Ute Hoffmann, BNI Hamburg - Förderverein der Biologieolympiade
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Praktikumsbericht<br />
Praktikum am Bernhard-Nocht-Institut in <strong>Hamburg</strong> in<br />
<strong>der</strong> Abteilung für Immunologie<br />
vom 16.8. bis zum 10.9.2010<br />
<strong>Ute</strong> Homann<br />
1
Inhaltsverzeichnis<br />
1 Die Rahmenbedingungen des Praktikums 4<br />
2 Hintergrundwissen 5<br />
2.1 Zu den Themen <strong>der</strong> Arbeitsgruppe . . . . . . . . . . . . . . . 5<br />
2.2 Zu meinem Projekt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8<br />
3 Materialien und Methoden 9<br />
3.1 Transfektion und Handhabung <strong>der</strong> CHOs . . . . . . . . . . . . 9<br />
3.1.1 Kultivierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9<br />
3.1.2 Überprüfung <strong>der</strong> Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . 9<br />
3.1.3 Transfektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11<br />
3.2 Proteinherstellung mittels <strong>der</strong> Bakterien . . . . . . . . . . . . 12<br />
3.2.1 Transformation <strong>der</strong> Bakterien . . . . . . . . . . . . . . 12<br />
3.2.2 Proteingewinnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13<br />
3.2.3 Proteinaufreinigung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14<br />
4 Ergebnisse 15<br />
4.1 Ergebnisse <strong>der</strong> Arbeiten mit den CHOs . . . . . . . . . . . . . 15<br />
4.1.1 Überprüfung <strong>der</strong> Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . 15<br />
4.1.2 Transfektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16<br />
4.2 Ergebnisse <strong>der</strong> Arbeiten mit den Bakterien . . . . . . . . . . . 20<br />
4.2.1 Proteingewinnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20<br />
4.2.2 Proteinaufreinigung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22<br />
4.2.3 Western-Blot zur Identizierung von TRAP-H . . . . . 24<br />
5 Diskussion 25<br />
5.1 Diskussion <strong>der</strong> Ergebnisse <strong>der</strong> Arbeiten mit den CHOs . . . . 25<br />
5.1.1 Überprüfung <strong>der</strong> Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . 25<br />
5.1.2 Transfektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25<br />
5.2 Diskussion <strong>der</strong> Ergebnisse <strong>der</strong> Arbeiten mit den Bakterien . . 26<br />
2
6 Fazit 28<br />
3
1 Die Rahmenbedingungen des Praktikums<br />
Mein Name ist <strong>Ute</strong> Homann und ich habe diesen Juni am Gymnasium<br />
Olching, in <strong>der</strong> Nähe von München, mein Abitur erworben. Ab Oktober 2010<br />
werde ich an <strong>der</strong> Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Biologie studieren.<br />
Im Rahmen <strong>der</strong> 3. Runde des Auswahlwettbewerbs zur Bestimmung des<br />
deutschen Teams für die Internationale <strong>Biologieolympiade</strong> 2010 wurden auch<br />
dieses Jahr durch den För<strong>der</strong>verein <strong>der</strong> Internationalen <strong>Biologieolympiade</strong><br />
e.V. Praktika an verschiedene Teilnehmer des Wettbewerbs vergeben. Aus<br />
diesem Grund bekam ich die Möglichkeit vom 16. August bis zum 10. September<br />
2010 ein vierwöchiges Praktikum am Bernhard-Nocht-Institut für<br />
Tropenmedizin in <strong>Hamburg</strong> zu absolvieren. Mein Praktikum fand in <strong>der</strong> Arbeitsgruppe<br />
von PD Dr. Thomas Jacobs in <strong>der</strong> Abteilung für Immunologie<br />
statt.<br />
Vor diesem Praktikum konnte ich erst wenige Erfahrungen mit wissenschaftlichem<br />
Arbeiten sammeln. Einige Einblicke in die Arbeit im Labor<br />
erhielt ich allerdings durch mehrmalige Teilnahme an Ferienprojekten von<br />
Mädchen machen Technik, einem Programm zur För<strong>der</strong>ung von Mädchen<br />
in Wissenschaft und Technik.<br />
Die Arbeitsgruppe von PD Dr. Thomas Jacobs beschäftigt sich mit <strong>der</strong><br />
Immunologie <strong>der</strong> Malaria und als zweiten Forschungsschwerpunkt mit Trypanosoma<br />
cruzi, dem Erreger <strong>der</strong> südamerikanischen Chagas-Krankheit.<br />
Da ich nur vier Wochen in <strong>der</strong> Arbeitsgruppe verbrachte und mir zudem<br />
die nötigen Grundlagen fehlten, beschäftigte ich mich während dieser<br />
Zeit damit chinese hamster ovary cells (CHOs) zu transzieren. Weiterhin<br />
stellte ich mit Hilfe von E.coli BL21 pAP lacI ein Oberächenprotein des<br />
Malariaerregers, TRAP, her. Die restliche Zeit schaute ich den verschiedenen<br />
Mitglie<strong>der</strong>n <strong>der</strong> Arbeitsgruppe über die Schulter und half zum Teil auch mit,<br />
so dass ich verschiedene, vor allem immunologische, Arbeitstechniken kennen<br />
lernen konnte.<br />
4
2 Hintergrundwissen<br />
2.1 Zu den Themen <strong>der</strong> Arbeitsgruppe<br />
Die Malaria ist in vielen tropischen und subtropischen Gebieten unserer<br />
Erde verbreitet, wobei sie vor allem in den ärmeren Regionen Afrikas ein<br />
groÿes Problem darstellt, da dort keine ausreichende Medikamentenversorgung<br />
und Infektionsprävention möglich ist. Hier sind vor allem Kin<strong>der</strong> Opfer<br />
<strong>der</strong> Krankheit. Die Verbreitung <strong>der</strong> Malaria ist eng an den Lebensraum und<br />
den Lebenszyklus ihres Endwirts, <strong>der</strong> Anopheles-Mücke, gebunden, was zum<br />
Beispiel bedeutet, dass das Infektionsrisiko in feuchten Gebieten und während<br />
<strong>der</strong> Regenzeit erhöht ist. Die Erreger <strong>der</strong> Malaria sind Plasmodien.<br />
Humanpathogen sind Plasmodium malariae, Plasmodium knowlesi, Plasmodium<br />
ovale, Plasmodium vivax und Plasmodium falciparum. Der Krankheitsverlauf<br />
kann sich bei Infektionen mit verschiedenen Parasiten unterscheiden,<br />
etwa durch die Zeitintervalle zwischen den wie<strong>der</strong>kehrenden Fieberschüben<br />
o<strong>der</strong> die Schwere <strong>der</strong> Krankheit.<br />
Die sexuelle Vermehrung <strong>der</strong> Plasmodien ndet in <strong>der</strong> Mücke statt. Bei<br />
einem Stich gelangen sie als Sporozoiten in den menschlichen Blutkreislauf<br />
durch den sie innerhalb kurzer Zeit in die Leber gelangen, in <strong>der</strong> sie Leberzellen<br />
befallen. In diesen kommt es zur asexuellen Vermehrung, Merogonie<br />
genannt, bei <strong>der</strong> pro inzierter Leberzelle innerhalb etwa einer Woche bis<br />
zu 30.000 Merozoiten entstehen. Die Leberphase endet mit einer Freisetzung<br />
<strong>der</strong> Merozoiten ins Blut, wo sie rote Blutzellen befallen. In ihnen vermehren<br />
sie sich weiterhin asexuell. Je nach Plasmodienart werden die neu entstandenen<br />
Merozoiten nach verschiedenen Zeitintervallen freigesetzt. Die für alle<br />
Formen <strong>der</strong> Malaria in <strong>der</strong> Regel in Anfällen auftretenden Fieberanfälle sind<br />
mit dieser Erythrozytenruptur assoziiert. Sie werden vermutlich als Reaktion<br />
des Immunsystems auf die Abfallprodukte des Parasitenstowechsels ausgelöst.<br />
Die Parasiten verstowechseln in den Erythrozyten Hämoglobin, aus<br />
welchem das kristalline Malariapigment Hämozoin, welches als eines <strong>der</strong> Ma-<br />
5
lariatoxine gilt, entsteht. Bei <strong>der</strong> Vermehrung innerhalb <strong>der</strong> roten Blutzellen<br />
entstehen unter an<strong>der</strong>em auch zur sexuellen Fortpanzung fähige Plasmodien,<br />
Gametozyten. Durch erneute Mückenstiche können diese weitere Mücken<br />
inzieren, in denen es wie<strong>der</strong> zur sexuellen Fortpanzung kommt.<br />
Abb.1:<br />
Der Lebenszyklus <strong>der</strong> Plasmodien<br />
Eine Infektion mit den Parasiten kann in seltenen Fällen, etwa in Endemiegebieten,<br />
durch klinische Immunität ohne Symptome verlaufen, o<strong>der</strong><br />
aufbauend auf typischen Symptomen wie Kopf- und Glie<strong>der</strong>schmerzen mit<br />
Fieber(anfällen) zu Koma und auch zum Tode führen. Schwerere Verlaufsformen<br />
werden dabei vor allem von Plasmodium falciparum ausgelöst.<br />
In <strong>der</strong> Regel kommt es bei einer Malariainfektion zu einer Vergröÿerung<br />
<strong>der</strong> Milz, einer so genannten Splenomegalie, da dort die Plasmodien aus dem<br />
6
Blut geltert werden und phagozytiert werden. P. falciparum entzieht sich<br />
dem, indem auf <strong>der</strong> Erythrozytenoberäche durch die Einlagerung von parasitären<br />
Proteinen Vorwölbungen entstehen, mit denen die Erythrozyten an<br />
den Endothelzellen <strong>der</strong> Blutgefäÿe haften bleiben können. Dies kann zu einer<br />
schlechteren Durchblutung <strong>der</strong> betreenden Gewebe führen. Zudem kommt<br />
es in dem betroenen Gewebe zu einer stärkeren Entzündungsreaktion, was<br />
etwa bei einer Malariainfektion in <strong>der</strong> Schwangerschaft fatal sein kann, da es<br />
über eine massive Einwan<strong>der</strong>ung von P. falciparum in die Plazenta zu Früho<strong>der</strong><br />
Fehlgeburten kommen kann.<br />
Durch die häugen Fieberanfälle sind die meisten Inzierten dehydriert.<br />
Das, die verschlechterte Durchblutung und die Zerstörung <strong>der</strong> inzierten Erythrozyten<br />
führen zu einer verschlechterten Sauerstoversorgung <strong>der</strong> Gewebe.<br />
Dies wird durch eine verringerte Erythropoese verstärkt, da diese vermutlich<br />
zu Gunsten <strong>der</strong> Leukopoese während <strong>der</strong> Krankheit gedrosselt wird. Die verringerte<br />
Sauerstoversorgung führt zu einer verstärkten Ausschüttung von<br />
Milchsäure. Da die Leber ebenfalls durch die anhaltende allgemeine Entzündungsreaktion<br />
in ihrer Funktion beeinträchtigt ist, kommt es in <strong>der</strong> Regel<br />
so nach kurzer Zeit zu einer Azidose. Der dadurch entstehende metabolische<br />
Stress kann zu weiteren Organschäden führen und spielt unter Umständen<br />
eine Rolle bei <strong>der</strong> cerebralen Malaria und dem dabei auftretenden Koma.<br />
Die genauen Mechanismen, die hinter den verschiedenen Verlaufsformen<br />
<strong>der</strong> Malaria stehen, sind noch nicht geklärt. Die verschiedenen Oberächenproteine<br />
<strong>der</strong> verschiedenen Plasmodien spielen eine wichtige Rolle, da unter<br />
an<strong>der</strong>em etwa P. falciparum durch verschiedene Oberächenproteine mehr<br />
Erythrozyten inzieren kann als P. vivax und, wie bereits erwähnt, sich die<br />
mit P. falciparum inzierten Erythrozyten über bestimmte parasitäre Ober-<br />
ächenproteine an Endothelzellen anlagern können.<br />
Ein weiterer kritischer Punkt des Krankheitsverlaufs ist das überbordende<br />
Immunsystem. Durch den allgemeinen anhaltenden Entzündungszustand<br />
wird <strong>der</strong> Körper teilweise mehr geschädigt, als dass die Reaktion bei <strong>der</strong><br />
7
Bekämpfung <strong>der</strong> Krankheit helfen würde.<br />
Mit Hilfe <strong>der</strong> Forschung kann man vielleicht in Zukunft, beispielsweise<br />
durch die genauere Kenntnis <strong>der</strong> verschieden Oberächenproteine und Infektionswege,<br />
den Beginn <strong>der</strong> Blutphase verhin<strong>der</strong>n o<strong>der</strong> im späteren Krankheitsverlauf<br />
das Immunsystem so regulieren, dass es nicht mehr mehr schädigt<br />
als hilft. [1, 2]<br />
2.2 Zu meinem Projekt<br />
Während des Praktikums habe ich mich mit <strong>der</strong> rekombinanten Expression<br />
verschiedener Proteine in eukaryotischen Zellen (CHOs, chinese hamster<br />
ovary cells) und in Bakterien des Stamms E.coli BL21 pAP lacI beschäftigt.<br />
Die CHOs sollten nach <strong>der</strong> Transfektion, die mittels durchusszytometrischen<br />
Messungen überprüft wurde, das murine Zytokin IL-35 produzieren.<br />
Dessen Funktion sollte in vitro und in vivo genauer charakterisiert werden.<br />
In den Bakterien wurde P.berghei TRAP (thrombospondin-related adhesive<br />
protein) produziert. Dieses ist ein Oberächenprotein <strong>der</strong> Sporozoiten,<br />
dass eine wichtige Rolle bei <strong>der</strong> Infektion <strong>der</strong> Hepatozyten spielt. Es wurde<br />
auf Grund seiner Gröÿe in zwei getrennten Fragmenten, TRAP-F und<br />
TRAP-H, exprimiert und über die bei <strong>der</strong> Klonierung angefügten His-Tags<br />
aufgereinigt.<br />
Das aufgereinigte TRAP sollte in immunologischen Tests als Antigen verwendet<br />
werden, um so die humorale Immunantwort von Mäusen nach einer<br />
P.berghei-Infektion zu untersuchen.<br />
8
3 Materialien und Methoden<br />
3.1 Transfektion und Handhabung <strong>der</strong> CHOs<br />
3.1.1 Kultivierung<br />
Bei <strong>der</strong> Arbeit mit Zellkulturen ist es wichtig Kontaminationen mit Mikroorganismen<br />
zu vermeiden. Deswegen wurde mit sterilen Einmal-Plastikwaren<br />
und zuvor durch Autoklavierung sterilisierten Glaswaren und Lösungen unter<br />
einer Reinluft-Werkbank gearbeitet. Die Zellen wurden in RPMI1640-<br />
Medium kultiviert, welchem 10 % fötales Kälberserum (FCS), 4 mM L-<br />
Glutamin und 50 mg/ml Gentamycin zugesetzt wurden. Die Kultur <strong>der</strong> Zellen<br />
erfolgte bei 37°C im Brutschrank mit einem CO 2 -Gehalt von 5%. Die<br />
Zellen wurden in 6-Loch-Zellkulturplatten in 5 ml Medium pro Vertiefung<br />
kultiviert. Bei ausreichen<strong>der</strong> Besiedlung des Gefäÿes wurden die Zellen mit<br />
Hilfe von Trypsin-EDTA von <strong>der</strong> Platte gelöst und neu ausgesät. Im Rahmen<br />
dieses Arbeitsschrittes wurde 500 ml Trypsin-EDTA auf die Zellen gegeben,<br />
etwa 4 Minuten gewartet bis sich diese vom Untergrund gelöst hatten, das<br />
Trypsin-EDTA daraufhin wie<strong>der</strong> abgenommen und die Zellen verdünnt in<br />
neue Vertiefungen gegeben.<br />
3.1.2 Überprüfung <strong>der</strong> Plasmide<br />
Polymerase-Kettenreaktion Mit Hilfe <strong>der</strong> Polymerase-Kettenreaktion,<br />
kurz PCR, kann man gegebene DNA-Stücke vervielfältigen. Dazu wurde zunächst<br />
ein Mastermix, pro zu vervielfältigen<strong>der</strong> Probe bestehend aus je 2,5µl<br />
Vorwärts- und Rückwärts-Primer, 2,5µl 10x Taq-Puer, 2,5µl MgCl 2 , 2,5µl<br />
dNTP-Lösung, 0,2µl Taq-DNA-Polymerase und 11,3µl H 2 O, angesetzt. Die<br />
eingesetzte DNA-Polymerase stammte aus Thermophilus aquaticus, welche<br />
durch ihre Hitzestabilität für PCRs geeignet ist.<br />
Es wurden nun zwei Reaktionsgefäÿe mit Mastermix und je einmal 1µl <strong>der</strong><br />
Templates angesetzt. Als Templates wurden die Probe des Leerplasmids und<br />
9
die des IL-35-Plasmids verwendet. Zusätzlich wurde in einem Reaktionsgefäÿ<br />
zur Kontrolle auf Kontaminationen mit Fremd-DNA 1µl H 2 O dem Mastermix<br />
hinzugefügt.<br />
Die PCR wurde in einem Thermocycler durchgeführt. Das Programm begann<br />
mit einer 180 Sekunden dauernden initalen Denaturierung bei 95 °C, um<br />
die zunächst als Doppelstränge vorliegenden Plasmide in ihre Einzelstränge<br />
zu trennen.<br />
Danach folgten Zyklen bestehend aus <strong>der</strong> Denaturierung bei 95 °C für 30<br />
Sekunden, gefolgt von dem 60 Sekunden dauernden Annealing, bei dem sich<br />
bei einer Temperatur von 55°C die Primer an die Einzelstränge anlagerten.<br />
Ein Zyklus wurde vollendet durch die Elongation, bei <strong>der</strong> bei 72 °C für 60<br />
Sekunden die Polymerase die dNTPs an die Primer anbaute und somit die<br />
DNA-Stücke duplizierte.<br />
Nach 40 Zyklen folgte ein Zeitraum von 600 Sekunden bei 72 °C, in denen<br />
<strong>der</strong> DNA-Polymerase Zeit gegeben wurde unvollständige Amplikate zu<br />
vervollständigen. Nach diesem Schritt war die PCR abgeschlossen.<br />
Die Proben wurden daraufhin auf ein Agarosegel aufgetragen.<br />
Restriktionsverdau Für den Restriktionsverdau wurden jeweils 2,5µl Puffer<br />
und 1µg Plasmid vermischt. Pro Restriktionsschnittstelle wurden 1µl des<br />
jeweiligen Restriktionsenzyms zugegeben, dem Leerplasmid dementsprechend<br />
1µl Enzym und dem IL-35-Plasmid jeweils 1µl von zwei Enzymen. Diese Gemische<br />
wurden mit Wasser auf 25µl aufgefüllt.<br />
Der Verdau braucht bei 37°C etwa 10 bis 15 Minuten. Danach wurden die<br />
Proben auf ein Agarosegel aufgetragen.<br />
Agarose-Gelelektrophorese Mittels <strong>der</strong> Agarose-Gelelektrophorese kann<br />
man DNA-Moleküle anhand ihrer Gröÿe auftrennen, da diese in einem elektrischen<br />
Feld wan<strong>der</strong>n. Bedingt durch die verschiedenen Gröÿen werden die<br />
Moleküle unterschiedlich stark von dem Agarose-Gel aufgehalten, wan<strong>der</strong>n<br />
aus diesem Grund verschieden schnell und werden dadurch aufgetrennt. Um<br />
10
die Gröÿen <strong>der</strong> verschiedenen DNA-Moleküle nachvollziehen zu können, wurde<br />
<strong>der</strong> DNA-Marker GeneRuler 100 bp Plus DNA Lad<strong>der</strong> von Fermentas<br />
verwendet.<br />
Die Gele wurden mit 1% Agarose gegossen. Zudem wurde Ethidiumbromid<br />
in einer Endkonzentration von 0,2 µl/ml zugesetzt. Ethidiumbromid<br />
interkaliert in die DNA-Moleküle und macht sie so in UV-Licht sichtbar.<br />
Als Puer wurde 1x TBE verwendet. Die Elektrophorese wurde bei 80 V<br />
durchgeführt.<br />
3.1.3 Transfektion<br />
Die zu transzierenden Zellen sollten beim Zeitpunkt <strong>der</strong> Transfektion ungefähr<br />
zu 90 % konuent sein. Zum Transzieren wurde zunächst das alte<br />
Medium abgenommen und durch 4 ml frisches Vollmedium ersetzt. Pro Well<br />
wurden nun 400µl Medium mit 4µg DNA und 4µl TurboFect (Fermentas) für<br />
20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dieses Gemisch wurde langsam<br />
in das Well getropft.<br />
TurboFect unterstützt die Aufnahme <strong>der</strong> DNA, indem es mit <strong>der</strong> DNA<br />
Polymere bildet, die über Endocytose aufgenommen werden und nach dem<br />
Bersten <strong>der</strong> Endosomen in den Zellkern gelangen können.<br />
Die Transfektion wurde in zwei Wells mit dem Leerplasmid durchgeführt,<br />
in zwei mit dem IL-35 enthaltenden Plasmid und ein Well wurde als Negativkontrolle<br />
nur mit Medium und TurboFect behandelt.<br />
Das Ergebnis <strong>der</strong> Transfektion wurde nach jeweils 24 und 48 Stunden<br />
mittels Durchusszytometrie überprüft.<br />
Durchusszytometrie Mittels <strong>der</strong> Durchusszytometrie kann man Zellen<br />
auf verschiedene Eigenschaften hin untersuchen. Dabei werden einzelne Zellen<br />
an einem Laser vorbeigeleitet und durch die Reektion und Streuung des<br />
Lichts auf ihre Eigenschaften geschlossen. Man unterscheidet Forward- und<br />
Sidewards Scatter, entsprechend <strong>der</strong> Streuung des Lichts nach vorne und <strong>der</strong><br />
11
zur Seite. Der Forward Scatter gibt Auskunft über die Gröÿe <strong>der</strong> Zellen, <strong>der</strong><br />
Sidewards Scatter über die Granularität.<br />
Man kann neben Forward und Sidewards Scatter auch Fluoreszenzen messen.<br />
Dazu müssen die Zellen uoreszieren o<strong>der</strong>, etwa über Antikörper, mit<br />
Fluoreszenzfarbstoen verbunden sein. Diese werden durch Laser mit Licht<br />
<strong>der</strong> entsprechenden Wellenlänge angeregt und die entstehende Lichtemission<br />
über Photodetektoren gemessen. So kann man weitere Aussagen über die<br />
Zellen treen.<br />
Auf dem Leerplasmid wurde humanes IgG codiert, auf dem IL-35 wurde<br />
ein Fusionsmolekül aus IgG und IL-35 codiert. Um die Transfektion nachzuweisen,<br />
wurde mittels eines mit einem Fluoreszenzfarbsto-gekoppelten-<br />
Antikörper humanes IgG und somit die jeweils exprimierten Proteine nachgewiesen.<br />
Da diese im Zellplasma vorliegen, mussten die Zellen erst mit Zellpermeabilisierungsagens<br />
behandelt werden. Vor <strong>der</strong> durchusszytometrischen<br />
Untersuchung wurden sie anschlieÿend mit den Nachweisantikörpern inkubiert,<br />
mehrmals mit FACS-Puer gewaschen und mit 1% PFA in PBS xiert.<br />
3.2 Proteinherstellung mittels <strong>der</strong> Bakterien<br />
Die Herstellung des Proteins TRAP mittels E.coli glie<strong>der</strong>te sich in drei verschiedene<br />
Zwischenschritte. Zu Beginn wurden die Bakterien mit den jeweiligen<br />
Plasmiden transformiert, um danach, zur Proteingewinnung, in gröÿere<br />
Kulturen gegeben zu werden, aus denen dann schlieÿlich über mehrere Schritte<br />
das Protein aufgereinigt werden konnte.<br />
3.2.1 Transformation <strong>der</strong> Bakterien<br />
Für die Transformation wurden jeweils 3µl Plasmid (pJC45-TRAP-F bzw.<br />
pJC45-TRAP-H) mit jeweils 50µl kompetenten Bakterien des Stammes E.coli<br />
Bl21 pAP lacI in Reaktionsgefäÿen vermengt. Die Reaktionsgefäÿe wurden<br />
nun für 30 min. auf Eis gestellt, um sie danach für 45 sek. bei 42 °C zu<br />
12
erhitzen. Danach kamen sie wie<strong>der</strong> für 2 Minuten auf Eis. Nach diesem Proze<strong>der</strong>e<br />
wurde jeweils 1 ml warmes LB-Medium zu den Bakterien gegeben und<br />
die Reaktionsgefäÿe für eine Stunde bei 37°C in den Schüttler gegeben. Im<br />
Anschluss daran wurden jeweils 200µl und 800µl <strong>der</strong> Bakterien auf Agar-<br />
Platten, die mit Kanamycin und Ampicilin versetzt waren, ausplattiert. Auf<br />
diesen wuchsen die Bakterien über 2 Tage bei Raumtemperatur.<br />
3.2.2 Proteingewinnung<br />
Nach drei Tagen wurden in zwei Reagenzgläsern jeweils 5 ml LB-Medium mit<br />
einer Konzentration von 50µl/ml Kanamycin und Ampicilin mit je einem<br />
Klon <strong>der</strong> TRAP-F und TRAP-H-Bakterien angeimpft und über Nacht bei<br />
37°C und 200 rpm inkubiert.<br />
Sowohl die TRAP-F- als auch die TRAP-H-Übernachtkultur wurden genutzt<br />
um jeweils zweimal 200 ml LB-Medium mit Kanamycin und Ampicilin<br />
anzuimpfen. Die vier Erlenmeyerkolben mit dem LB-Medium wurden bei<br />
37°C und 200 rpm inkubiert, bis die exponentielle Wachstumsphase erreicht<br />
wurde. Die OD bei 600 nm beträgt dann in etwa 0,5.<br />
Nun wurde durch die Zugabe von IPTG (1mM) die Expression <strong>der</strong> Proteine<br />
induziert. Jeweils eine TRAP-F und eine TRAP-H-Kultur wurden weitere<br />
drei Stunden bei 37°C und 200 rpm inkubiert, die verbleibenden zwei Kulturen<br />
wurden über Nacht bei 18°C und ebenfalls 200 rpm inkubiert.<br />
Anschlieÿend wurden die Bakterien mit 4000 rpm bei 4 °C für 30 Minuten<br />
abzentrifugiert und die Pellets bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C<br />
aufbewahrt.<br />
Vor und nach <strong>der</strong> Induktion <strong>der</strong> Proteinexpression wurden Aliquots abgenommen<br />
und als Pellets bei -20°C gefroren. Die Menge <strong>der</strong> in den Aliquots<br />
bendlichen Bakterien wurde über die Messung <strong>der</strong> OD 600 abgeglichen.<br />
Vor <strong>der</strong> Proteinaufreinigung wurde eine Testlyse von jeweils 10 ml <strong>der</strong> Expressionskulturen<br />
durchgeführt um die Löslichkeit <strong>der</strong> exprimierten Proteine<br />
zu überprüfen. Die Pellets wurden mittels Ultraschall in PBS mit 1% Triton<br />
13
X-100 lysiert. Pellet und Überstand wurden getrennt und von ihnen und den<br />
vor und nach <strong>der</strong> Induktion entnommenen Aliquots wurden Coomassie-Gele<br />
angefertigt.<br />
3.2.3 Proteinaufreinigung<br />
Zur Aufreinigung <strong>der</strong> His-getaggten Proteine wurde das ProBondTM Nickel-<br />
Chelating Resin von Invitrogen genutzt. Die näheren Informationen zu den<br />
Zusammensetzungen <strong>der</strong> Puer und <strong>der</strong> Vorbereitung <strong>der</strong> Säule mit <strong>der</strong> Säulenmatrix<br />
sind in <strong>der</strong> Anleitung des Kits nachlesbar. [1]<br />
Die Aufreinigung wurde unter Hybridbedingungen nach den Angaben des<br />
Herstellers durchgeführt. Um eine bessere Löslichkeit <strong>der</strong> Proteine zu erreichen,<br />
wurden die Lyse und die Bindung an die Säulen <strong>der</strong> Bakterien unter<br />
denaturierenden Bedingungen durchgeführt, die Elution jedoch, um die Proteine<br />
zu schonen, unter nativen.<br />
Von den gesammelten 1 ml groÿen Fraktionen des Eluats wurden jeweils<br />
10µl mit 90µl Coomassie-Lösung vermengt. Dieser so genannte Bradford-Test<br />
dient <strong>der</strong> ungefährem Bestimmung des Proteingehalts.<br />
Die Fraktionen, die Protein enthielten, wurden daraufhin in einem Reaktionsgefäÿ<br />
vereinigt. Nach <strong>der</strong> Aufreinigung wurde das eluierte Protein in<br />
PBS umgepuert. Dies geschah mit <strong>der</strong> Hilfe von zwei PD-10-Säulen (GE<br />
Healthcare) nach dem vom Hersteller bereitgestellten Protokoll. Zur Erhöhung<br />
<strong>der</strong> Proteinkonzentration wurden die Proteineluate in einer Zentrifuge<br />
mit Hilfe von Vivaspin-2-Säulen (sartorius stedim biotech) ultraltriert. Die<br />
erreichte Konzentration wurde über die Messung <strong>der</strong> OD bei 280 nm mittels<br />
des NanoDrop Spectrophotometer (Thermo Scientic) gemessen.<br />
Die Reinheit <strong>der</strong> Proteine wurde im Anschluss daran mit SDS-Polyacrylamid-<br />
Gelektrophorese und Silberfärbung überprüft.<br />
14
4 Ergebnisse<br />
4.1 Ergebnisse <strong>der</strong> Arbeiten mit den CHOs<br />
4.1.1 Überprüfung <strong>der</strong> Plasmide<br />
Abb.2: Agarose-Gel mit dem Ergebnis <strong>der</strong> PCR, ganz links auf dem Gel<br />
<strong>der</strong> Marker, in <strong>der</strong> nächsten Spalte die Probe vom Leerplasmid und ganz<br />
rechts die des Plasmids mit IL-35<br />
15
Abb.3: Agarose-Gel mit dem Ergebnis des Restriktionsverdaus, ganz links<br />
<strong>der</strong> Marker, in <strong>der</strong> mittleren Spalte die Probe des Plasmids mit IL-35 nach<br />
dem Verdau und ganz rechts die Probe des Leerplasmids<br />
4.1.2 Transfektion<br />
Bei den Ergebnissen <strong>der</strong> durchusszytometrischen Untersuchung ist <strong>der</strong> Sidewards<br />
Scatter (SSC-A) jeweils auf <strong>der</strong> y-Achse aufgetragen. In Abbildung<br />
4 ist auf <strong>der</strong> x-Achse <strong>der</strong> Forward Scatter angetragen (FSC-A), bei den darauf<br />
folgenden Abbildungen <strong>der</strong> FL2-Kanal (in <strong>der</strong> Abbildung: FL2-A, weist<br />
Licht mit Wellenlängen zwischen 546 und 602 nm nach). In Abbildung 4<br />
wird mit P1 auf Zellen gegated. P2 markiert die Zellen, die im Kanal FL2 soviel<br />
Fluoreszenz zeigen, dass Bindungen durch den verwendeten Fluoreszenzgekoppelte<br />
Antikörper an den Zellen als nachgewiesen gelten können.<br />
16
Abb.4: Negativkontrolle nach 24 h<br />
Abb.5: Negativkontrolle nach 24 h<br />
17
Abb.6: Mit dem Leerplasmid transzierten Zellen nach 24 h<br />
Abb.7: Mit IL-35-Plasmid transzierte Zellen nach 24 h<br />
18
Abb.8: Mit dem Leerplasmid transzierten Zellen nach 48 h<br />
Abb.9: Mit IL-35-Plasmid transzierten Zellen nach 48 h<br />
19
4.2 Ergebnisse <strong>der</strong> Arbeiten mit den Bakterien<br />
4.2.1 Proteingewinnung<br />
Auf den Gelen ist jeweils ganz links <strong>der</strong> Marker aufgetragen. ZP 1 steht<br />
für das entnommene Aliquot zum Zeitpunkt 1, also vor <strong>der</strong> Induktion <strong>der</strong><br />
Proteinproduktion, ZP 2 für das Aliquot nach <strong>der</strong> Proteinproduktion. Die<br />
Abkürzung T steht für Tagkultur, aus ihr wurden auch Pellet und Überstand<br />
1 (P1, ÜS 1) entnommen. N steht für Nachtkultur, dazu gehören Pellet und<br />
Überstand 2 (P2, ÜS 2).<br />
Abb.10:<br />
SDS-PAGE-Gel <strong>der</strong> TRAP-F-Gewinnung, mit Coomassie gefärbt<br />
20
Abb.11:<br />
SDS-PAGE-Gel <strong>der</strong> TRAP-H-Gewinnung, mit Coomassie gefärbt<br />
Abb.12:<br />
SDS-PAGE-Gel <strong>der</strong> TRAP-H-Gewinnung, mit Coomassie gefärbt<br />
21
4.2.2 Proteinaufreinigung<br />
Abb.13: SDS-PAGE-Gel mit Silberfärbung von <strong>der</strong> TRAP-F-Aufreinigung,<br />
aufgetragen sind das Lysat <strong>der</strong> Bakterien, <strong>der</strong> Durchlauf (DL), drei Waschschritte<br />
(W1, W2, W3), verschiedene Fraktionen des Eluats (E3, E5, E7,<br />
E10, E13), das Eluat (E-P), das aufkonzentrierte Eluat (E-conc.) und <strong>der</strong><br />
Durchlauf <strong>der</strong> Vivaspin-Säule (DL-V.)<br />
22
Abb.14: SDS-PAGE-Gel mit Silberfärbung von TRAP-H-Aufreinigung, aufgetragen<br />
sind das Lysat <strong>der</strong> Bakterien, <strong>der</strong> Durchlauf (DL), drei Waschschritte<br />
(W1, W2, W3), verschiedene Fraktionen des Eluats (E3, E5, E7, E10, E13),<br />
das Eluat (E-P) und das aufkonzentrierte Eluat (E-conc.)<br />
23
4.2.3 Western-Blot zur Identizierung von TRAP-H<br />
Abb.15: Western Blot mit Proben <strong>der</strong> nicht induzierten TRAP-H-Bakterien<br />
(n.ind.Bakterien), den Lysaten <strong>der</strong> TRAP-F und TRAP-H-Bakterien (Lysat<br />
F, Lysat H), dem Durchlauf bei <strong>der</strong> Proteinaufreinigung (DL F, DL H), dem<br />
jeweils fünften Eluat <strong>der</strong> Proteinaufreinigungen (E5 F, E5 H) und den aufkonzentrierten<br />
Eluaten (TRAP F conc. und TRAP H conc.)<br />
Die schwachen Banden bei den Proben von TRAP-F rühren daher, dass<br />
<strong>der</strong> Film beim Entwickeln verrutscht ist.<br />
24
5 Diskussion<br />
5.1 Diskussion <strong>der</strong> Ergebnisse <strong>der</strong> Arbeiten mit den CHOs<br />
5.1.1 Überprüfung <strong>der</strong> Plasmide<br />
Die Banden auf dem Agarose-Gel mit den Ergebnissen <strong>der</strong> PCR lassen vermuten,<br />
dass diese nicht erfolgreich war. Es hätten sowohl für das Leerplasmid<br />
als auch für das Plasmid, auf welches zusätzlich das genetische Material für<br />
IL-35 eingefügt worden ist, jeweils drei Banden sichtbar sein müssen.<br />
Auf dem Agarose-Gel mit den Ergebnissen des Restriktionsverdaus sieht<br />
man deutlich, dass das IL-35-Plasmid in zwei DNA-Stücke gespaltet worden<br />
ist, das Leerplasmid jedoch nicht. Die kleinere, weiter gewan<strong>der</strong>te und somit<br />
leichtere Bande entspricht also <strong>der</strong> DNA für IL-35, die weniger weit gewan<strong>der</strong>te<br />
Bande und somit schwerere dem Leerplasmid. Damit ist bewiesen, dass<br />
sich das Gen für IL-35 tatsächlich noch auf dem Plasmid bendet.<br />
5.1.2 Transfektion<br />
Die Negativkontrolle fungiert als Kontrolle um unspezische Bindungen des<br />
verwendeten Nachweisantikörpers zu an<strong>der</strong>en Strukturen <strong>der</strong> Zellen anzuzeigen.<br />
Bei den transzierten Zellen wurden nur geringfügig mehr Fluoreszenz<br />
nachgewiesen als bei <strong>der</strong> Negativkontrolle und somit auch nicht viel mehr<br />
Bindungen des Antikörpers gemessen. Das bedeutet dass entwe<strong>der</strong> <strong>der</strong> Nachweis<br />
<strong>der</strong> Transfektion o<strong>der</strong> die Transfektion nicht erfolgreich war.<br />
Die niedrige Transfektionsrate kann verschiedene Ursachen habe. Es können<br />
beispielsweise Fehler bei <strong>der</strong> Durchführung <strong>der</strong> Transfektion aufgetreten<br />
sein o<strong>der</strong> das Transfektionsmedium könnte nicht mehr funktioniert haben.<br />
Die Zellen können auch aus verschiedenen Gründen nicht ausreichend kompetent<br />
gewesen sein für eine Transfektion.<br />
25
5.2 Diskussion <strong>der</strong> Ergebnisse <strong>der</strong> Arbeiten mit den Bakterien<br />
Auf dem mit Coomassie gefärbten SDS-PAGE-Gel, auf welches die Aliquots,<br />
die vor und nach <strong>der</strong> Induzierung <strong>der</strong> Proteinproduktion in den TRAP-F-<br />
Bakterien genommen worden sind, und die Proben des Probelysats aufgetragen<br />
worden sind, ist deutlich die Produktion von TRAP-F nachvollziehbar,<br />
da auf Höhe von 25 kDa sowohl in den Aliquots <strong>der</strong> Tag- und <strong>der</strong> Nachtkultur<br />
und <strong>der</strong> Probe des Pellets des Probelysats eine deutliche Zunahme <strong>der</strong><br />
Bande sichtbar ist.<br />
Während <strong>der</strong> Aufreinigung scheint TRAP-F jedoch verloren gegangen zu<br />
sein, da auf dem nach <strong>der</strong> Aufreinigung hergestellten SDS-PAGE-Gel keine<br />
Banden auf 25 kDa-Höhe zu entdecken sind. Der Verlust kann mit <strong>der</strong> schweren<br />
Löslichkeit des Proteins zusammenhängen, so dass es bei <strong>der</strong> Lyse <strong>der</strong><br />
Bakterien nicht freigesetzt worden ist. Es wäre interessant zu wissen, welches<br />
Protein stattdessen aufgereinigt worden ist, da im konzentrierten Eluat auf<br />
Höhe von 70 kDa eine deutliche Bande sichtbar ist.<br />
Auf dem SDS-PAGE-Gel mit den Aliquots, die vor und nach <strong>der</strong> Induzierung<br />
<strong>der</strong> Proteinproduktion in den TRAP-H-Bakterien genommen wurden,<br />
ist nur auf dem zweiten angefertigten Gel im Pellet <strong>der</strong> Übernachtkultur die<br />
70 kDa schwere Bande, im Verhältnis zu den an<strong>der</strong>en Banden, dicker geworden.<br />
Dies lässt darauf schlieÿen, dass entwe<strong>der</strong> kein TRAP-H hergestellt<br />
wurde o<strong>der</strong> dieses im Verhältnis zu dem ansonsten in den Bakterienzellen<br />
vorhandenen Protein nicht viel ausmacht.<br />
Da auf dem nach <strong>der</strong> Proteinaufreinigung hergestellten SDS-PAGE-Gel<br />
in <strong>der</strong> Probe des konzentrierten Eluats eine deutliche Bande in Höhe von 70<br />
kDa sichtbar ist, könnte man davon ausgehen, dass es sich dabei um TRAP-H<br />
handelt. Da sich allerdings auch auf dem nach <strong>der</strong> Aufreinigung von TRAP-F<br />
hergestellten SDS-PAGE-Gel eine Bande in Höhe von 70 kDa bendet und<br />
diese mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht von TRAP-H stammt, wäre auch<br />
an <strong>der</strong> Identität des aufgereinigten TRAP-H zu zweifeln.<br />
26
Gewissheit darüber konnte ein nach meiner Abreise angefertigter Western<br />
Blot geben. Es wurde TRAP-spezisches Mausserum eingesetzt, welches nur<br />
TRAP-H nachweist. Man sieht, dass TRAP-H bereits vor <strong>der</strong> Induzierung<br />
<strong>der</strong> Proteingewinnung in den Bakterien zu nden ist und dass das aufkonzentrierte<br />
Protein TRAP-H ist. Es bleibt unklar welches Protein an Stelle<br />
von TRAP-F aufgereinigt wurde.<br />
27
6 Fazit<br />
Durch mein Praktikum habe ich weitere Einblicke in die Arbeit im Labor<br />
und an einem Institut erhalten. Mein Bild eines durchaus interessanten und<br />
abwechslungsreichen Berufs hat sich dadurch bestätigt. Beson<strong>der</strong>s gefällt mir<br />
an <strong>der</strong> Arbeit, dass es sich nicht um einen reinen Schreibtischjob handelt<br />
und man vielfältige Tätigkeiten auszuführen hat, wie etwa Recherche zum<br />
jeweiligen Thema, die Arbeit im Labor und die Verarbeitung <strong>der</strong> Ergebnisse.<br />
Zudem wurde mir die Problematik <strong>der</strong> Verwendung von Mäusen und an<strong>der</strong>en<br />
Tieren als Modellorganismen bewusster, da sie zwar für viele Experimente<br />
unverzichtbar sind, aber man dennoch nicht vergessen darf dass es sich um<br />
zu respektierende Lebewesen handelt.<br />
In <strong>der</strong> Arbeitsgruppe wurde ich sehr freundlich aufgenommen und habe<br />
am Anfang vor allem den An<strong>der</strong>en über die Schulter geschaut, nach kurzer<br />
Zeit habe ich aber unter <strong>der</strong> Betreuung von Dr. Susanne Tartz und Marthe<br />
Janÿen mit den oben näher beschriebenen Arbeiten mit den CHOs und den<br />
Bakterien begonnen. Während ich mit den CHOs und den Bakterien gearbeitet<br />
habe, wurden mir auch weiterhin allgemeine Arbeitstechniken vorgestellt,<br />
die sonst noch in <strong>der</strong> Gruppe verwendet werden, wie etwa die Herstellung von<br />
Gewebsschnitten mit dem Kryostat und ich konnte je<strong>der</strong>zeit überall Fragen<br />
stellen, die mir immer mit sehr viel Mühe und Geduld erklärt wurden.<br />
Mein Dank geht an PD Dr. Thomas Jacobs für die Organisation des<br />
Praktikums und die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe, sowie an die gesamte<br />
Arbeitsgruppe, speziell Dr. Susanne Tartz und Marthe Janÿen, die sich die<br />
meiste Zeit um mich gekümmert haben. Weiterhin geht mein Dank an den<br />
För<strong>der</strong>verein <strong>der</strong> Bioolympiade e.V. für die Finanzierung und Organisation<br />
des Praktikums und speziell an Dennis Kappei, <strong>der</strong> von Seiten des Vereins<br />
mein Praktikum und mich betreut hat.<br />
28
Literatur<br />
[1] Löscher, T.; Burchard, G.-D. (Hrsg.), Tropenmedizin in Klinik und Praxis,<br />
Stuttgart, New York: Georg Thieme Verlag 2010 4 .<br />
[2] Wenk, P.; Renz, A., Parasitologie. Biologie <strong>der</strong> Humanparasiten, Stuttgart,<br />
New York: Georg Thieme Verlag 2003 6 .<br />
[3] Anleitung zur verwendeten Proteinaufreingungssäule:<br />
tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/xprpur_man.pdf, letzter<br />
Zugri am 9.9.2010<br />
29