Molekulare Methoden in der mikrobiologischen ... - BIOspektrum

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Nachweis von Infektionserregern
Molekulare Methoden in der
mikrobiologischen Diagnostik
SÖREN SCHUBERT, ANDREAS WIESER
MAX VON PETTENKOFER-INSTITUT FÜR HYGIENE UND MEDIZINISCHE
MIKROBIOLOGIE, LMU MÜNCHEN
Today molecular methods are indispensable in diagnostic microbiology.
Several technologies aim to detect pathogens, virulence factor or resistance
genes by identifying specific DNA/RNA sequences. Advantages
compared to culture based methods are the comparatively short time to
results, detection of non-culturable or slow growing pathogens, and
specific detection of virulence marker genes. Drawbacks include falsenegative
results due to variation of target structures and the relatively
high costs.
DOI: 10.1007/s12268-013-0386-x
© Springer-Verlag 2013
ó Zentrales Ziel der mikrobiologischen Diagnostik
ist es, in Patientenproben Infektionserreger
nachzuweisen und Aussagen zu deren
Resistenz gegen antimikrobielle Substanzen
(Antibiotika, Antimykotika) zu machen, um
eine gezielte, effektive Therapie zu ermöglichen.
Von großer Bedeutung ist dabei die
Schnelligkeit. Je früher Informationen über
den Erreger vorliegen, desto eher kann von
einer anfänglich kalkulierten und auf Erfahrungswerten
basierenden Therapie auf eine
gezielte umgestellt werden. Die klassische
mikrobiologische Diagnostik, die auf dem kulturellen
Nachweis von Infektionserregern
beruht, kann dieser Forderung nur bedingt
entsprechen. Die Kultur selbst von schnell
wachsenden Bakterien nimmt acht bis zwölf
Stunden in Anspruch, andere Infektionserreger
sind schwierig oder gar nicht anzüchtbar.
Auch ist in einigen Fällen der Nachweis
spezifischer Virulenzeigenschaften der Erreger
von Interesse. Mit molekularen Methoden
gelingt es, direkt aus dem Probenmaterial
innerhalb weniger Stunden Infektionserreger
zu identifizieren oder spezifische Virulenz-
bzw. Resistenzdeterminanten nachzuweisen
[1–5]. Im Folgenden werden deshalb
die heute zur Verfügung stehenden molekularen
Methoden in der mikrobiologischen Diagnostik
kurz vorgestellt (Tab. 1).
Molekulare Verfahren in der
mikrobiologischen Diagnostik
Der erste Schritt fast aller molekularbiologischen
Diagnostikverfahren ist die Aufreinigung
von Nukleinsäuren aus dem Probenmaterial,
auf welche der spezifische Erregernachweis
folgt.
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist
eine Methode zum spezifischen Nachweis von
Nukleinsäuren. PCR-basierte Verfahren nutzen
die spezifische komplementäre Bindung
kurzer gegenläufiger Oligonukleotide (Primer)
an die nachzuweisende DNA. Bei dieser
Endpunkt-PCR müssen die DNA-Produkte
nach der Amplifikation mittels Gelelektrophorese
dargestellt werden. Für die Diagnostik
sind nachfolgende Analysen der Produkte
zur Sicherstellung der Spezifität erforderlich,
wie Restriktionsverdau oder Hybridisierungsverfahren.
Die Endpunkt-PCR ist ein
relativ schnelles Verfahren, das aufgrund der
hohen Spezifität und Sensitivität auch aus
Direktmaterial Ergebnisse noch am gleichen
Tag liefern kann. Es besteht außerdem die
Möglichkeit, verschiedene, unterschiedlich
lange Amplifikate parallel im gleichen Ansatz
zu analysieren. Die Gelelektrophorese der
Produkte und nachfolgende Spezifitätstests
verzögern jedoch die Auswertung und begrenzen
den Einsatz in der Routinediagnostik.
Modernere PCR-Verfahren nutzen eine
direkte Amplifikationsdetektion, meist mithilfe
einer fluoreszenzmarkierten Sonde. Diese
Real-Time-PCR-Verfahren sind spezifischer
als Endpunkt-PCRs [6]. Ferner sinkt der Personalzeitaufwand
pro Analyse, da mithilfe der
Sonde die Amplifikation optisch direkt während
der Reaktion gemessen werden kann.
Das macht eine Gelelektrophorese am Ende
der Reaktion überflüssig. Die meisten Real-
Time-PCR-Verfahren basieren auf dem Einsatz
einer mit zwei Farbstoffen, einem
FRET(Förster-Resonanz-Energietransfer)-Paar,
markierten Sonde. Ein Partner unterdrückt
dabei die Fluoreszenz des anderen Farbstoffs,
solange diese räumlich nahe zusammengelagert
sind. Während der Amplifikation durch
Abbau der Sonde oder durch Auflösung einer
Stamm-Loop-Struktur der FRET wird diese
räumliche Nähe aufgehoben. Zunehmende
Fluoreszenzintensität repräsentiert daher
eine fortscheitende Amplifikation (Abb. 1).
Alternative Techniken messen nur das Entstehen
größerer Mengen doppelsträngiger
DNA mithilfe interkalierender Farbstoffe. Um
Spezifität sicherzustellen, kann eine Schmelztemperaturkurve
am Ende der Reaktion
erstellt werden. Real-Time-PCRs sind sehr
sensitiv und spezifisch und daher sehr gut
geeignet, um Direktmaterial zu untersuchen.
Die amplifizierten DNA-Fragmente und
Zykluszeiten sind recht kurz, die Auswertung
automatisierbar. Ein Ergebnis ist binnen weniger
Stunden, mit geringem Arbeitsaufwand
möglich. Diese Vorteile haben dazu geführt,
dass Real-Time-PCR-Verfahren die molekulare
Diagnostik in der Mikrobiologie dominieren.
Ein spezielles PCR-Verfahren in der mikrobiologischen
Diagnostik stellen die uni -
versellen PCRs dar, die mit Primern gegen
flankierende, konservierte Bereiche variabler
Sequenzen diese Gene amplifizieren
(16S-rDNA) [7]. Nachfolgend können die variablen
Bereiche sequenziert und mit Datenbanken
abgeglichen werden. Es ist möglich,
die Primer so zu wählen, dass praktisch alle
Bakterien oder Pilze detektiert und identifi-
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744 WISSENSCHAFT · SPECIAL: MOLEKULARE DIAGNOSTIK
Tab. 1: Übersicht über molekulare Verfahren in der mikrobiologischen Diagnostik.
Material PCR NASBA LCR
Endpunkt-PCR Real-Time-PCR Universelle PCR Vollautomatische
PCR-Systeme
Direktmaterial +++ +++ nicht möglich +++ ++ +?
(primär unsteril)
(Abstriche,
Sputum etc.)
Direktmaterial +++ +++ ++ +++ ++ ++
(primär steril)
Kultur (+) z. B. Toxin- +++ +++ k. s. ? ?
nachweis
Geschwindigkeit ++ ++ (+) +++ ++ ++
Kosten + ++ +++ +++ +++
Sensitivität +++ +++ ++ ++ +++
Kommentar viele publizierte Pro- viele käufliche und gute Sequenzierungs- limitierte Anwendun- sensitives, aber teures limitierte Anwenduntokolle,
günstige publizierte Protokolle, einrichtung benötigt, gen, teuer und viel System, arbeitet mit gen, gut für kleine
hands-on-Reagenzien, multiplexing Dauer: 2 Tage Verbrauchsmaterial, RNA Fragmente aus Direktviel
Zeit einfach und robust, material ohne zu viel
wenig hands-on-Zeit
Kontamination
Material Hybridisierungen Massenspektrometrie Next
Mikroarray FISH Line-Blot MALDI-TOF-MS ESI-TOF-MS Generation
Sequencing
Direktmaterial + ++ ++ nicht möglich ++ ++
(primär unsteril)
(Abstriche,
Sputum etc.)
Direktmaterial ++ +++ ++ + +++ k. s.
(primär steril)
Kultur +++ + (z. B. Blut- +++ +++ k. s. k. s.
kultur)
Geschwindigkeit ++ +++ + +* ++ +
Kosten +++ ++ + + +++ ++
Sensitivität + + ++ + ++ ++
Kommentar limitierte Arrays erhäl- schnell und sensitiv, sehr gut, ab Kulturer- aus Direktmaterial und
tlich, breite Aussage, wenig Geräte benötigt, gebnis, kosteneffektiv, von Kultur, bislang
Zuordnung aus Direkt- hands-on-Zeit und da wenig Verbrauchs- sehr teuer
material evtl. komplex geübtes Personal material, nicht für
benötigt
verunreinigte Proben
* = Kultur erforderlich, daher insgesamt zeitaufwendig
k. s. = keine Standardanwendung, unüblicher Einsatz
NASBA = nucleic acid sequence-based amplification; LCR = ligase chain reaction; MALDI-TOF-MS = matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight-Massenspektrometrie;
ESI-TOF-MS = electrospray ionization-time of flight-Massenspektrometrie; FISH = Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung
ziert werden können. Dies erlaubt eine ge -
naue Spezies identifikation, auch wenn keine
spezifische PCR für den Nachweis des Erregers
existiert. Nachteile dieser Methode sind,
dass sie vergleichsweise komplex ist und Verunreinigungen
mit genetischem Material von
Bakterien sowie suboptimale Bindung der Primer
an die Zielsequenzen die Testergebnisse
negativ beeinflussen können. Auch sind universelle
PCR-Reaktionen deutlich weniger
sensitiv als vergleichbare spezifische PCRs.
Sinnvoll ist der Einsatz zudem nur, wenn die
Probe lediglich einen Erreger enthält, also
nicht durch Standortflora oder andere mikrobielle
DNA verunreinigt ist, da Mischsequenzen
die Auswertung unmöglich machen
können. Durch den Sequenzierschritt ist die
Dauer bis zum Ergebnis mit ein bis zwei
Tagen auch länger als bei klassischen PCR-
Verfahren.
Es werden zunehmend vollautomatische
Systeme in der molekularbiologischen Diagnostik
eingesetzt, bei denen nach Eingabe
des Probenmaterials die Nukleinsäure-Extraktion,
Amplifikation, Detektion und Auswertung
der Proben sowie aller benötigten Kontrollen
automatisch erfolgt [8]. Diese sehr
schnellen und einfach anzuwendenden Systeme
sind derzeit noch relativ kostenintensiv
hinsichtlich Geräteanschaffung und Verbrauchsmaterialien.
Nucleic acid sequence-based amplification
(NASBA) ist ein Real-Time-Verfahren zur
Amplifikation von Nukleinsäuren. Anders als
klassische PCR-Systeme beruht es jedoch auf
dem direkten Einsatz von RNA in einer isothermen
Reaktion. Die Amplifikation erfolgt
mithilfe der T7-Polymerase und wird mit fluoreszenzmarkierten
Sonden optisch gemes-
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746 WISSENSCHAFT · SPECIAL: MOLEKULARE DIAGNOSTIK
˚ Abb. 1: Real-Time-PCR einer logarithmischen Verdünnungsreihe einer Probe. Die einzelnen Kurven
stellen die jeweilige Fluoreszenzzunahme während der Real-Time-PCR und damit die spezifische
DNA-Amplifikation dar. Der CT-Wert ist ein Maß für die Menge der DNA in der Ausgangsprobe
und lässt die Bestimmung der Erregermenge zu. Niedrige CT-Werte repräsentieren höhere
DNA-Konzentrationen bzw. Erregermengen.
sen. Durch die zyklenlose Amplifikation
und direkte Detektion sind die Analysezeiten
sehr kurz. Allerdings ist das Verfahren relativ
komplex und durch den primären Ein -
satz von RNA hauptsächlich zum Nachweis
von RNA-Viren oder mRNA-Transkripten
geeignet. Die Instabilität von RNA in der
Probe und die Komplexität der relativ teuren
Methode haben eine weitere Verbreitung
behindert.
Die Ligasekettenreaktion (ligase chain reaction,
LCR) basiert auf vier komplementären
Nukleotiden als Primer. Die Sequenzen befinden
sich genau nebeneinander auf der Ziel-
DNA, sodass im Falle der Bindung jeweils
zwei der Primer miteinander kovalent verbunden
werden. Die anderen zwei Primer
sind dazu komplementär und werden im
nächsten Zyklus verbunden, sobald sie nebeneinander
an die in vorheriger Reaktion verbundenen
Fragmente binden. Da keine Amplifikation
erfolgt, sind die Zykluszeiten sehr
kurz. Ein Problem stellt die Detektion des kurzen
Amplifikats dar. Es werden daher markierte
Oligonukleotide verwendet, deren Ligationsprodukte
in ELISA-artigen Systemen
detektiert werden können.
Hybridisierungen basieren wie PCR-
Verfahren auf spezifischer komplementärer
Bindung zwischen Nukleotidsonden und
Nukleinsäure-Zielstrukturen. Die Detektion
erfolgt aber ohne enzymatische Nukleinsäure-Amplifikation.
Die Mikroarray-Technik basiert auf immobilisierten
spezifischen Oligonukleotiden, die
auf einer Festkörperoberfläche fixiert sind.
Die DNA des Probenmaterials wird zunächst
extrahiert, dann amplifiziert und dabei markiert.
Die Bindung an die immobilisierten
Sequenzen auf dem Array erfolgt unter möglichst
stringenten Bedingungen und ermöglicht
so maximale Spezifität. Nach der Hybridisierung
werden automatisiert die Positionen
auf dem Array detektiert, an die die markierten
Amplifikate gebunden haben. Aus der
Kombination der detektierten DNA-Fragmente
können Rückschlüsse auf die Art des Erregers
oder dessen Eigenschaften gezogen werden.
Der Hauptvorteil der Mikroarray-Technik
ist, dass eine große Menge spezifischer
Nachweisreaktionen mit überschaubarem
Aufwand parallel durchgeführt werden kann.
Die Kosten für Material und Geräte sind
jedoch relativ hoch.
Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH)
ist eine Technik, die ihre Spezifität ebenfalls
aus der komplementären Basenpaarung der
Sonde mit dem Erreger erreicht. Es kann
dabei sowohl DNA als auch RNA nachgewiesen
werden [9]. Voraussetzung für die Hybridisierung
ist die Fixierung und Permeabilisierung
der Erreger. Die Untersuchungsprobe
wird mit fluoreszenzmarkierten Sonden inkubiert
und fluoreszenzmikroskopisch ausgewertet.
Gemischte Proben und Direktmaterial
können analysiert werden, da sich die einzelnen
Erreger räumlich trennen lassen und
jeweils als positiv oder negativ dargestellt
werden können. Um eine ausreichende Signalstärke
für mikroskopische Analysen zu
erreichen, wird meist eine Zielstruktur in der
Zelle gewählt, die mehrfach vorhanden ist,
wie ribosomale RNA (rRNA). Da die Erreger
fixiert werden, ist eine Lebend/Tot-Unterscheidung
kaum möglich. Ausgebildetes Personal
kann Proben binnen einer halben Stunde
ohne großen Materialaufwand vorbereiten
und analysieren.
Die Technik der reversen Line-Blot-Hybridisierung
ist dem Mikroarray ähnlich. DNA
oder RNA wird aus der Probe isoliert, mit
einer PCR-Reaktion amplifiziert und dabei
markiert. Danach wird die entstandene
Mischung aus DNA-Molekülen chemisch in
einzelsträngige DNA denaturiert und mit
immobilisierter DNA auf der Membran des
Blotstreifens hybridisiert. Spezifische Bindungen
werden enzymatisch detektiert und
bewirken einen Farbumschlag. So kann einfach
eine Vielzahl an Gensequenzen in einer
Probe spezifisch nachgewiesen werden. Es ist
neben der Speziesidentifikation auch der
Nachweis von Resistenzgenen möglich. Der
Arbeitsaufwand ist bei hohen Probenzahlen
vergleichsweise hoch, so eignet sich die
Methode vor allem dort, wo bei wenigen Proben
verschiedene DNA-Zielstrukturen detektiert
werden sollen (z. B. Tuberkulose-Diagnostik).
Die MALDI-TOF(matrix-assisted laser de -
sorption/ionization-time of flight)-Massenspektrometrie
hat sich in den letzten Jahren
zur bakteriellen Identifikation durchgesetzt
und andere Verfahren weitgehend verdrängt.
Sie basiert auf der Analyse ribosomaler Proteinspektren
von Reinkulturen und ist von
der DNA der Erreger unabhängig [10].
Neue MS-basierte diagnostische Systeme
bauen auf eine Kombination von PCR und
massenspektrometrischer Analyse der DNA-
Amplifikate mittels Elektronenspray-Ionisations-time
of flight-Massenspektrometrie (ESI-
TOF-MS). Damit ist eine Bestimmung der
Sequenz der Amplifikate in Grenzen möglich.
Die Analysen werden im Mikrotiterplattenformat
durchgeführt und beinhalten verschiedene
PCR-Reaktionen. Ein computergestütztes
Auswertesystem kann aus den Kombinationen
der Messungen neben der Keim -
identifikation auch Stammtypisierungen und
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Toxin- sowie Resistenzgen-Nachweise durchführen.
Innerhalb von acht Stunden ist eine
relativ breite Analyse möglich. Das bisherige
System ist extrem teuer und daher für die
meisten diagnostischen Labore ungeeignet.
Next Generation Sequencing bezeichnet
hochparallele DNA-Sequenzierungen. Es sind
verschiedene Systeme kommerziell verfügbar,
die auf unterschiedlichen Techniken beruhen.
Allen Systemen ist gemein, dass Genstücke
aus Direktmaterialien mit oder ohne
Amplifikationsschritt sequenziert und mittels
Computeranalyse und Datenbankvergleich
bestimmten Organismen zugeordnet werden.
Es ist nicht nur die Detektion von Spezies,
sondern auch von Resistenz- oder Virulenzgenen
möglich. Nicht immer ist aus einem
Keimgemisch klar, welche Gensequenzen
(etwa von Plasmiden) zu welchem Erreger
gehören. Auch eine Unterscheidung zwischen
lebenden und toten Erregern oder reiner DNA
ist nicht möglich. Die Auswertung der Daten
ist rechenintensiv. Für manche Fragestellungen,
vor allem bei nicht anzüchtbaren oder
unbekannten Erregern kann diese aufwendige
Methode interessant sein. Neue schnellere
und günstigere Sequenzierungstechniken
machen die Massivsequenzierung zu einem
interessanten Ansatz, der in den kommenden
Jahren verstärkt experimentell eingesetzt
werden wird und in Zukunft eine interessante
diagnostische Alternative bieten könnte [11].
Zusammenfassung und Ausblick
Die molekulare Diagnostik beruht derzeit
hauptsächlich auf der Analyse von Erbsubstanz
oder Proteinen der Erreger. Der Hauptunterschied
zu klassischen kulturbasierten
Verfahren ist meistens die höhere Geschwindigkeit.
Manche Erreger sind gar nicht
anzüchtbar, sodass ihr direkter Nachweis nur
über molekulare Verfahren gelingt. Trotz der
Vielfalt moderner molekularer Verfahren ist
die kulturelle Anzucht noch notwendig. Sie
hat meist nicht nur eine höhere Sensitivität,
sondern erlaubt auch die einfache Trennung
von Mischkulturen sowie eine Unterscheidung
zwischen toten und lebenden (anzüchtbaren)
Organismen und dies zu meist deutlich
geringeren Kosten. Für eine zuverlässige
Resistenztestung ist außerdem der Genotyp
aufgrund der Vielfalt an möglichen Resistenzmechanismen
der phänotypischen Resistenztestung
unterlegen. Die stete Weiterentwicklung
molekularer Testsysteme zielt darauf,
schnell hochspezifische Resultate zu liefern
und die Tests möglichst einfach durchführbar
zu machen (Abb. 2). Wenn die Kosten
erster Tag zweiter
Tag
dritter Tag
Kulturwachstum
Zeit zur Diagnosestellung
DNA/RNA-
Extraktion
Zwischenschritte
˚ Abb. 2: Molekulare Verfahren der mikrobiologischen Diagnostik und deren Zeitaufwand.
dabei für das Labor reduziert werden können,
so werden sich in Zukunft molekulare Verfahren
mehr und mehr gegenüber der klassischen,
kulturbasierten mikrobiologischen
Diagnostik durchsetzen.
ó
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AUTOREN
Probennahme
Kulturwachstum
Sören Schubert
Jahrgang 1966. 1985–1992
Medizinstudium an der Universität
Hamburg. 1993–1995 Dissertation
an der Universität
Würzburg. Seit 1998 Arbeitsgruppenleiter
am Max von
Pettenkofer-Institut für Hygiene
und Medizinische Mikrobiologie
der LMU München. 2006 Habilitation.
Seit 2006 leitender
Oberarzt der Diagnostik am Max
von Pettenkofer-Institut.
FISH
direkt MALDI-TOF (Urin)
automatisierte PCR-Verfahren
PCR-Verfahren, LCR, NASBA
RT-PCR-Verfahren
Massivsequenzierung
ESI-TOF
universelle PCR/Sequenzierung
Line Probe Assay
Mikroarray
MALDI-TOF
FISH von Kultur
PCR von Kultur (RT oder konventionell)
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and whole-genome sequencing in the diagnostic clinical
microbiology laboratory.
Eur J Clin Microbiol Infect Dis 31:1719–1726
Korrespondenzadresse:
Prof. Dr. med. Sören Schubert
Max von Pettenkofer-Institut
Ludwig-Maximilians-Universität München
Marchioninistraße 17
D-81377 München
Tel.: 089-2180-78202
Fax: 089-2180-78294
schubert@med.uni-muenchen.de
Andreas Wieser
Jahrgang 1983. 2002–2009
Medizinstudium an der LMU
München. 2005–2009 Dissertation
am Max von Pettenkofer-Institut
für Hygiene und
Medizinische Mikrobiologie
der LMU München, dort seit
2009 Postdoc in der Arbeitsgruppe
von Prof. Dr. Schubert.
BIOspektrum | 07.13 | 19. Jahrgang