifikation auch Stammtypisierungen und BIOspektrum | 07.13 | 19. Jahrgang
747 Toxin- sowie Resistenzgen-Nachweise durchführen. Innerhalb von acht Stunden ist eine relativ breite Analyse möglich. Das bisherige System ist extrem teuer und daher für die meisten diagnostischen Labore ungeeignet. Next Generation Sequencing bezeichnet hochparallele DNA-Sequenzierungen. Es sind verschiedene Systeme kommerziell verfügbar, die auf unterschiedlichen Techniken beruhen. Allen Systemen ist gemein, dass Genstücke aus Direktmaterialien mit oder ohne Amplifikationsschritt sequenziert und mittels Computeranalyse und Datenbankvergleich bestimmten Organismen zugeordnet werden. Es ist nicht nur die Detektion von Spezies, sondern auch von Resistenz- oder Virulenzgenen möglich. Nicht immer ist aus einem Keimgemisch klar, welche Gensequenzen (etwa von Plasmiden) zu welchem Erreger gehören. Auch eine Unterscheidung zwischen lebenden und toten Erregern oder reiner DNA ist nicht möglich. Die Auswertung der Daten ist rechenintensiv. Für manche Fragestellungen, vor allem bei nicht anzüchtbaren oder unbekannten Erregern kann diese aufwendige Methode interessant sein. Neue schnellere und günstigere Sequenzierungstechniken machen die Massivsequenzierung zu einem interessanten Ansatz, der in den kommenden Jahren verstärkt experimentell eingesetzt werden wird und in Zukunft eine interessante diagnostische Alternative bieten könnte [11]. Zusammenfassung und Ausblick Die molekulare Diagnostik beruht derzeit hauptsächlich auf der Analyse von Erbsubstanz oder Proteinen der Erreger. Der Hauptunterschied zu klassischen kulturbasierten Verfahren ist meistens die höhere Geschwindigkeit. Manche Erreger sind gar nicht anzüchtbar, sodass ihr direkter Nachweis nur über molekulare Verfahren gelingt. Trotz der Vielfalt moderner molekularer Verfahren ist die kulturelle Anzucht noch notwendig. Sie hat meist nicht nur eine höhere Sensitivität, sondern erlaubt auch die einfache Trennung von Mischkulturen sowie eine Unterscheidung zwischen toten und lebenden (anzüchtbaren) Organismen und dies zu meist deutlich geringeren Kosten. Für eine zuverlässige Resistenztestung ist außerdem der Genotyp aufgrund der Vielfalt an möglichen Resistenzmechanismen der phänotypischen Resistenztestung unterlegen. Die stete Weiterentwicklung molekularer Testsysteme zielt darauf, schnell hochspezifische Resultate zu liefern und die Tests möglichst einfach durchführbar zu machen (Abb. 2). Wenn die Kosten erster Tag zweiter Tag dritter Tag Kulturwachstum Zeit zur Diagnosestellung DNA/RNA- Extraktion Zwischenschritte ˚ Abb. 2: Molekulare Verfahren der mikrobiologischen Diagnostik und deren Zeitaufwand. dabei für das Labor reduziert werden können, so werden sich in Zukunft molekulare Verfahren mehr und mehr gegenüber der klassischen, kulturbasierten mikrobiologischen Diagnostik durchsetzen. ó Literatur [1] Tenover FC (2011) Developing molecular amplification methods for rapid diagnosis of respiratory tract infections caused by bacterial pathogens. Clin Infect Dis 52(Suppl 4):S338–345 [2] Cathomas G (2009) Molecular diagnostic in infectious disease pathology: an update. Ann Pathol 29:S19–21 [3] Krishna NK, Cunnion KM (2012) Role of molecular diagnostics in the management of infectious disease emergencies. Med Clin North Am 96:1067–1078 [4] Balasingham SV, Davidsen T, Szpinda I et al. (2009) Molecular diagnostics in tuberculosis: basis and implications for therapy. Mol Diagn Ther 13:137–151 [5] Bille J (2010) New nonculture-based methods for the diagnosis of invasive candidiasis. Curr Opin Crit Care 16:460–464 [6] Maurin M (2012) Real-time PCR as a diagnostic tool for bacterial diseases. Expert Rev Mol Diagn 12:731–754 [7] Preuner S, Lion T (2009) Towards molecular diagnostics of invasive fungal infections. Expert Rev Mol Diagn 9:397–401 [8] Nolte FS (2008) Molecular diagnostics for detection of bacterial and viral pathogens in community-acquired pneumonia. Clin Infect Dis 47(Suppl 3):S123–126 AUTOREN Probennahme Kulturwachstum Sören Schubert Jahrgang 1966. 1985–1992 Medizinstudium an der Universität Hamburg. 1993–1995 Dissertation an der Universität Würzburg. Seit 1998 Arbeitsgruppenleiter am Max von Pettenkofer-Institut für Hygiene und Medizinische Mikrobiologie der LMU München. 2006 Habilitation. Seit 2006 leitender Oberarzt der Diagnostik am Max von Pettenkofer-Institut. FISH direkt MALDI-TOF (Urin) automatisierte PCR-Verfahren PCR-Verfahren, LCR, NASBA RT-PCR-Verfahren Massivsequenzierung ESI-TOF universelle PCR/Sequenzierung Line Probe Assay Mikroarray MALDI-TOF FISH von Kultur PCR von Kultur (RT oder konventionell) andere molekulare Verfahren aus Kultur [9] Montone KT, Guarner J (2013) In situ hybridization for rRNA sequences in anatomic pathology specimens, applications for fungal pathogen detection: a review. Adv Anat Pathol 20:168–174 [10] Wieser A, Schneider L, Jung J et al. (2012) MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond. Appl Microbiol Biotechnol 93:965–974 [11] Dunne WM Jr, Westblade LF, Ford B (2012) Next-generation and whole-genome sequencing in the diagnostic clinical microbiology laboratory. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 31:1719–1726 Korrespondenzadresse: Prof. Dr. med. Sören Schubert Max von Pettenkofer-Institut Ludwig-Maximilians-Universität München Marchioninistraße 17 D-81377 München Tel.: 089-2180-78202 Fax: 089-2180-78294 schubert@med.uni-muenchen.de Andreas Wieser Jahrgang 1983. 2002–2009 Medizinstudium an der LMU München. 2005–2009 Dissertation am Max von Pettenkofer-Institut für Hygiene und Medizinische Mikrobiologie der LMU München, dort seit 2009 Postdoc in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Schubert. BIOspektrum | 07.13 | 19. Jahrgang
Seite 1 und 2: 743 Nachweis von Infektionserregern

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