Molekulare Methoden in der mikrobiologischen ... - BIOspektrum

744 WISSENSCHAFT · SPECIAL: MOLEKULARE DIAGNOSTIK
Tab. 1: Übersicht über molekulare Verfahren in der mikrobiologischen Diagnostik.
Material PCR NASBA LCR
Endpunkt-PCR Real-Time-PCR Universelle PCR Vollautomatische
PCR-Systeme
Direktmaterial +++ +++ nicht möglich +++ ++ +?
(primär unsteril)
(Abstriche,
Sputum etc.)
Direktmaterial +++ +++ ++ +++ ++ ++
(primär steril)
Kultur (+) z. B. Toxin- +++ +++ k. s. ? ?
nachweis
Geschwindigkeit ++ ++ (+) +++ ++ ++
Kosten + ++ +++ +++ +++
Sensitivität +++ +++ ++ ++ +++
Kommentar viele publizierte Pro- viele käufliche und gute Sequenzierungs- limitierte Anwendun- sensitives, aber teures limitierte Anwenduntokolle,
günstige publizierte Protokolle, einrichtung benötigt, gen, teuer und viel System, arbeitet mit gen, gut für kleine
hands-on-Reagenzien, multiplexing Dauer: 2 Tage Verbrauchsmaterial, RNA Fragmente aus Direktviel
Zeit einfach und robust, material ohne zu viel
wenig hands-on-Zeit
Kontamination
Material Hybridisierungen Massenspektrometrie Next
Mikroarray FISH Line-Blot MALDI-TOF-MS ESI-TOF-MS Generation
Sequencing
Direktmaterial + ++ ++ nicht möglich ++ ++
(primär unsteril)
(Abstriche,
Sputum etc.)
Direktmaterial ++ +++ ++ + +++ k. s.
(primär steril)
Kultur +++ + (z. B. Blut- +++ +++ k. s. k. s.
kultur)
Geschwindigkeit ++ +++ + +* ++ +
Kosten +++ ++ + + +++ ++
Sensitivität + + ++ + ++ ++
Kommentar limitierte Arrays erhäl- schnell und sensitiv, sehr gut, ab Kulturer- aus Direktmaterial und
tlich, breite Aussage, wenig Geräte benötigt, gebnis, kosteneffektiv, von Kultur, bislang
Zuordnung aus Direkt- hands-on-Zeit und da wenig Verbrauchs- sehr teuer
material evtl. komplex geübtes Personal material, nicht für
benötigt
verunreinigte Proben
* = Kultur erforderlich, daher insgesamt zeitaufwendig
k. s. = keine Standardanwendung, unüblicher Einsatz
NASBA = nucleic acid sequence-based amplification; LCR = ligase chain reaction; MALDI-TOF-MS = matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight-Massenspektrometrie;
ESI-TOF-MS = electrospray ionization-time of flight-Massenspektrometrie; FISH = Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung
ziert werden können. Dies erlaubt eine ge -
naue Spezies identifikation, auch wenn keine
spezifische PCR für den Nachweis des Erregers
existiert. Nachteile dieser Methode sind,
dass sie vergleichsweise komplex ist und Verunreinigungen
mit genetischem Material von
Bakterien sowie suboptimale Bindung der Primer
an die Zielsequenzen die Testergebnisse
negativ beeinflussen können. Auch sind universelle
PCR-Reaktionen deutlich weniger
sensitiv als vergleichbare spezifische PCRs.
Sinnvoll ist der Einsatz zudem nur, wenn die
Probe lediglich einen Erreger enthält, also
nicht durch Standortflora oder andere mikrobielle
DNA verunreinigt ist, da Mischsequenzen
die Auswertung unmöglich machen
können. Durch den Sequenzierschritt ist die
Dauer bis zum Ergebnis mit ein bis zwei
Tagen auch länger als bei klassischen PCR-
Verfahren.
Es werden zunehmend vollautomatische
Systeme in der molekularbiologischen Diagnostik
eingesetzt, bei denen nach Eingabe
des Probenmaterials die Nukleinsäure-Extraktion,
Amplifikation, Detektion und Auswertung
der Proben sowie aller benötigten Kontrollen
automatisch erfolgt [8]. Diese sehr
schnellen und einfach anzuwendenden Systeme
sind derzeit noch relativ kostenintensiv
hinsichtlich Geräteanschaffung und Verbrauchsmaterialien.
Nucleic acid sequence-based amplification
(NASBA) ist ein Real-Time-Verfahren zur
Amplifikation von Nukleinsäuren. Anders als
klassische PCR-Systeme beruht es jedoch auf
dem direkten Einsatz von RNA in einer isothermen
Reaktion. Die Amplifikation erfolgt
mithilfe der T7-Polymerase und wird mit fluoreszenzmarkierten
Sonden optisch gemes-
BIOspektrum | 07.13 | 19. Jahrgang